يفشل العديد من حالات الحمل في وقت مبكر من تطور الأجنة البشرية حول سبعة أو ثمانية بعد الإخصاب. هذا البروتوكول يوفر فرصا للمحققين لزراعة المفاهيم البشرية في المختبر خلال هذه النافذة زرع غامضة. وهذا يسمح لنا بفهم الآليات التي تدعم نجاح زرع الإنسان وتشكيل المشيمة المبكر.
إن استخدام نظام ثقافة ممتد لزراعة الأجنة البشرية في مرحلة الزرع في المختبر هو على الأرجح الطريقة الوحيدة للحصول على مواد أصلية لدراسة الزرع والتمايز التروديبلاستي المبكر. هذه التقنية المباشرة هي أداة قوية تسمح لنا بالإجابة على العديد من الأسئلة الأساسية حول التنمية البشرية المبكرة. وسوف تسهم الأبحاث التي أجريت باستخدام هذا البروتوكول إلى حد كبير في فهم فقدان الحمل المبكر، وفشل زرع المتكررة وأمراض المشيمة.
ومن خلال هذا الإجراء، ستكون ديردري لوجسدون، طالبة الدكتوراه من أحد المختبرات. قبل يوم واحد من احترار الجنين، قم بإعداد لوحات الوسائط والاسترداد في غطاء تدفق معقم. ملء اثنين من مركز جيدا الجهاز ثقافة غسل الأطباق مع 500 ميكرولترات من BM مع 10٪ SPS، ثم تغطية BM مع 500 ميكرولترات من زيت الصف ثقافة الجنين.
في طبق زراعة الأنسجة 16 ملليمتر، طبقة ثمانية ملليلتر من زيت ثقافة الجنين ومرساة 20 قطرات ميكرولتر من BM مع 10٪ SPS إلى القاع. اكويل أطباق الغسيل وطبقة الانتعاش في حاضنة في 37 درجة مئوية، 6٪ ثاني أكسيد الكربون و 5٪ الأكسجين لمدة أربع ساعات على الأقل. Aliquot ما يقرب من أربعة ملليلتر من IVC 1 في أنبوب سقف المفاجئة خمسة ملليلتر وإعداد طبق واحد غسل مع 500 ميكرولترات من IVC 1 مع عدم وجود تراكب الزيت.
اكويل الطبق و الأنبوب في الحاضنة لمدة أربع ساعات على الأقل. تخفيف الليفية من مصل الإنسان في برنامج تلفزيوني إلى 30 ميكروغرام لكل ملليلتر. فتح حزمة الأغطية الثمانية ذات الغرف المحجرة بعناية عدم لمس الآبار ، ثم الماصات 250 ميكرولترات من الليفي في كل بئر.
استبدل الغطاء على غطاء الغطاء وحضنه بأربع درجات مئوية لمدة 20 إلى 24 ساعة. إعداد لوحة الثقافة الموسعة في صباح يوم احترار الجنين. استرداد زلة الغطاء مع الليفية وضعه في غطاء تدفق laminar.
ثم إزالة خليط fibronectin مع ماصة ملليلتر واحد وتجاهله. Pipette 300 ميكرولترات من IVC 1 التوازنية في كل بئر ووضع الغطاء في الحاضنة حتى إزالة pellucida زونا. بعد ارتفاع درجة حرارة واستعادة الأجنة البشرية D5، وتقييمها لإعادة التوسع واتخاذ صور لكل جنين.
نقل كل جنين إلى 500 ميكرولترات من اغضاءة معالجة موبوءة المتوسطة مع 5٪ FCS. ثم تعامل مع حل تيرود الحمضية كما هو موضح في مخطوطة النص. نقل على الفور الجنين مع زونا حل في 300 ميكرولترات من MOPS الدافئة المخزنة المتوسطة لإخماد حل التيرود.
ثم نقل الجنين إلى طبق أنسجة الجهاز بشكل جيد مركزي يحتوي على BM المُعَسَن مع 10٪ SPS تحت زيت الصف لثقافة الجنين. ثم ارجع الجنين إلى 20 ميكرولتر انخفاض الانتعاش. قم بنقل الأجنة بشكل فردي إلى طبق الغسيل مع وسائط IVC 1 المُعَسَّنة، ثم قم بتحريك كل جنين بعناية إلى بئر من الغطاء المُغَرَف، مع التأكد من تتبع عملية تحديد الجنين.
إعادة غطاء الغرف إلى حاضنة تعيين إلى 37 درجة مئوية، 6٪ ثاني أكسيد الكربون والأكسجين في الغلاف الجوي لمدة يومين. في اليوم الثاني من النمو، تفحص بعناية تعلق الأجنة تحت المجهر وتبادل وسائل الإعلام. تعرف على الجنين الذي تعلق على الطبق عن طريق التنصت بلطف على لوحة.
لتغيير الوسائط، قم بإزالة الغطاء واتم بعناية 150 ميكرولترات من IVC 1، مع الحرص على عدم إزعاج الجنين المرفق. إذا لم يكن الجنين قد تعلق بعد على لوحة، لا تبادل وسائل الإعلام لأن المصل في IVC 1 سوف تساعد في المرفق. ببطء ماص 150 ميكروليترس من وسائل الإعلام الثقافة الموسعة التوازن، IVC 2 في كل بئر واستبدال الغطاء على غطاء.
عاد بعناية coverslip غرفة إلى الحاضنة. كرر تبادل وسائل الإعلام والتحقق من المرفقات كل يوم حتى الأجنة جاهزة لل التثبيت أو الهضم خلية واحدة. إذا كان جمع وسائل الإعلام المستهلكة ضروريًا لمزيد من التحليل ، قم بتجميد 150 ميكرولترات من IVC 1 التي تمت إزالتها إلى أنبوب منخفض الربط معقمة 0.5 ملليلتر.
اغسل كل جنين مرة واحدة مع 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني، ثم أضف 200 ميكرولترات من محلول التربسين لكل بئر. إرجاع غطاء الأغطية المُغطّاة إلى الحاضنة لمدة خمس دقائق. استخدام ماصة صغيرة أو ماصة الفم سحبها ناعما لالتقاط MTB الفردية ثم استخدام ماصة أكبر لتفكك بلطف الجنين عن طريق الطامح صعودا وهبوطا.
استمر في اغراء الجنين بلطف وبشكل متكرر باستخدام طرف ماصة قطره أصغر حتى يتم احتضان الجنين لما مجموعه 10 دقائق في التربسين. لتنفيذ اختيار خلية واحدة، نقل الخلايا المنفصلة من خلال 320 قطرات غسل ميكرولتر من برنامج تلفزيوني و 0.1٪ PVP تحت زيت ثقافة الجنين، مع الحرص على عدم فقدان أي خلايا. بعد غسل الخلايا استخدام ماصة الزجاج سحبت ناعما لتحديد خلية واحدة.
ماصة بعناية الخلية المفردة في أنبوب معقمة 0.2 ملليلتر منخفضة الربط مع الحد الأدنى من حجم برنامج تلفزيوني وPVP. التقط الخلايا الفردية الحرة في النيتروجين السائل وتخزينها في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية لمزيد من الاستخدام. أظهرت الأجنة السليمة استمرار انتشارها على مدى انتشارها الممتد، في حين بدأت الأجنة غير الطبيعية في التراجع عن حوافها الخارجية وتفككت.
في اليوم ثمانية بعد الإخصاب، كانت معظم الخلايا في الأجنة cytotrophoblast أو CTBs، التي كانت إيجابية لعلامة trophoblast جاتا-3. على أطراف الجنين ، كانت CTBs تفرق بالفعل إلى مزامنة متعددة النواة ، والتي كان لها ورقة مثل المظهر وملطخة إيجابية للبشر CGB. في اليوم 10، كان تشكيل الخلايا التروفوبلاستية المهاجرة المهاجرة CGB في الحد الأقصى، وهو ما أكده ارتفاع إنتاج قوات حرس السواحل الهايتية في هذا الوقت.
الترومبلات المهاجرة التي تلطخت إيجابية لHLA-G، كما بدأت في الظهور والهجرة بعيدا عن جسم الجنين. وبحلول اليوم الثاني عشر، كان التمايز في الـ STB في تراجع وأصبح إنتاج MTB أكثر بروزًا، مما يشير إلى تحول التركيز من إنتاج الهرمونات في اليوم 10 إلى هجرة الخلايا في اليوم 12. ويمكن ملاحظة هذه التغييرات في الفيديو الفاصل الزمني من فترة زرع شبه.
الفيديو يدل على انهيار blastocele ، وتشكيل STB ، والتمايز في نهاية المطاف والهجرة من MTB. أهم شيء يجب أن نأخذ في الاعتبار عند الانتهاء من هذا الإجراء هو أنك تعمل مع الأجنة الحية التي هي حساسة للتغيرات في درجة الحرارة، وosmolality ودرجة الحرارة. التقليل من مقدار الوقت الذي تكون عليه الأطباق خارج الحاضنة أمر بالغ الأهمية للحفاظ على صحة الجنين.
بعد الانتهاء من هذا الإجراء، يمكن للمحققين استخدام خلايا واحدة معزولة لمصب الخلية الواحدة أوميكات المقايسات، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة وتسلسل بيسولفيت الجينوم كله لفهم أفضل التغيرات اللاجينية والنسخية خلال زرع الإنسان وتشكيل المشيمة في وقت مبكر.
