DP는 약물 남용에있는 국립 연구소에서 루스 Kirschstein 수상 1F32 - 01A1 DA021977의받는 사람입니다. 이 작품은 RHF에 마가렛 M. 알켁 재단에 의해 지원되었다.

<html> I. 도식 개요 : <img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_2/Figure1.png" alt="그림 1" width="460" height="384" /> 이 비디오는 여자의 배아에서 신경 유도에 대한 분석에서 여러 단계를 보여줍니다. 먼저, 호스트 배아는 새로운 문화에 explanted입니다 [NI1]. 그런 다음 donnor의 배아가 호수와 Hensen의 노드 (여자의 &quot;구성&quot;)에 explanted됩니다 것은 형광 염료 DiI로 표시됩니다 [NI2]. Hensen의 노드가 donnor의 배아에서 excised입니다 [NI3]와 호스트 배아에 이식 [NI4, NI5]. 호스트 배아는 다음 donnor 조직 호스트 영역에서 이소성 축을 유도 가지고있는 기간이 지난 후 최대 22 시간에 대한 양식입니다 opaca [NI6]. 문화에 따라, 호스트 배아는 고정 및 DAB의 면전에서 photooxidation에 대한 처리 : DAB와 갈색 다음과 같은 반응이 될 사전 photooxidation [NI7]에 FITC의 형광 아래에 빨간색으로 나타납니다이 화학 반응, donnor 파생된 셀로 [NI8]. 배아는 다음 신경 마커 [NI8]와 현장 하이브 리다이 제이션에 대한 처리, 호스트 파생 조직 donnor 그래프트의 존재에 신경 조직을 형성 하였다. 이 조직 파란색 나타납니다. 1 : 새로운 문화에 대한 호스트의 배아를 준비 <ol><li> 이 신경 유도 분석 프로토콜 햄버거 &amp; 해밀턴 단계 3 incubated되었습니다 계란으로 시작 + (또는 HH3 +). 이 계란은 13 시간 동안 습기가 인큐베이터에서 측면에 누워 incubated되었습니다. </li><li> 새로운 문화 (단계 3.1. 5.5 9)에 대한 호스트 배아를 준비합니다. </li><li> 200 μl 식염수에 호스트 배아의 표면을 커버. 이것은 나중에 전송 donnor 그래프트의 위치를​​ 용이하게합니다. </li><li> 마지막으로, 거꾸로 팰컨 35mm 문화 요리와 함께 어셈블​​리를 커버. </li></ol> 2 : 호수에있는 donnor의 배아를 Explanting <ol><li> 포셉와 껍질을 두드리고있는 모든 셀 주위의 껍질 조각을 제거하여 계란을 엽니다. 껍질 위로를 제거하고 폐기. </li><li> 포셉와 두꺼운 알부민을 제거하고, 배가 위쪽으로 얼굴을 너무 거친 포셉로 난황을 기울. </li><li> 좋은 가위를 사용하여 배아 주위에 난황의 사각형 잘라. 숟가락으로 노른자에서 배아를 제거하고, PBS를 포함하는 접시에 장소. </li><li> 포셉를 사용하여, 지역 pellucida에서 donnor의 배아를 분리. </li><li> PBS를 포함 Sylgard 보상 요리로 전송 donnor의 배아. </li></ol> 3, 라벨링 절개 및 donnor 그래프트를 이식 <ol><li> microelectrode의 풀러를 사용하여 50 μl 유리 microcapillary pipettes를 가져옵니다. 현미경, 미세 집게를 사용하여 micropipette의 끝을 잘라. 배양 접시에있는 장소 micropipette는 plasteline의 리본으로 정렬했습니다. </li><li> 전에 이식에 그래프트 레이블을하는 데 사용됩니다 염료 솔루션을 준비 : 염료 DiI (1,1 &#39;- dioctadecyl - 3, 3,3&#39;, 3&#39; - tetramethylindocarbocyanine 퍼클로레이트) carbocyanine : 우선, 1ml에 DiI의 재고를 준비 0.5 %에서 절대 에탄올. 이 주식은 어둠 속에서 - 20C에 저장할 수 있습니다. 42 세트 물 목욕에서 ° C, 혼합 360μl 0.3M 자당 40 μl DiI 주식을 prewarmed. 물 목욕 온도가 DiI과 불용성 결정 형성의 침전을 방지하기 위해 필요합니다. 간단히 미니 spectrafuge에 솔루션을 (5-10 초 동안) 스핀. DiI 솔루션은 이제 사용할 준비가되었습니다. </li><li> 곤충 핀을 사용하여 Sylgard 적용 접시의 바닥에있는 donnor의 배아를 확보. </li><li> 백 - 채우기 DiI로 micropipette합니다. 흡인기 튜브 어셈블리를 사용하여 부드러운 압력을 적용하여, Hensen의 노드에 DiI의 작은 볼러스를 적용합니다. 전체 Hensen의 노드가 표시되었는지 확인합니다. </li><li> microcapillary 피펫 또는 microdissecting 칼을 사용 Hensen의 노드를 ( &quot;주최자&quot;donnor 그래프트) 컷. </li><li> 복부 측면과 카마인과 이식의 사후 끝을 표시합니다. 이것은 이식이 단계에서 적절한 dorso 4.3 - 복부 방향과 위치 있는지 확인합니다. </li><li> 200μl 길슨 피펫을 사용하여 호스트 배아에 이식을 전송하기만하면됩니다. </li></ol> 4 : 이식 및 culturing 호스트 배아를 확보 <ol><li> 그래프트 호스트 사이트 근접 위치에 남아 있는지 확인하고, 호스트 배아에서 염분 제거합니다. </li><li> microcapillary 피펫 또는 microdissecting 나이프를 사용하여 호스트 배아의 Hensen의 노드의 수준, 지역 pellucida / 지역 opaca 경계 영역에 작은 절개 (80 - 100μm)을합니다. </li><li> 그 복부 측면 당신과 사후 최종 향해 얼굴 있도록 microcapillary 피펫 또는 microdissecting 나이프, 위치 그래프트를 사용하면 호스트 배아에 상응하는 지역에 평행이다. </li><li> 남은 생리를 제거하고, 81-22 시간 (단계 6.1 6.6 9)에 대한 새로운 문화에 대한 호스트 배아를 처리합니다. </li><li> 호스트 배아는 다음 4 ° C (단계 7.1-7.7 9)에서 하룻밤 고정됩니다. </li></ol>E &quot;&gt; 5 : 형광 아래 그래프트를 Photooxidise <ol><li> 펌 후드 아래, 트리스 버퍼에 DAB 작업 솔루션을 준비 : 500μg/ml에서 트리스 버퍼 (100mM 트리스 - HCL, pH를 7.4)에서 (3,3 &#39;- diaminobenzidine의 tetrahydrochloride) DAB 기판을 디졸브, 얼음, 어두운 솔루션을 유지. </li><li> 트리스 버퍼의 각 한 번 5 MN 5 MN에 대한 두 번 PBS에서 배아를 씻으십시오. </li><li> 1 ML 트리스 버퍼를 포함하고있는 유리 슬라이드 캐비티에 배아를 전송합니다. </li><li> 1.5 ML DAB 솔루션 트리스 버퍼 솔루션을 교체합니다. DAB를 오염을 제거하다하기 위해 10 % 표백 용액이 들어있는 양동이에 Eppendorf 끝 처리. 공동 슬라이드 위에 coverslip 놓으십시오. </li><li> FITC (플루오레신 isothiocyanate) 형광 아래 그래프트 (donnor 세포가 형광 빨간색으로 나타납니다)에있는 현미경의 목표를 집중하고 모든 형광 붉은 세포가 갈색 (이것은 DiI의 결과로 발생 될 때까지 FITC의 형광에 노출될 photoconverted되는 fluorochrome 불용성 갈색 결정하기 위해, DAB의 면전에서 FITC 여기 파장 (488nm)에 적용됩니다. 노출에 의해이 과정은 20 MN 2 시간 사이에 걸립니다. </li><li> photooxidation 반응의 완료에 따라, 미세 집게를 사용하여 coverslip을 제거합니다. 유리 PBTw (또는 0.1 % 트윈 - 20와 함께 PBS)가 포함된 20 ML의 섬광 병을를 배아를 전송합니다. </li><li> 10 % 표백 용액에 잠복기로 coverslip 유리 캐비티 슬라이드에서 DAB를 비활성화합니다. </li></ol> 6 : 현장 하이브리드화, 사진에 대한 배아를 처리하고 sectioning <ol><li> 전용 라벨 프로브를 발굴을위한 배아를 잠복기, 현장 하이브리드화 (단계 3.7 6.5 9)에서 진행합니다. </li><li> 사진 촬영 (8.2 9 단계) 및 (단계 8.3 및 8.4 9) sectioning 진행합니다. </li></ol> 대표 결과 신경 유도 분석의 다음 예제에서는 donnor 그래프트는 호스트 파생 조직에서 신경 마커 꼬리가없는의 표현을 유도 표시됩니다. donnor 그래프트는 &quot;주최자&quot;영역이 수술 단계에서 donnor의 배아에서 제거되었습니다있는 배아 유래 :이 특정 예제에서, 우리는 일반적으로 &quot;주최자&quot;능력이없는 배아 영역의 신경 유도하는 능력의 획득을 평가 3 +. 구멍 치유하고 Hensen의 노드를 닮은 구조가 형성 때까지 절제 따라 donnor의 배아는 새로운 문화의 개발을 허용합니다. 이 구조는 다음 DiI로 표시된 donnor의 배아에서 excised 및 호스트 배아 면적 pellucida / 지역 opaca 경계에 이식할 수 있습니다. 새로운 문화에 따라, 미니어처 축이 호스트 배아에 인접한 형성이 미니어처 축 붉은 세포의 막대 (donnor는 파생)와 머리처럼 구조 (호스트 파생)의 구성에서 (A), donnor - 파생 DiI 분류 전지는 FITC 형광 현미경 하에서 이전에 고정으로 표시됩니다. 이러한 donnor - 유래 세포는 붉은 세포의 막대로 표시 미니 notochord를 형성 확산있다. (B) DiI의 다음 photoconversion,이 donnor - 유래 세포는 갈색 나타납니다. donnor 그래프트는 호스트에서 신경 조직의 형성을 유도했다 :이 조직은 뇌를 엽 성의 전구 물질로 구성되어 등 현장 하이브리드화에 마커 꼬리가없는 다음과 같은 그들의 표현에 의해 공개 [6에서 reprinted]. <img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_3/Figure 2.png" alt="그림 2" width="230" height="154" /> 참고 :이 절차에서는, 우리는 &quot;신경&quot;조직 (파란색) 파생 호스트에서 신경 유도 donnor 조직 (레드 / 브라운)을 차별화하기 위해 DiI 레이블 세포를 사용했습니다. 대신 파생 여자, DiI 표시 donnor 그래프트를 사용하는 일부 작가도 아닌 여자의 메추라기 배아에서 파생된 donnor 조직 [예 6].를 사용하여 이 대체 방법은 호스트 조직에서 donnor을 차별화 할 수 있습니다. 이 경우, 그래프트 (donnor 조직) 대신 닭고기 계란의 메추라기 계란에서 유래. 4.5 단계에 따라, 호스트가 5.7-3.4와 5.1 조직 (QCP1)와 단계 3.1 퀘일 특정 항체와 함께 전체 마운트 immunohistochemistry에 대한 처리는 프로토콜에서 생략됩니다. 이 대안 절차의 예제는 아래와 같습니다 :이 경우에는, (같은 QCPN 항체 [갈색]의 표현에 의해 참조) 우리는 A, B에서 같은 실험 절차를 사용하지만 우리는 퀘일 - 파생 donnor 조직을 사용 : 재생 메추라기 배아에서 파생 노드는 호스트에있는 냄비 - 신경 마커 Sox2의 표현을 유도했다 [6에서 reprinted] <img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_4/Figure 3.png" alt="그림 3" width="154" height="230" />

<ol>
	<li>Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+development+of+chick+and+duck+embryos,+cultivated+in+vitro.">Experiments on the development of chick and duck embryos, cultivated in vitro.</a> Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 221, 179-230 (1932).</li><li>Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+by+the+primitive+streak+and+its+derivatives+in+the+chick.">Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick.</a> J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).</li><li>Gallera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excision+et+transplantation+des+diff&amp;eacute;rentes+r&amp;eacute;gions+de+la+ligne+primitive+chez+le+poulet.">Excision et transplantation des diff&amp;eacute;rentes r&amp;eacute;gions de la ligne primitive chez le poulet.</a> C. R. Ass. Anat. 49, 632-639 (1964).</li><li>Gallera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+induction+in+birds.">Primary induction in birds.</a> Adv. Morph. 9. , 149-180 (1971).</li><li>Serbedzija, G. N., Fraser, S. E., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+neural+crest+cell+migration+in+the+mouse+embryo+as+revealed+by+vital+dye+labeling.+Development+108.">Pathways of neural crest cell migration in the mouse embryo as revealed by vital dye labeling. Development 108.</a> , 605-612 (1990).</li><li>Psychoyos, D., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+the+organizer+after+radical+ablation+of+Hensen's+node+and+the+anterior+primitive+streak+in+the+chick+embryo.+Development+122.">Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development 122.</a> , 3263-3273 (1996).</li><li>Joubin, K., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+continuously+define+the+organizer+during+the+cell+movements+of+gastrulation.">Molecular interactions continuously define the organizer during the cell movements of gastrulation.</a> Cell. 98, 559-571 (1999).</li><li>Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+neural+induction+by+FGF+signaling+before+gastrulation.">Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation.</a> Nature. , 406-474 (2000).</li><li>Psychoyos, D., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+Culture+of+Early+Chick+Embryos+ex+vivo+(New+Culture.">Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture.</a> JoVE. 20, 10-3791 (2008).</li></ol>

이 동영상은 신경 유도에 대한 분석을 수행하는 다른 단계를 설명합니다,이 분석은 본질적으로 여자의 putative 신경 유도하는 분자의 특성에 사용되며, 따라서 embryological micromanipulations 1-4을 이르기까지 애플 리케이션의 다양한 사용할 수 있습니다; 6 무너지고 새로운 신호 폭포로 7,8 모든 두뇌 형성하고 남은 신경 계통의 초기 단계에 대한 이해를 목표로.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Eggs</td>
<td>Animal</td>
<td>Charles River Laboratories</td>
<td>Premium Fertile</td>
<td>Fertilized, HH3+ (14 hr)</td>
</tr>
<tr>
<td>Stereomicroscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Leica Microsystems</td>
<td>MZ9.5 or similar</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybridization Incubator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Robbins Scientific</td>
<td>M1000</td>
<td>Use with inverted Pyrex dish and 500 ml ddH2O beaker</td>
</tr>
<tr>
<td>Marsh Automatic Incubator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Lyon</td>
<td>RX</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pyrex dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Watchmaker's glass 50mm</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>66112-060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass rings</td>
<td>Tool</td>
<td>Physical Plant facility</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish.</td>
</tr>
<tr>
<td>Curved Forceps (1)</td>
<td>Tool</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72991-4C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps (2)</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11002-13</td>
<td>blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil</td>
</tr>
<tr>
<td>Fine scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14161-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic dishes</td>
<td>Tool</td>
<td>Falcon</td>
<td>353001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rubber Bulb</td>
<td>Tool</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>70980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DiI</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D-282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aspirator tube assembly</td>
<td>Tool</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5177-5EA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microelectrode puller</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Sutter Instruments	P-97 Flaming/Brown Micropipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur Capillary Pipette</td>
<td>Tool</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>70950-12</td>
<td>round edge under flame</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture chamber</td>
<td>Tool</td>
<td>Pioneer Plastics</td>
<td>030C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcapillary tube</td>
<td>Tool</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1049-1PAK</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microdissecting knife</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10056-12</td>
<td>Use to puncture cavities prior to in situ hybridization</td>
</tr>
<tr>
<td>Minuten pins 0.2mm diam</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26002-20</td>
<td>Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C</td>
</tr>
<tr>
<td>Diethylpyrocarbonate (depc)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>15710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>0001986475</td>
<td>Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C</td>
</tr>
<tr>
<td>Diethylpyrocarbonate (depc)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>10025025</td>
<td>Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave</td>
</tr>
<tr>
<td>16% PFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>15710</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assay for neural induction in the chick embryo

여자의 난자는 초기 배아 발달의 연구에 귀중한 도구입니다. 투명성, 접근성 및 조작 용이성, 그건 신경 시스템의 형성과 초기 patterning을 공부를위한 이상적인 도구가합니다. 이 동영상은 호스트에 그래프트 구성 조직하는 방법하는 Hensen의 노드 (여자의 배아에서 주최자가) 호스트 관할 ectoderm에 이식할 수 있습니다 방법을 보여줍니다. 주최자의 수술이 신경 유도 신호를 통해 신경 운명을 채택하는 조직을하신 나 overlying 지시합니다. 이 메커니즘은 신경 유도이라고하고, amniotes의 뇌 및 척수의 형성의 초기 단계를 구성합니다. 이 메소드는 본질적으로 여자의 putative 신경 유도하는 분자의 특성에 사용됩니다. 이 동영상은 신경 유도에 대한 분석에서 여러 단계를 보여주는, 첫째, d​​onnor의 배아는 explanted과 요리에 박혀있다. 그런 다음, 호스트 배아는 새로운 문화에 대한 준비가되어 있습니다. 이식은 excised과 호스트 영역 pellucida 여백에 이식합니다. 호스트는 18-22 시간에 대한 양식입니다. 어셈블리가 고정되어 더 이상 응용 프로그램 (예에 원위치 하이브리드화)에 대한 처리됩니다. 이 방법은 원래 웨딩턴에 의해 고안되었다<sup&gt; 1,2</sup&gt; 그리고 Gallera<sup&gt; 3,4</sup&gt;.

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Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

신경 유도는 뇌의 형성의 첫 단계입니다. 그것은 Hensen의 노드 (주최자), 신경 운명을 채택할에 인접한 조직을 지시하는 메커니즘이며, 신경 계통을 일으키다하는 즉. 이 비디오는 여자의 배아에서 신경 유도에 대한 분석을 보여줍니다.

칙의 배아에서 신경 유도에 대한 분석

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

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17.1K 조회수.  Texas A&M University (TAMU). 신경 유도는 뇌의 형성의 첫 단계입니다. 그것은 Hensen의 노드 (주최자), 신경 운명을 채택할에 인접한 조직을 지시하는 메커니즘이며, 신경 계통을 일으키다하는 즉. 이 비디오는 여자의 배아에서 신경 유도에 대한 분석을 보여줍니다.