Diseño de sistemas de fermentación en estado sólido para la producción de enzimas extracelulares hidrolíticas poliméricas por hongos filamentosos

Resumen

Este protocolo utiliza salvado de trigo en un sistema rotativo de fermentación de estado sólido para mejorar la producción de enzimas. El sustrato, complementado con inductores como la quitina, favorece el crecimiento de hongos en condiciones controladas. Los resultados demuestran que los rendimientos enzimáticos son de 4 a 6 veces mayores en comparación con la fermentación sumergida, lo que demuestra la adaptabilidad y eficacia del método para diversas aplicaciones biotecnológicas.

Resumen

La fermentación en estado sólido (SSF) es un proceso de bioconversión que utiliza un sustrato sólido que no se disuelve en un medio acuoso. Los microorganismos crecen en la superficie del sustrato y penetran en su matriz sólida para extraer nutrientes esenciales para su desarrollo. SSF se caracteriza por un mínimo de agua libre, con un contenido de humedad del sustrato mantenido por encima del 70%, e involucra tres fases interconectadas: gaseosa, líquida y sólida. Este protocolo describe el uso de salvado de trigo, un subproducto agroindustrial, como sustrato base para la producción de enzimas en un sistema rotativo. El sustrato se complementa con un inductor, como quitina, quitosano, almidón o celulosa, para promover la síntesis de proteínas hidrolíticas. El sistema es altamente adaptable, lo que permite el uso de diferentes formas de hongos, incluidos micelio, esporas o gránulos. En la metodología descrita, el inductor y el sustrato se mezclan en una proporción de 1:100 (p/p), se esterilizan en autoclave y se ajustan al nivel de humedad deseado con agua estéril. A continuación, se añade el inóculo fúngico y el sistema rotativo funciona a 10 rpm para garantizar una mezcla y oxigenación adecuadas. El sistema se incuba durante 6-8 días en condiciones óptimas de crecimiento para hongos mesófilos o termófilos/termotolerantes, lo que mejora su versatilidad. Después de la incubación, la enzima se extrae fácilmente utilizando un tampón frío apropiado (por ejemplo, acetato, citrato o fosfato), según el tipo de enzima. El extracto se clarifica mediante centrifugación y filtración para obtener un sobrenadante libre de células. Luego, la enzima se puede concentrar o purificar aún más según sea necesario. Los resultados demostraron un aumento de 4 a 6 veces en la actividad enzimática en comparación con la fermentación sumergida (SmF), lo que pone de manifiesto la eficacia del sistema. Su adaptabilidad a diferentes sustratos, inductores y especies fúngicas lo convierte en una herramienta valiosa para diversas aplicaciones biotecnológicas.

Introducción

La fermentación en estado sólido (SSF) se ha convertido en una tecnología de bioconversión prometedora y sostenible para producir enzimas de alto valor, compuestos bioactivos y metabolitos secundarios. Esta técnica implica el crecimiento de microorganismos sobre sustratos sólidos con un mínimo de agua libre, simulando su entorno natural y permitiendo una actividad metabólica eficiente¹. El objetivo principal de este protocolo es optimizar la producción de enzimas a través de un sistema SSF rotativo que garantiza una mejor utilización del sustrato, difusión de oxígeno y escalabilidad del proceso. El empleo de salvado de trigo, un subproducto agroindustrial abundante, como sustrato base, contribuye a la valorización de los residuos agrícolas y promueve prácticas de bioeconomía circular².

La SSF tiene ventajas significativas sobre la fermentación sumergida (SmF), incluido un menor consumo de energía y agua, una mayor concentración de producto y compatibilidad con una amplia gama de residuos agrícolas económicos como el salvado de trigo, la cáscara de arroz y el bagazo de caña de azúcar³. A diferencia del SmF, que requiere grandes volúmenes de agua y costosos medios nutritivos, los sistemas SSF aprovechan matrices sólidas que no solo sirven como superficies de crecimiento microbiano, sino que también proporcionan nutrientes esenciales para la actividad microbiana. Además, el agua libre limitada en SSF minimiza los riesgos de contaminación, lo que la convierte en una opción más robusta para la producción de enzimas en entornos industriales⁴. Además de sus ventajas operativas, la SSF presenta importantes beneficios medioambientales y económicos en comparación con la fermentación sumergida (SmF). Los estudios han informado que SSF reduce el consumo de agua entre un 50% y un 70% y reduce los costos de energía en más del 30% debido a la ausencia de grandes volúmenes de agua que requieren agitación y aireación constantes. Además, el uso de residuos agroindustriales como sustratos minimiza los costos de las materias primas y promueve prácticas de economía circular al reutilizar los subproductos agrícolas ^2,4.

SSF ha sido ampliamente validado por su eficiencia y escalabilidad. Por ejemplo, los estudios han reportado un aumento de 4-6 veces en la actividad enzimática utilizando SSF en comparación con SmF, destacando las ventajas económicas y ambientales de esta técnica ^2,5. Además, el proceso posterior se simplifica, ya que la extracción de enzimas suele requerir menos agua y menos pasos de purificación. Esto hace que SSF sea particularmente atractivo para las industrias que buscan reducir los costos operativos y el impacto ambiental⁶.

El sistema SSF rotativo descrito en este protocolo ofrece varias mejoras con respecto a los métodos SSF estáticos tradicionales. Si bien los sistemas estáticos a menudo enfrentan desafíos como la colonización desigual del sustrato y la limitación de oxígeno, la configuración rotativa garantiza una mezcla y aireación completas, promoviendo un crecimiento microbiano uniforme ^7,8,9. Por ejemplo, este sistema se ha empleado con éxito para producir enzimas hidrolíticas como quitinasas, amilasas y proteasas utilizando especies fúngicas como Aspergillus y Trichoderma².

Una característica clave de este sistema SSF es su adaptabilidad. El uso de salvado de trigo como sustrato base demuestra el potencial de los residuos agroindustriales para una bioconversión rentable³. Además, la suplementación del sustrato con inductores como la quitina, el quitosano y el almidón mejora aún más la síntesis de enzimas al estimular vías metabólicas específicas ^2,10. El sistema también es compatible con diferentes formas de hongos, incluidas esporas, micelio y gránulos, lo que permite a los usuarios adaptar el proceso a^{sus requisitos específicos}.

La SSF ofrece un amplio potencial de aplicación en diversos campos, como la biotecnología alimentaria, la producción de biocombustibles y la remediación ambiental¹¹. Su integración de sustratos rentables, rendimientos enzimáticos excepcionales y alta flexibilidad de proceso establece a SSF como un enfoque esencial para las innovaciones biotecnológicas a escala industrial.

Protocolo

Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación del sustrato

NOTA: Utilice una marca comercial de salvado de trigo para minimizar las variaciones significativas en las características del sustrato. Cada lote de salvado de trigo varía debido a múltiples factores, lo que lo convierte en un material heterogéneo y difícil de estandarizar, lo que provoca fluctuaciones en su contenido constituyente. Si se requiere un material estandarizado, elija una matriz alternativa o realice un análisis químico próximo de cada lote de salvado de trigo para ajustarlo de acuerdo con las necesidades.

1. Lave el salvado de trigo tres veces con agua destilada estéril para eliminar los residuos de materia orgánica, los desechos y el polvo. Esto también elimina los azúcares simples que podrían interferir con la fermentación.
2. Extienda el salvado lavado en una bandeja de aluminio y séquelo en un horno a 60 °C durante 24 h.
3. Una vez seco, coloque el salvado de trigo en un tubo cónico estéril de 50 mL.

2. Preparación del inóculo

NOTA: Este protocolo describe tres métodos para la preparación del inóculo: suspensión de esporas, inoculación directa con discos de micelio y suspensión celular. Establezca la concentración inicial de inóculo y cuantifique los niveles de proteínas para obtener cálculos precisos del rendimiento.

1. Preparación de la suspensión de esporas
   1. Transfiera un disco de agar de 5 mm de diámetro saturado con micelio a una placa de agar dextrosa de papa fresca. Incubar la placa a 28 °C durante 5-7 días, o hasta que el micelio sature el medio. Algunos hongos pueden requerir un tiempo de incubación más largo.
   2. Agregue 5 mL de agua destilada estéril a la placa y separe mecánicamente las esporas usando un asa estéril.
   3. Prepare una dilución 1:100 de la suspensión de esporas. Coloque 10 μL en el centro de una cámara de Neubauer y cuente las esporas bajo un microscopio. Calcule la concentración de esporas (esporas/mL) en función del factor y la dilución de la cámara.
2. Cultivo de micelio en medio líquido
   1. Transfiera un disco de agar de 5 mm saturado con micelio a una placa de agar patata-dextrosa fresca e incube a 28 °C hasta la saturación.
   2. Preparar 25 mL de caldo de patata y dextrosa en un matraz estéril de 125 mL y autoclave.
   3. Transfiera un disco de micelio de 5 mm de la placa saturada al caldo estéril.
   4. Incubar el matraz en un agitador a 125 rpm durante 24-48 h, dependiendo de la cepa fúngica. Prolongar el tiempo de incubación de los hongos de crecimiento lento.
   5. Recoja 2 mL para el inóculo y 2 mL para la determinación del peso seco.
3. Inoculación directa de discos de micelio
   1. Coloque un disco de agar de 5 mm saturado con micelio en un plato de patata-dextrosa-agar fresco. Incubar a 28 °C hasta la saturación.
   2. Utilice un disco de micelio como inóculo y otro para determinar el peso seco.

3. Preparación del sistema SSF

NOTA: Los inductores pueden ser naturales o comerciales. Se prefieren los inductores comerciales purificados para minimizar las impurezas que podrían alterar la eficiencia de la fermentación. Ajuste las adiciones de agua para mantener una humedad relativa de al menos el 90%.

1. Combine los siguientes componentes en un tubo cónico estéril de 50 mL: 5 g de salvado de trigo seco; 0,2 g del inductor (por ejemplo, quitina comercial); 5,5 mL de agua (ajustar en función de la capacidad de absorción de agua del inductor); 5 mL de una solución salina estéril que contiene 16 g/L de fosfato de potasio monobásico, 4 g/L de sulfato de sodio, 2 g/L de cloruro de potasio, 1 g/L de cloruro de calcio, 400 mg/L de cloruro de zinc, 60 mg/L de ácido bórico, 40 mg/L de molibdato de sodio, 150 mg/L de cloruro de magnesio, 100 mg/L de cloruro férrico y 400 mg/L de sulfato de cobre.
2. Mida la humedad relativa con un higrómetro basado en electrodos, asegurando un mínimo de 90% de humedad. Inserte la sonda del electrodo directamente en el reactor a diferentes profundidades para obtener una medición representativa de la distribución de la humedad.
   1. Siga los pasos para ajustar la humedad si está por debajo del 90%:
      1. Añadir gradualmente agua destilada estéril en incrementos de 1 mL por cada 10 g de sustrato. Después de cada adición, mezcle bien para asegurar una distribución uniforme de la humedad.
      2. Deje que el sustrato se equilibre durante 10-15 min. Vuelva a medir el nivel de humedad.
      3. Repita los pasos anteriores hasta alcanzar la humedad objetivo del 90%. Evite humedecer demasiado el sustrato durante todo el proceso.
   2. Siga los pasos para ajustar la humedad si está por encima del 90%:
      1. Extienda el sustrato finamente en un ambiente estéril. Elimine el exceso de humedad (1) exponiendo el sustrato al flujo de aire laminar o (2) colocándolo en una cámara de secado a 30 °C durante 10-15 min.
      2. Alternativamente, mezcle suavemente el sustrato para promover una redistribución uniforme de la humedad. Después del tratamiento, vuelva a evaluar el nivel de humedad.
      3. Repita el paso de secado o mezcla según sea necesario hasta que la humedad alcance el 90%. Proceda con la fermentación solo una vez que se alcance la humedad objetivo.
3. Autoclave el tubo a 15 psi durante 15 min.
4. Después de enfriar, inocule el sustrato con uno de los siguientes: 1 mL de suspensión de esporas (1 x 10^6-1 x 10⁷ esporas/mL), 2 mL de suspensión celular o un disco de micelio de 5 mm.

4. Procedimiento de fermentación en estado sólido (SSF)

NOTA: Para estudios cinéticos o evaluaciones de parámetros en diferentes momentos, prepare tubos separados para cada punto de tiempo para garantizar la representatividad.

1. Evite la aglomeración del sustrato mediante el vórtice de los tubos a máxima velocidad durante 5 minutos en ciclos de 1 minuto.
2. Coloque los tubos en un mezclador giratorio con un eje horizontal. Asegúrese de que el sustrato se mueva libremente dentro de los tubos. Configure el mezclador para que funcione a 10 rpm.
3. Incubar el mezclador en una incubadora a la temperatura óptima de crecimiento del microorganismo. Mantenga la temperatura informada para una actividad enzimática óptima cuando utilice inductores sensibles al calor.

5. Extracción de enzimas

NOTA: Los fundamentos de la extracción se basan en la solubilidad y la actividad máxima del pH de la enzima extracelular. Como SSF evita el medio acuoso, la enzima extracelular está involucrada en el agua que rodea la matriz sólida, lo que significa que la concentración es mayor que en SmF. En este contexto, la selección del mejor tampón de extracción depende del conocimiento de la actividad deseada. La optimización de las extracciones depende de la concentración final de la enzima y del tipo de tampón de extracción utilizado.

1. Después del período de fermentación deseado, vuelva a suspender el sustrato en 20 mL de tampón preenfriado. Algunos ejemplos son: tampón de acetato 0,1 M, pH 5,6, para la extracción con quitinasa; Tampón de fosfato 0,02 M, pH 6,9, para la extracción de amilasa.
2. Vórtice los tubos en ciclos: 1 min a velocidad máxima, seguido de 1 min en hielo. Repite 10 veces.
3. Filtrar la suspensión mediante filtros de papel y extraer mecánicamente el sobrenadante mediante prensado.
4. Clarificar el sobrenadante centrifugando a 3000 x g durante 15 min a 4 °C.
5. Utilice el extracto crudo directamente o purifique aún más la enzima mediante cromatografía en columna o filtros centrífugos. También se recomiendan estudios cinéticos para determinar la constante de Michaelis (Km) y la tasa máxima de transformación enzimática (Vmax)¹².

6. Proceso de optimización

NOTA: Optimice este protocolo evaluando y ajustando la calidad y concentración de los inductores, así como el tipo y la concentración del inóculo.

1. Determine el tiempo de fermentación ideal y perfeccione los pasos de extracción para mejorar la eficiencia.
2. Controle y ajuste las condiciones ambientales, incluida la temperatura, el pH y la aireación.
3. Pruebe varios tampones y condiciones de extracción para mejorar el rendimiento y la estabilidad de las enzimas.
4. Realizar análisis estadísticos, como la metodología de superficie de respuesta, para identificar las variables más influyentes y lograr una producción óptima de enzimas.

Resultados

En la Figura 1A se presenta la representación esquemática del mezclador rotativo utilizado en este sistema, que tiene una capacidad para seis tubos cónicos de 50 mL. La Figura 2B ilustra los cambios que ocurren en el salvado de trigo durante el acondicionamiento antes de ingresar al proceso de fermentación en estado sólido. Como se ha observado, no se observaron cambios estructurales significativos.

En la Figura 2 se muestra la saturación de salvado de trigo después de 6 días de fermentación en estado sólido para la producción de quitinasa por el hongo Trichoderma harzianum en este sistema, utilizando quitina comercial como inductor. La figura 2A muestra el material original antes del proceso de fermentación. Las micrografías confirman la utilización del sustrato por parte del hongo, lo que también se refleja en las modificaciones que sufre, perdiendo su estructura fractal debido a la interacción con el hongo.

Los resultados de la Figura 3 muestran un aumento significativo en la actividad de la quitinasa (Figura 3A) y la actividad de la amilasa (Figura 3B) obtenidas de T. harzianum y Aspergillus lentulus, respectivamente, al comparar los sistemas de fermentación en estado sólido (SSF) y fermentación sumergida (SmF). Los datos se validaron mediante ANOVA de una vía y prueba de Tukey con p < 0,05 utilizando el software SigmaPlot. En este contexto, se observa que este sistema es aplicable a diferentes actividades enzimáticas y hongos. A. lentulus se caracterizó como un hongo termotolerante, incubado a 40 °C, mostrando un aumento significativo en su actividad amilasa. Los resultados de la actividad quitinasa de T. harzianum tanto en fermentación líquida como sólida han sido reportados previamente por separado por nuestro grupo de investigación ^2,5, confirmando y comparando este trabajo un aumento significativo de SSF en comparación con SmF, similar a la actividad de la amilasa. Nuestro grupo ha trabajado con más de 50 cepas fúngicas para la producción de proteasas y amilasas en condiciones mesófilas y termófilas, y los resultados son consistentes.

Los resultados confirman el éxito del protocolo al demostrar aumentos significativos en la actividad enzimática, con la fermentación en estado sólido produciendo mayores rendimientos en comparación con la fermentación sumergida. Esto indica la eficacia de la SSF para mejorar la producción de quitinasa y amilasa. Las cifras publicadas anteriormente se han reutilizado con el permiso de reimpresión adecuado.

Figura 1: Descripción general del sistema rotativo de fermentación de estado sólido (SSF) y del proceso de pretratamiento del salvado de trigo. (A) Representación esquemática del sistema rotativo SSF. (B) Modificaciones en el proceso de pretratamiento del salvado de trigo: (I) Materia prima inicial, (II) Salvado de trigo húmedo después de la etapa de lavado, (III) Salvado de trigo seco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Saturación del sustrato por Trichoderma harzianum. (A) Sustrato antes de SSF. (B,C) Sustrato saturado con micelio fúngico a diferentes aumentos. Barras de escala: (A), 50 μm; (B), 200 μm; (C), 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Actividad enzimática en SSF y fermentación sumergida (SmF) por T. harzianum y A. lentulus. Comparación de (A) la formación de glucosamina a través de la hidrólisis del quitosano por enzimas producidas por Trichoderma harzianum en SSF y SmF, y (B) la actividad de la amilasa de Aspergillus lentulus obtenida en SSF y SmF. Las barras de error representan la desviación estándar de tres repeticiones. Los asteriscos (*) indican una diferencia estadísticamente significativa entre los datos. Tenga en cuenta que la variación estadística es específica para cada tipo de enzima y no se aplica a las comparaciones entre (A) y (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Este estudio describe un protocolo relevante para optimizar la producción de enzimas a través de sistemas de fermentación en estado sólido (SSF), diseñados específicamente para hongos filamentosos. A continuación, se discuten los aspectos críticos de la metodología, junto con su importancia, limitaciones y posibles aplicaciones.

El éxito del protocolo depende en gran medida de pasos clave como la preparación del sustrato y el inóculo. El lavado y el secado adecuados del salvado de trigo son esenciales para eliminar las impurezas que pueden interferir con el crecimiento de hongos o la producción de enzimas. Además, el ajuste cuidadoso de la humedad del sustrato para mantener la humedad relativa por encima del 90% garantiza una colonización y actividad fúngica óptimas¹³. El funcionamiento del sistema rotativo a 10 rpm es otro parámetro crucial, ya que promueve una mezcla y oxigenación uniformes, evitando la aglomeración del sustrato y asegurando un crecimiento uniforme de los hongos¹⁴.

La adaptabilidad de este protocolo radica en su compatibilidad con diversas especies de hongos e inductores. Por ejemplo, mientras que en este estudio se utilizaron quitina y almidón comerciales como inductores, otros sustratos, como la lignina, la celulosa o el quitosano, podrían sustituirse en función de la enzima objetivo. La resolución de problemas comunes, como la colonización desigual del sustrato, implica refinar los parámetros de mezcla o ajustar la concentración de inóculo². Además, garantizar la esterilidad durante la preparación e inoculación del sustrato es fundamental para prevenir la contaminación, especialmente en aplicaciones a escala industrial¹⁵.

Si bien la SSF ofrece varias ventajas sobre la fermentación sumergida (SmF), no está exenta de limitaciones¹⁶. Un desafío importante es ampliar el sistema rotativo de SSF sin comprometer la mezcla de sustratos, la difusión de oxígeno o la determinación precisa de la biomasa, otro problema común en SSF^17,18. Además, la dependencia del protocolo de residuos agroindustriales como el salvado de trigo puede introducir variabilidad en los resultados debido a las diferencias en la composición del sustrato entre lotes. Estas limitaciones ponen de manifiesto la necesidad de una mayor optimización en la transición a la producción a gran escala^19,20.

El sistema SSF rotativo descrito demuestra ventajas significativas sobre los métodos estáticos tradicionales SSF y SmF. En comparación con la SSF estática, el sistema rotativo garantiza un crecimiento microbiano más uniforme, lo que reduce los problemas relacionados con las limitaciones de oxígeno. Además, la adaptabilidad del sistema permite su aplicación a diversas formas de hongos y tipos de enzimas, lo que lo hace muy versátil¹⁸. Los sistemas SSF pueden tener varias configuraciones para mejorar la productividad de los metabolitos. Cada tipo de sistema tiene ventajas y desventajas que deben ser analizadas en profundidad para determinar la mejor configuración. El sistema SSF rotativo ofrece varias ventajas sobre los tradicionales SSF y SmF estáticos; sin embargo, enfrenta desafíos en comparación con otros sistemas SSF, como los biorreactores de bandeja y de lecho empacado. Los biorreactores de bandeja, comúnmente utilizados para SSF a gran escala, ofrecen simplicidad y bajo consumo de energía, pero enfrentan desafíos relacionados con la transferencia limitada de oxígeno y la distribución de humedad, lo que conduce a un crecimiento microbiano desigual y rendimientos enzimáticos reducidos. Los biorreactores de lecho empacado, por otro lado, mejoran la aireación a través del flujo de aire forzado, pero pueden encontrar problemas con caídas de presión y distribución desigual de la temperatura, particularmente en columnas altas. Por el contrario, el sistema rotativo SSF promueve la mezcla continua y las condiciones homogéneas, reduciendo las zonas anaeróbicas y mejorando la productividad de las enzimas. No obstante, el consumo de energía y el desgaste mecánico debido a la rotación continua pueden aumentar los costos operativos²¹.

Los sistemas estáticos de fermentación de estado sólido, como los biorreactores de bandeja, están limitados por la limitada transferencia de calor y masa, lo que a menudo conduce a gradientes de temperatura internos de más de 30 °C, lo que resulta en un rendimiento microbiano subóptimo. Estos sistemas suelen funcionar a pequeños volúmenes (0,15-0,25 m³) y sufren de colonización microbiana heterogénea, con estudios que indican que sólo alrededor del 34% de los poros del sustrato se utilizan eficazmente. Por el contrario, los biorreactores rotativos ofrecen una agitación mecánica que mejora la distribución del oxígeno y la homogeneidad del sustrato, al tiempo que soportan mayores volúmenes operativos de hasta 13 m³ y cargas de sustrato que alcanzan el 40% (p/v). Un ejemplo notable es el de la producción de celulasa por Thermoascus aurantiacus, donde un reactor rotativo de SSF mantenido a 49 °C y ventilado a 5 L/min·kg produjo 14.098 UI/g de actividad enzimática, más de tres veces superior a las 4.212 UI/g obtenidas en condiciones estáticas²².

El aumento de la fermentación en estado sólido requiere un delicado equilibrio entre el mantenimiento de la cinética microbiana y la garantía de una transferencia eficaz de masa y calor en sistemas cada vez más grandes. El enfoque escalonado tradicional incluye etapas de laboratorio (5-20 kg), piloto (50-5.000 kg) e industrial (25-1.000 toneladas). Uno de los principales desafíos durante el escalado es la disipación del calor metabólico, que puede alcanzar hasta 3.200 kcal/kg de material seco, lo que es particularmente problemático en sistemas estáticos o mal ventilados. Para abordar esto, las estrategias de escalado a menudo se basan en el control de los parámetros de diseño adimensionales y la aplicación de enfoques de modelado matemático, incluidas las ecuaciones de balance de masa y energía, para preservar variables clave como la disponibilidad de oxígeno y la retención de humedad del sustrato en diferentes escalas. Los sistemas a escala piloto (por ejemplo, 150 L y 6 m³) han incorporado con éxito características de ingeniería como camisas de agua, cuchillas de agitación curvas y humedad controlada para mejorar la reproducibilidad del proceso y garantizar rendimientos constantes del producto 18,21,22.

El protocolo presentó una eficacia demostrada para la producción de enzimas a pequeña escala de laboratorio. Sin embargo, la ampliación del proceso para aplicaciones industriales plantea importantes desafíos, principalmente relacionados con el mantenimiento de una mezcla y aireación eficientes en grandes volúmenes. Un enfoque prometedor para abordar estas limitaciones es el uso de un reactor de tornillo continuo, que imita la función de un mezclador vertical al promover la mezcla continua y una mejor oxigenación en todo el sustrato sólido. Este diseño reduce la formación de zonas anaeróbicas y mejora la transferencia de masa, que son factores críticos para el éxito de la fermentación en estado sólido a escala industrial ^2,15. Sin embargo, los desafíos potenciales incluyen mantener la integridad estructural de la matriz sólida y evitar la formación de gradientes de temperatura a lo largo del reactor. Los estudios posteriores deben centrarse en la optimización de los parámetros operativos y la validación de los rendimientos de las enzimas en condiciones de aumento para garantizar la viabilidad y la eficiencia del proceso.

Las aplicaciones potenciales de este protocolo se extienden a múltiples sectores, incluida la biotecnología alimentaria, la bioenergía y la remediación ambiental. Por ejemplo, la producción mejorada de enzimas hidrolíticas como las quitinasas y las amilasas puede apoyar los procesos de bioconversión en la agricultura y la industria. Además, el uso de subproductos agroindustriales como el salvado de trigo se alinea con prácticas sostenibles, promoviendo la valorización de residuos y contribuyendo a una bioeconomía circular²⁰.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
125 mL Erlenmeyer flask	Sigma-Aldrich	CLS431684	For culturing mycelium in liquid medium.
50 mL conical tube	Sigma-Aldrich	CLS430921	For storing and preparing substrates and inoculum.
Acetate buffer, pH 5.6	Sigma-Aldrich	320866	For chitinase extraction.
Centricon filters	Millipore	UFC905024	For further purification of enzymes.
Counting cells chamber	Sigma-Aldrich	Z359629	Used to count spores under a microscope.
Filter paper	Whatman	1001-110	For filtering the enzyme extract.
Hygrometer	Todomicro	-	To measure relative humidity of the substrate.
Inducer (e.g., commercial chitin)	Sigma-Aldrich	C9752	Used to enhance enzyme production during fermentation.
Phosphate buffer, pH 6.9	Sigma-Aldrich	P5379	For amylase extraction.
Potato-dextrose agar	Sigma-Aldrich	P2182	Culture medium for growing fungal mycelium.
Potato-dextrose broth	Sigma-Aldrich	P6685	Liquid culture medium for growing fungal mycelium.
Rotary mixer	Thermo-Fisher Scientific	88-861-051	To keep substrate moving during fermentation.
Salt solution components (e.g., KH2PO4, Na2SO4, KCl, etc.)	Sigma-Aldrich	Multiple	For preparing sterile salt solution, see detailed recipe in the protocol.
Wheat bran	Comercial market	-	Substrate for solid-state fermentation.