وأيد هذا العمل من قبل MINISTERIO Ciencia الاسبانية دي ذ Educación (BIO 2006-11792) وكتالونيا دي كاتالونيا (2005 SGR00437). وأود أن أشكر كتاب مارك لوكاس Jonatan Puigcerver ولما قدموه من مساعدة فنية في إعداد وسائل الإعلام. ومن المسلم به جميع الموظفين من Estabulari ديفوار Servei للإسكان الحيوانات ، وخصوصا خوان خوسيه مارتن وخافيير بنيتو لمساهمتهم إضافية حول تسجيل جزء من هذا الفيديو. البنك الأهلي التجاري هو زميل في الفقرة قرينتها البرتغالية ه Ciência بحوث والتكنولوجيا وسان جرمان هو زميل إسباني MINISTERIO دي Educación Ciencia ذ.

أجريت رعاية الحيوان والإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وافقت عليها لجنة الأخلاقيات في بحوث الحيوان والإنسان في جامعة برشلونة المستقلة ، إسبانيا. أولا جمع سيت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وحدد الاختيار الهامستر الإناث (Mesocricetus auratus ؛ 12/08 الاسبوع القديمة) من سلالة السوري الذهبي عن وجود إفرازات مهبلية سميكة (التفريغ بعد الإباضي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمل الإناث المحدد إلى superovulate عن طريق الحقن داخل الصفاق من 40 وحدة دولية من PMSG (ماري الحامل مصل موجهة الغدد التناسلية) ، يليه 40 وحدة دولية من (موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية) قوات حرس السواحل الهايتية 60 ساعة في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هامستر أنثى الموت ببطء بعد 16 ساعة من إدارة قوات حرس السواحل الهايتية في غرفة الكربون ثاني أكسيد الكربون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل ناقلة البيضات من الإناث كما هو مبين في الفيديو ونقلها إلى قطرة من KSOM - H المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع البويضة ، قزع المجمعات التي تمزق أمبولة قناة البيض تحت المجهر مجسمة في قطرة من هيالورونيداز (156 U / مل) على 37 درجة مئوية. وسيتم اطلاق سراح من خلايا البويضات الركامية في حوالي 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط البويضات من هيالورونيداز وغسلها مرتين في KSOM - H المتوسط. </li></ol> لجمع أجنة الفئران والفئران الإناث (المصحف العضلة ؛ 6-8 الاسبوع القديمة) وحثهم على superovulate عن طريق الحقن داخل الصفاق من 5 وحدة دولية من PMSG تليها 5 وحدة دولية من 48 ساعة في وقت لاحق قوات حرس السواحل الهايتية وتزاوج مع الفئران الذكور. وضحى الاناث ، من خلال عنق الرحم في خلع 24-26 ، 44-46 أو 54-56 بعد ساعات من إدارة قوات حرس السواحل الهايتية لobtention pronuclear التوالي من 2 خلايا الأجنة أو مرحلة 4 خلايا ، ،. يتم تنفيذ مجموعة من الأجنة pronuclear تماما كما وصفها لالبويضات الهامستر. يتم جمع الأجنة في المراحل 2 - الخلية والخلية 4 * شطف ناقلة البيضات مع KSOM - H المتوسطة [6]. ملاحظة : بعد هذا البروتوكول يمكن جمع حوالي 20 إلى 30 البويضات / الأجنة الإناث من كل. II. إعداد تجميد والذوبان حلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل لي تمييع 0.57 مل من propilenglycol في 5 مل من KSOM - H (1.5 م من propilenglycol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل ذوبان بإضافة 2 مل من KSOM - H إلى أنبوب مع السكروز ز 0.2052 (0.3 م من السكروز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل تجميد بإضافة 2 مل من محلول الأول لأنبوب مع السكروز ز 0.0684 (1.5 م و 0.1 من propilenglycol السكروز M). </li></ol> ملاحظة : يجب أن أكون مستعدا الحل والتجميد والذوبان حلول عادلة قبل استخدامها. ومع ذلك ، قد تكون مرجحة لكميات محددة من السكروز لاستخدامها في التحضير للتجميد والذوبان في حلول مسبقة وتخزينها في أنابيب ML - 3 في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر. III. تجميد البروتوكول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البويضات / الأجنة من المتوسط ​​KSOM - H إلى انخفاض الحل الأول واحتضان ل15/07 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت نفسه ، بإعداد طبق بتري 90 ملم لتحميل القش عن طريق وضع قطرات 90 ميكرولتر من التجمد والذوبان الحلول كما هو مبين في الفيديو (1 قطرة من كل حل / القش). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العدد المرغوب فيه من البويضات / الأجنة إلى حل تجميد قطرات. ملاحظة : نقوم بنقل عادة ما بين 5-30 البويضات أو الأجنة / قطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق القش لتطلع نظام للرقابة والفم تحميله التالية بهذا الترتيب : الحل الأول ، والهواء ، وانخفاض تجميد البويضات مع والهواء وانخفاض ذوبان الجليد ، والهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد أن يتم تحميل القش ، والحفاظ على الشفط حتى أول انخفاض قدم (الحل الأول) تصل إلى البوليمر في نهاية العلوي من القش والأختام هذه الغاية. الحرارية ختم الطرف الآخر من القش أو الختم مع المكونات البلاستيكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل في الثلاجة للبرمجة وحدد البرنامج التجمد. ويستند البرنامج تجميد المستخدمة في هذا البروتوكول على معدلات التبريد نشرت أصلا لاسال وآخرون. [7] : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 درجة مئوية / دقيقة من درجة حرارة الغرفة ل-7 درجة مئوية 0 درجة مئوية / دقيقة لمدة 10 دقيقة للسماح لموازنة درجة الحرارة وتحريض بذر (أنظر أدناه) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.3 درجة مئوية / دقيقة من -7 -30 درجة مئوية إلى درجة مئوية 0 درجة مئوية / دقيقة لمدة 2 دقيقة للسماح لموازنة درجة الحرارة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 35 درجة مئوية / دقيقة من -30 درجة مئوية إلى -130 درجة مئوية </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل القش على فتحات لصاحب الثلاجة للبرمجة ، والتأكد من أن جزءا من القش مع ذوبان قطرة من حل تواجه الخارج. بدء برنامج التجميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تصل درجة حرارة العينة -7 درجة مئوية وتبريد قيد الانتظار ، نفذ دليل البذر : ملقط يغرق في النيتروجين السائل ، وسحب أصحاب قليلا من خارج الثلاجة لكشف جزء من القش التي تحتوي على قطرات من ذوبان الحل ، وعلى الفور لمس هذا الجزء من القش مع ملقط. كرر لكل حامل والقش في كل حامل ، واسمحوا ثم تجميد برنامج تشغيل حتى النهاية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم الانتهاء من البرنامج ، يغرق في حملة النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة من القشأصحاب ونقلها إلى gobelet المسمى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا ، تخزين gobelet داخل خزان النتروجين السائل. </li></ol> رابعا. ذوبان بروتوكول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القش من خزان النتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على القش في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقع القش في حمام الماء عند 30 درجة مئوية خلال 40 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المكونات من قش أو خفض رأس الحرارية مختوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إفراغ القش في طبق بتري 35 ملم والمزيج برفق قطرات يحتويان على تجميد والذوبان الحلول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك البويضات / الأجنة في الخليط لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البويضات / الأجنة إلى هبوط جديد للKSOM - H لمدة 15 دقيقة إضافية بلغت 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البويضات / الأجنة على استعداد الآن للتلاعب أخرى. </li></ol> ملاحظة : أثناء الخطوتين 6 و 7 سترى أن إذابة البويضات / الأجنة تنتفخ ببطء بسبب الجفاف. خامسا نتائج الممثل وذكرت واستخدام بروتوكول الحفظ بالتبريد هنا النتائج في معدل البقاء على قيد الحياة من حوالي 95 ٪ للبويضات وحيوانات أليفة 90 ٪&gt; ، 85 ٪ و 80 ٪ للأجنة B6CBAF1 الماوس في pronuclear ، 2 خلية خلية مراحل و 4 على التوالي. عندما يتم تربيتها في المختبر أجنة فئران في KSOM بعد ذوبان الجليد ، وينبغي أن لا يقل عن 70 إلى 80 ٪ تصل إلى مرحلة الكيسة الثقافة في ظروف مثلى. فمن المستحسن أن تقوم بتضمين مجموعة التحكم (القش) من البويضات / الأجنة في كل تجربة تجميد والذي أذاب هذه المجموعة قبل أن يتم استخدام ما تبقى من البويضات / الأجنة لمزيد من التلاعب. إذا كانت معدلات البقاء على قيد الحياة لمجموعة المراقبة هي أقل مما كان متوقعا ، أذاب آخر القش من الكثير واحد. إذا كانت معدلات البقاء على قيد الحياة لهذه المجموعة الثانية هي أيضا منخفضة ، وتجاهل القش المتبقي من هذا الكثير التجمد.

<ol>
	<li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196+and+-269+&#176;C.">Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 &#176;C.</a> Science. 178, 411-414 (1972).</li><li>Wilmut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cooling+rate,+warming+rate,+cryoprotective+agent+and+stage+of+development+on+survival+of+mouse+embryos+during+freezing+and+thawing.">The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing.</a> Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).</li><li>Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+various+low+temperatures,+cryoprotective+agents+and+cooling+rates+on+the+survival,+fertilizability+and+development+of+frozen-thawed+mouse+eggs.">Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs.</a> J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).</li><li>Schneider, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryobiological+principles+of+embryo+freezing.">Cryobiological principles of embryo freezing.</a> J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).</li><li>Vajta, G., Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cryopreservation+systems.">Improving cryopreservation systems.</a> Theriogenology. 65, 236-244 (2006).</li><li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieval+of+mouse+oocytes.">Retrieval of mouse oocytes.</a> JoVE. 3, (2007).</li><li>Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryo+features+that+influence+the+success+of+cryopreservation+with+the+use+of+1,2+propanediol.">Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol.</a> Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).</li><li>Ib&#225;&#241;ez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santal&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+caprine+beta-lactoglobulin+transgenic+mouse+embryos.">Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos.</a> Cryobiology. 35, 290-298 (1997).</li><li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing.">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li><li>Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+freezing+and+thawing+method+of+hamster+oocytes+designed+for+both+the+penetration+test+and+chromosome+assay+of+human+spermatozoa.">A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa.</a> Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).</li><li>Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+and+preimplantation+development+of+the+mouse+in+the+protein-free+KSOM.">Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM.</a> Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).</li></ol>

يمكن أن يكون هذا مع البويضات والأجنة الهامستر بروتوكول الماوس cryopreserved بنجاح. المجمدة مرة واحدة ، يمكن تخزين البويضات / الأجنة في النيتروجين السائل الدبابات إلى أجل غير مسمى وتسترد في أي زمان أو مكان المطلوب. هذا يوفر ميزة وجود عينات جاهزة تقريبا لاستخدام كلما دعت الحاجة. من ناحي?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>French type mini-straw 0.25 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mini-tub</td>
<td>13407/0010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>hCG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Farma-Lepori, Spain</td>
<td>749036.4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H-3884</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KSOM-H medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ref. [11]</td>
</tr>
<tr>
<td>Liquid Nitrogen </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Air Liquide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic plugs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mini-tub</td>
<td>19046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intervet, Spain</td>
<td>1.614/8447</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Propilenglycol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>82280</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>107687</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aesculap</td>
<td>BC-060R; BG-061R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermo-sealer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIZ</td>
<td>220</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 and 90 mm culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>153066; 150350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Greiner Bio-one</td>
<td>163160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nitrogen tank</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MVE, Cryogenics</td>
<td>XC 43/28</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Programmable Freezer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Planner Products Ltd.</td>
<td>Kryo-10 Series III</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aesculap</td>
<td>BD-331R; BD-053R; OC-020R</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

collection and cryopreservation of hamster oocytes and mouse embryos

وكانت أول أجنة البويضات cryopreserved بنجاح أكثر من 30 عاما مضت ، عندما يتنغهام<i&gt; وآخرون.</i&gt;<sup&gt; 1</sup&gt; ويلموت<sup&gt; 2</sup&gt; صفها بشكل منفصل يمكن أن يتم تجميد الأجنة وتخزينها على الماوس -196 درجة مئوية ، وبعد سنوات قليلة ، Parkening<i&gt; وآخرون</i&gt;.<sup&gt; 3</supذكرت&gt; ولادة نسل الحية الناتجة عن التخصيب في المختبر (IVF) من البويضات cryopreserved. منذ ذلك الحين ، انتشر استخدام تقنيات الحفظ بالتبريد سريعا ليصبح عنصرا أساسيا في ممارسة المساعدة على الإنجاب البشري والحيواني والحفاظ على الموارد الوراثية الحيوانية. حاليا ، هناك اثنين من الطرق الرئيسية المستخدمة لcryopreserve البويضات والأجنة : تجميد بطيئة والتزجيج. وقد استخدمت مجموعة متنوعة واسعة من النهج في محاولة لتحسين كل من التقنيات والملايين من الحيوانات والآلاف من الأطفال قد ولدوا من أجنة cryopreserved. ومع ذلك ، وأوجه القصور الهامة المرتبطة الحفظ بالتبريد لا يزال يتعين التغلب عليها ، ومنذ تشكيل الجليد الكريستال ، وآثار الصدمة التناضحي الحل ويبدو أن السبب cryoinjuries عدة في مرحلة ما بعد إذابة البويضات والأجنة. تجميد التجميد البطيء مع برمجة لديه ميزة استخدام تركيزات منخفضة من cryoprotectants ، التي ترتبط عادة مع المواد الكيميائية والسمية التناضحي صدمة ، ولكن قدرتها محدودة لتجنب الجليد تشكيل الكريستال في تركيزات منخفضة. التجميد البطيء يدفع أيضا آثار supercooling أنه يجب تجنب استخدام بذر يدوية أو أوتوماتيكية<sup&gt; 4</sup&gt;. في عملية التزجيج ، تركيزات عالية من cryoprotectants يمنع تشكيل بلورات الجليد ، وتؤدي إلى تشكيل دولة المزجج شبيهة بالزجاج التي توطد الماء ، ولكن لا الموسعة. ومع ذلك ، ونظرا لسمية cyroprotectants في التركيزات المستخدمة ، لا يمكن إلا البويضات / الأجنة أن تتعرض للحل cryoprotectant لفترة قصيرة جدا من الزمن ، والحل في حجم الحد الأدنى ، وذلك قبل غمر العينات مباشرة في النيتروجين السائل<sup&gt; 5</sup&gt;. في العقد الأخير ، أصبح أكثر شعبية التزجيج لأنه هو وسيلة سريعة جدا التي تتطلب أية معدات باهظة الثمن (الفريزر برمجة). ومع ذلك ، يستمر التجميد البطيء ليكون الأسلوب الأكثر استخداما لالبويضة / جنين الحفظ بالتبريد. في هذا المقال نعرض الفيديو ، خطوة بخطوة ، وكيفية جمع وتجميد البويضات ببطء الهامستر مع ارتفاع معدلات البقاء على قيد الحياة بعد ذوبان الجليد. يمكن أيضا أن يطبق نفس الإجراء لتجميد والذوبان بنجاح أجنة فئران في مراحل مختلفة من التطور سابق للانغراس.

Watch this Scientific Journal Video about Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos at JoVE.com

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

في هذه المقالة عن طريق الفيديو نقدم مظاهرة خطوة بخطوة حول كيفية جمع البويضات وcryopreserve الهامستر مع ارتفاع معدلات البقاء على قيد الحياة بعد ذوبان الجليد. يمكن أيضا أن يطبق نفس الإجراء لتجميد والذوبان بنجاح أجنة فئران في مراحل مختلفة من التطور سابق للانغراس.

جمع والحفظ بالتبريد من البويضات والأجنة الهامستر ماوس

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

collection-and-cryopreservation-of-hamster-oocytes-and-mouse-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K Views.  Universitat Autonoma de Barcelona. في هذه المقالة عن طريق الفيديو نقدم مظاهرة خطوة بخطوة حول كيفية جمع البويضات وcryopreserve الهامستر مع ارتفاع معدلات البقاء على قيد الحياة بعد ذوبان الجليد. يمكن أيضا أن يطبق نفس الإجراء لتجميد والذوبان بنجاح أجنة فئران في مراحل مختلفة من التطور سابق للانغراس.

Video: Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

نقل النووي في البويضات ماوس

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

تشريح 6.5 أجنة الفئران DPC

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

استرجاع البويضات ماوس

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

في الرحم وحقن داخل البطيني Electroporation من أجنة الفئران E15

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

في الجسم الحي التصوير والعلاجات العلاجية في الفأر نموذج مثلي من سرطان المبيض

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage. Preimplantation embryos consist predominantly of water, and the avoidance of intracellular ice crystal formation during the cryopreservation process is of paramount importance to maintain embryo viability. Embryos are placed into a hypertonic solution (1.4 &#x2013; 1.5 M) of a cryoprotective agent (CPA) such as ethylene glycol (EG) or glycerol (GLYC) to create an osmotic gradient that facilitates cellular dehydration. After embryos reach osmotic equilibrium in the CPA solution, they are individually loaded in the hypertonic CPA solution into 0.25 ml plastic straws for freezing. Embryos are placed into a controlled rate freezer at a temperature of -6&deg;C. Ice crystal formation is induced in the CPA solution surrounding the embryo, and crystallization causes an increase in the concentration of CPA outside of the embryo, causing further cellular dehydration. Embryos are cooled at a rate of 0.5&deg;C/min, enabling further dehydration, to a temperature of -34&deg;C before being plunged into liquid nitrogen (-196&deg;C). Cryopreserved embryos must be thawed prior to transfer to a recipient (surrogate) female. Straws containing the embryos are removed from the liquid nitrogen dewar, held in room temperature air for 3 to 5 sec, and placed into a 37&deg;C water bath for 25 to 30 sec. Embryos cryopreserved in GLYC are placed into a 1 M solution of sucrose for 10 min for removal of the CPA before transfer to a recipient (surrogate) female. Embryos cryopreserved in EG, however, may be directly transferred to the uterus of a recipient.

Preimplantation embryos may be cryopreserved after placement into a hypertonic cryoprotective solution to cause cellular dehydration. After equilibration, ice crystal formation is induced in the solution surrounding the embryo. Further dehydration occurs as the embryo is slowly cooled to subzero temperatures before plunging into liquid nitrogen for storage.

الحفظ بالتبريد سابق للانغراس الجنين من الأبقار والأغنام والماعز

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

الحفظ بالتبريد من أجنة الفئران التي التزجيج جلايكول الإثيلين ، واستنادا

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

الماوس حفظ بالبرودة والانتعاش الحيوانات المنوية باستخدام · لقد كرو كيت

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

تقييم المغزل الانتصافي في ماوس البويضات التي كتبها بوساطة سيرنا إسكات

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a critical yet enigmatic biological event that has been historically difficult to study due to technical and ethical limitations. Implantation is initiated by the development of the trophectoderm to early trophoblast and subsequent differentiation into distinct trophoblast sublineages. Aberrant early trophoblast differentiation may lead to implantation failure, placental pathologies, fetal abnormalities, and miscarriage. Recently, methods have been developed to allow human embryos to grow until day 13 post-fertilization in vitro in the absence of maternal tissues, a time-period that encompasses the implantation period in humans. This has given researchers the opportunity to investigate human implantation and recapitulate the dynamics of trophoblast differentiation during this critical period without confounding maternal influences and avoiding inherent obstacles to study early embryo differentiation events in vivo. To characterize different trophoblast sublineages during implantation, we have adopted existing two-dimensional (2D) extended culture methods and developed a procedure to enzymatically digest and isolate different types of trophoblast cells for downstream assays. Embryos cultured in 2D conditions have a relatively flattened morphology and may be suboptimal in modeling in vivo three-dimensional (3D) embryonic architectures. However, trophoblast differentiation seems to be less affected as demonstrated by anticipated morphology and gene expression changes over the course of extended culture. Different trophoblast sublineages, including cytotrophoblast, syncytiotrophoblast and migratory trophoblast can be separated by size, location, and temporal emergence, and used for further characterization or experimentation. Investigation of these early trophoblast cells may be instrumental in understanding human implantation, treating common placental pathologies, and mitigating the incidence of pregnancy loss.

Here, we describe a method for warming vitrified human blastocysts, culturing them through the implantation period in vitro, digesting them into single cells and collecting early trophoblast cells for further investigation.

مجموعة خلايا واحدة من الخلايا الأرومية الترونفوبلاست في مرحلة زرع الأجنة البشرية

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...