This research was supported in part by the University of Georgia, and a grant (HD071330) from the National Institutes of Health to MMV.

وقد وافق هذا البروتوكول من قبل لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة جورجيا. 1. الاستعدادات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للثقافة بويضة أو شراء أو طازجة إعداد الحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM) وتكملة مع 3 ملغ / مل ألبومين المصل البقري (BSA) كما هو مبين في الجدول رقم 1 ضع زجاجة البوليسترين على التوازن تحميل (الفارغة إلى الصفر). إضافة كافة الكواشف، إلا BSA، في النظام وإظهار الحجم النهائي مع MQ-المياه وزنا إلى ما مجموعه 250 غرام. قم بإضافة BSA، تسمح بحل وتصفية تعقيم. ملاحظة: MEM المتوسطة وصفها يتطلب موازنة وحضانة خلية تحتوي على خليط الغازات الطبية من 5٪ CO 2، 5٪ O 2 و 90٪ N 2. لكن وسائل إعلام أخرى (على سبيل المثال، CZB) يمكن استخدامها التي تسمح للحضانة خلية في 5٪ CO 2 تحت الظروف الجوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالبويضة microinjection، شراء أو تحضير M2 المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير صفرس النهج السائد في المصل موجهة الغدد التناسلية (PMSG) إلى تركيز 5 وحدة دولية / 100 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شراء وإعادة الأسهم سيرنا إلى تركيز العمل من 1 ميكرومتر. </li></ol> 2. ماوس سيت مجموعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DAY 1: لتحفيز التنمية جراب المبيض وزيادة عدد بصيلات ما قبل التبويض، وإدارة 5 وحدة دولية من PMSG البريتونى لإناث الفئران 48 ساعة قبل جمع البويضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DAY 3: لجمع البويضة والثقافة، وإعداد أطباق ثقافة 35 ملم مع 3 مل من MEM / BSA تستكمل مع 1 ميكروغرام / مل ميلرينون. يحافظ هذا المانع phosphodiesterase البويضات في الطور الأول-I اعتقال ويمنع انهيار حويصلة جرثومي (GVBD). تتوازن أطباق الثقافة في خليط الغازات الطبية لمدة 15 دقيقة على الأقل. مطلوب ميلرينون وسائل الإعلام في جميع أنحاء تستكمل جمع البويضة، وكذلك البويضة microinjection و24 ساعة الانتظار ثقافة فترة ما بعد سيرنا: مذكرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد المبيضين من إناث الفئران باستخدام مختبر أنشئت يمارس 15 ونقل إلى صحن الثقافة الجديد مع قبل حرارة ومعايرتها MEM / BSA / ميلرينون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الطبق الثقافة في مرحلة من مراحل stereomicroscope لجمع البويضة. الإفراج الركامية-بويضة المجمعات (COC ل) من خلال ثقب الجريبات الغارية مع 27 الإبر G يدويا. إصلاح مبيض واحد إلى أسفل الطبق الثقافة، مع إبرة 27 G تعلق على حقنة 1 مل، واستخدام إبرة الثانية لثقب جميع المسام الكبيرة. كرر لكل المبيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إجراءات الفم pipetting لالقياسية أو غيرها من وسائل تطلع البويضة، وجمع كل البويضات التي تحيط بها 2 أو أكثر من طبقات من الخلايا الركامية المدمجة. نقل وCOC إلى طبق جديد واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية إزالة الخلايا الركامية المحيطة المتكررة pipetting لطيف مع ماصة 1 مل تعيينها إلى حجم الطموح من 750 ميكرولتر. كرر الخطوة pipetting لحوالي 12 مرةوالسماح للبويضات لاسترداد لمدة 5 دقائق. تستمر بهذه الطريقة حتى كل أو قد أزيلت معظم الخلايا الركامية. نقل البويضات الجرداء إلى صحن ثقافة أخرى والسماح للتوازن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخصيص البويضات الجرداء إلى ثلاث مجموعات تجريبية لاستخدامها في: (ط) Microinjection من الرناوات siRNAs محددة مقابل هدف الفائدة، (ب) Microinjection من غير محددة (مراقبة) الرناوات siRNAs، و (ج) مجموعة غير حقن السيطرة لحساب شروط الثقافة. </li></ol> 3. سيت Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أطباق الثقافة مع 3 مل سائل الاعلام M2 تستكمل مع ميلرينون (1 ميكروغرام / مل) للبويضة microinjection. إعداد أطباق الثقافة التي تحتوي على MEM / BSA / ميلرينون لغسل والثقافة لاحقة من البويضات حقن. ملاحظة: M2 المتوسطة يحتوي HEPES العازلة ويتطلب قبل الاحترار عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تحت الظروف الجوية. يتطلب MEM ما قبل ارتفاع درجات الحرارة وموازنة باستخدام الغازات الطبية وصفهد أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد نظام microinjection. تحميل إبرة الحقن مع 5 ميكرولتر من 1 ميكرومتر حل سيرنا محددة. تأمين ماصة عقد وحقن إبرة لmicromanipulators النظام microinjection وانشاء وحدة حقن مع حجم والضغط معايرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 200 ميكرولتر الدقيقة قطرة من M2 وسائل الإعلام في الداخل غطاء صحن الثقافة 3 سم وإضافة بويضة لإعداد والمواءمة بين نظام microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام بويضة كدليل، وضبط مواقف القابضة وحقن الإبر. تطبيق الضغط السلبي على ماصة عقد لتأمين بلطف البويضة وضبط الموقف من إبرة الحقن على أوسع قطر للخلية. ضبط الإعدادات لتسمح Microinjection من حوالي 10 رر من الحل سيرنا في أي مكان في سيتوبلازم البويضة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53586/53586fig1.jpg" /> تعيين الرقم 1. البويضة microinjection تصل. ( <stroنانوغرام&gt; أ) صورة الممثل من 200 ميكرولتر الدقيقة قطرة من M2 وسائل الاعلام وضعت على غطاء من صحن الثقافة 3 سم، مع ماصة عقد وحقن الإبرة وضعه على اليسار واليمين، على التوالي. (B) مجموعة من الطور الأول-I اعتقال البويضات (GV-المرحلة) قبل microinjection. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53586/53586fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة غطاء لمرحلة stereomicroscope وإضافة 200 ميكرولتر الدقيقة قطرة من وسائل الاعلام M2 الطازجة. إضافة مجموعة من البويضات (~ 10) إلى الانخفاض الجزئي من قبل pipetting الفم، أو الطرق البديلة، ثم يعود الغطاء مع انخفاض الصغير إلى مرحلة microinjection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى microinject البويضات الفردية. تأمين بويضة واحدة مع ماصة عقد، تضاف ببطء غيض من إبرة الحقن في السيتوبلازم وطرد حجم الحقن من حل سيرنا. سحب بعناية إبرة الحقن ومولقد البويضة المحقونة إلى موضع في الجزء السفلي من الهبوط الجزئي. نقل البويضات حقن دون جدوى لوضع في الجزء العلوي من الانخفاض الجزئي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الإجراء microinjection مع كل بويضة. للحفاظ على أفضل قابلية البويضة، microinject سوى عدد قليل من البويضات في كل مرة. تأكد من أن هذه العملية لا تستغرق أكثر من بضع دقائق لمنع درجة الحرارة ودرجة الحموضة التغييرات في الانخفاض الجزئي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح حقن بنجاح البويضات أو نقل بعناية غطاء مع انخفاض الصغير من البويضات حقن لstereomicroscope. نقل البويضات القابلة للحياة حقن من قبل pipetting الفم أو طرق بديلة، إلى ذاكرة / BSA / ميلرينون المتوسطة لغسل وتتوازن عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجموعة أخرى من البويضات، كرر العملية microinjection مع إبرة حقن جديدة محملة الرناوات siRNAs غير محددة لمجموعة المراقبة. غسل البويضات في MEM / BSA / ميلرينون ونقل إلى صحن الثقافة منفصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة جميع فئاتالبويضات لمدة 24 ساعة في MEM / BSA / ميلرينون عند 37 درجة مئوية تحت جو من الغاز الطبي. ملاحظة: مطلوب &quot;كتلة ميلرينون&quot; فترة ثقافة للهدف كفاءة نضوب مرنا / البروتين. </li></ol> 4. سيت الثقافة للنضوج الانتصافي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DAY 4: لكل المجموعة التجريبية البويضات انشاء 4 أطباق الثقافة (35 ملم) مع 3 مل MEM / BSA. تكملة طبق وسائل الإعلام واحد لكل مجموعة مع 10٪ (جودة عالية) مصل بقري جنيني (FBS) لاستخدامه في نضوج البويضة. السماح لجميع الأطباق الثقافة لكي تتوازن عند 37 درجة مئوية مع خليط الغازات الطبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إطلاق سراح البويضات من &quot;كتلة ميلرينون، بالتتابع غسل البويضات ثلاث مرات في الأطباق التي تحتوي على MEM / BSA ومن ثم نقل البويضات إلى الطبق النضج تحتوي على وسائل الإعلام مع 10٪ FBS. ثقافة جميع الفئات البويضة لمدة 17 ساعة على 37 درجة مئوية، لتمكين استئناف وتطور الانقسام الاختزالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DAY 5: إعداد الحلول لبويضة fixaنشوئها، بما في ذلك: (ط) بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في المخزن بيم (100 أنابيب ملي [الرقم الهيدروجيني 6،9]، 1 ملم MgCl 2، 1 ملم EGTA) مع 0.5٪ تريتون-X 100، و (ثانيا) تستكمل برنامج تلفزيوني مع 5 FBS٪ التي سيتم استخدامها لغسل ومنع البويضات. ملاحظة: تتطلب هذه الحلول الاحترار مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل البويضة التثبيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتثبيت البويضة (بعد ثقافة 17 ساعة)، بسرعة نقل كل مجموعة التجريبية من البويضات قبل pipetting الفم أو الأساليب البديلة في الآبار الفردية (طبق 4 جيدا) التي تحتوي على 750 ميكرولتر من قبل حرارة 4٪ PFA حل واحتضان عند 37 ° C لمدة 1 ساعة. بعد ذلك يغسل كل مجموعة من البويضات 3 مرات (15 دقيقة لكل منهما) في 750 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني قبل تحسنت تحتوي على 5٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البويضات كتلة في 200 ميكرولتر PBS / 5٪ FBS O / N عند 4 درجات مئوية للحد من الأجسام المضادة غير محددة ملزمة. </li></ol> 5. تحليل المناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DAY 6: يتم المناعية في لوحة متعددة جيدا وشركة النفط العمانية: مذكرةيتم نقل ytes متسلسل إلى الآبار متتابعة، التي تحتوي على حلول الأجسام المضادة وغسل منها. إما 48 أو 96-جيدا لوحات يمكن استخدامها، ببساطة ضبط حجم حل يقوم على حجم جيد. لوحات 96-جيدا استخدام 200 ميكرولتر لكل بئر. يتم نقل البويضات إلى حلول مختلفة في الترتيب التالي: حل الأجسام المضادة الأولية - 3 آبار غسل - حل الضد الثانوية - 3 آبار غسل. للحد من التعرض للضوء لوحة يمكن تغطيتها بورق. إعداد الطازجة PBS / 5٪ FBS واستخدام هذا الحل لإعداد التخفيفات الأجسام المضادة (مثل أرنب المضادة للpericentrin (1/1000)، والماوس مكافحة تويولين (1/1000)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البويضات ثابتة من كل مجموعة التجريبية لالآبار الفردية التي تحتوي على 200 ميكرولتر (أو 100 ميكرولتر، إذا كانت هناك رغبة أقل حدة التخزين) من حل الأجسام المضادة الأولية وتغطية البئر مع parafilm. احتضان وفقا لشروط محددة الضد الأمثل (على سبيل المثال، 37 ° C لمدة 1 ساعة أو 4 درجات CO / N). ملاحظة: dilutio الأجسام المضادة الأوليةن وكذلك فترة حضانة معينة ودرجة الحرارة يتطلب اختبار لتحديد الظروف المثلى لالأجسام المضادة المختلفة المستخدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية، وغسل البويضات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني / 5٪ FBS (10-15 دقيقة لكل منهما). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البويضات في محلول يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية fluorescently مترافق (على سبيل المثال، 1/1000 تخفيف المضادة للأرنب ومكافحة فأر الأجسام المضادة مترافق مع fluorochromes من أطوال موجية مختلفة). احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل البويضات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني / 5٪ FBS (10-15 دقيقة لكل منهما). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الخطوة غسل النهائي، ونقل البويضات على شريحة زجاجية نظيفة بلطف ونضح أي حل غسل الزائد. وهذا لشل حركة البويضات على سطح الزجاج. إضافة 8 ميكرولتر من تصاعد وسائل الإعلام (التي تحتوي على دابي) وتراكب بعناية وسائل الإعلام المتصاعدة مع 22 مم × 22 مم زلة تغطية. خفض ساترة ببطء لتجنب احتباس فقاعات الهواء و / أو إتلاف البويضات. ملاحظة: بدلا من ذلك، للحفاظ على الممتلكات 3-dimentional من بويضة للتحليل المجهري متحد البؤر، إضافة كمية صغيرة من 100 الخرز الزجاجي ميكرون (مختلطة مع الفازلين) إلى زوايا من انزلاق الغطاء قبل تصاعد على الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر الشرائح في 4 درجات مئوية، أو الشروع في تقييم التقدم الانتصافي وكذلك تحليل مستويات التعبير والتحت خلوية البروتين توطين باستخدام المجهر مضان مجهزة مرشحات اللازمة لتتناسب مع الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة. </li></ol>

<ol>
	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li><li>Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+Centrioles+in+the+First+and+Second+Meiotic+Spindles+of+Mouse+Oocytes.">Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes.</a> J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).</li><li>Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+Reduction+During+Gametogenesis+and+Its+Significance.">Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance.</a> Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).</li><li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry.">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).</li><li>Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NEDD1+is+crucial+for+meiotic+spindle+stabilty+and+accurate+chromosome+segregation+in+mammalian+oocytes.">NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 339 (439-450), (2010).</li><li>Ma, W., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+pericentrin+in+mouse+oocytes+disrupts+microtubule+organizing+center+function+and+meiotic+spindle+organization.">Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization.</a> Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).</li><li>Bouniol-Baly, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Transcriptional+Activity+Associated+with+Chromatin+Configuration+in+Fully+Grown+Mouse+Germinal+Vesicle+Oocytes.">Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes.</a> Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).</li><li>De La Fuente, R., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Activity+of+the+Mouse+Oocyte+Genome:+Companion+Granulosa+Cells+Modulate+Transcription+and+Chromatin+Remodeling.">Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling.</a> Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).</li><li>Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPEB+phosphorylation+and+cytoplasmic+polyadenylation+are+catalyzed+by+the+kinase+IAK1/Eg2+in+maturing+mouse+oocytes.">CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes.</a> Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).</li><li>De La Fuente, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+in+the+germinal+vesicle+(GV)+of+mammalian+oocytes.">Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).</li><li>Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+with+gene+function+by+double-stranded+RNA+in+early+mouse+development.">Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development.</a> Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).</li><li>Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+reduction+of+dormant+maternal+mRNAs+in+mouse+oocytes+by+RNA+interference.">Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference.</a> Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).</li><li>Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renaissance+of+mammalian+endogenous+RNAi.">Renaissance of mammalian endogenous RNAi.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

في حين أن هناك أساليب متعددة لنقل خارجي حامض النووي في الخلايا الجسدية، مثل Electroporation للوترنسفكأيشن، microinjection هو الأسلوب الأمثل للتسليم من جزيئات الحمض النووي الريبي في البويضات الماوس هادئة transcriptionally. وينص البروتوكول الحالي نهج فعال لفي المختبر استنزاف من mRNAs م?...

الانقسام الاختزالي هو عملية تقسيم الفريدة التي تحدث في الأمشاج (البويضات والحيوانات المنوية) وينطوي على قسمين متتالية دون التدخل تخليق DNA لفصل الكروموزومات المتماثلة والصبغيات الشقيقة خلال الانقسام الاختزالي-I والانقسام الاختزالي الثاني على التوالي 1. أخطاء في كروموسوم العزل خلال الميتوزي في البويضات يمكن أن يؤدي إلى عدم توازن الصبغيات، وهي التي ورثها الجنين أثناء الإخصاب. ومن الجدير بالذكر أن حدوث عدم توازن الصبغيات في الأجنة النامية يزيد مع تقدم عمر الأم وسبب رئيسي من العيوب الخلقية، فضلا عن فقدان الحمل في النساء 1،2، وبالتالي، مما يؤكد حاجة مهمة لفهم الأساس الجزيئي لعدم توازن الصبغيات أثناء الانقسام الانتصافي . أثناء انقسام الخلية، الصبغي الفصل يعتمد بشكل حاسم على تجميع جهاز أنيبيب المغزل وإنشاء مستقرة التفاعلات كروموسوم أنيبيب لمرفق الصحيح لالمغزل المعاكسالقطبين. الأهم من ذلك، تشكيل المغزل الانتصافي في البويضات الثدييات يختلف من الانقسام في الخلايا الجسمية، وتنظمه مراكز تنظيم أنيبيب فريدة من نوعها (MTOCs) التي تفتقر centrioles 3،4. البروتينات الضرورية اللازمة لالتنوي أنيبيب وتنظيم توطين لMTOCs البويضة، بما في ذلك γ تويولين أن يحفز التجمع أنيبيب. بالإضافة إلى ذلك، pericentrin الوظائف باعتبارها بروتين السقالات الضروري، الذي يربط والمراسي γ تويولين فضلا عن عوامل أخرى في MTOCs 5. والجدير بالذكر أن تظهر دراستنا أن استنزاف من البروتينات الرئيسية MTOC المرتبطة يعطل منظمة المغزل الانتصافي ويؤدي إلى أخطاء كروموسوم الفصل في البويضات التي لم يتم حلها بشكل كامل من قبل حاجز الجمعية المغزل (SAC) 6،7. ولذلك، عيوب في الاستقرار المغزل، التي لا تؤدي إلى اعتقال الانتصافي، تشكل خطرا كبيرا في المساهمة في عدم توازن الصبغيات. وعلى الرغم من دورها الأساسي في التجمع المغزل والتنظيم، بروت البويضة MTOCتكوين عين وظيفة تزال غير مفهومة تماما. اختبار وظيفة البروتينات المستهدفة المحددة في البويضات الثدييات هي صعبة، إذ تصبح الخلايا هادئة transcriptionally قبل استئناف الانقسام الاختزالي 8،9 قريبا. وبالتالي، البويضات ما قبل التبويض تعتمد على مخازن مرنا الأمهات لاستئناف الانقسام الاختزالي ودعم الميتوزي فضلا عن الانقسامات انشقاق الأولى بعد الإخصاب 10،11. وراسخة فعالية تدخل الحمض النووي الريبي (رني) تدهور بوساطة من النصوص مرنا في البويضات الثدييات والرنا الأمهات تجنيدهم للترجمة خلال نضوج الانتصافي قابلة بشكل خاص لسيرنا استهداف 12-14. ولذلك، Microinjection من الرنا التدخل قصيرة (الرناوات siRNAs) إلى البويضات يوفر نهجا قيما لتستنزف من mRNAs المستهدفة للاختبار وظيفي. هنا، نحن تصف طرق لعزل البويضات الماوس واستنزاف بوساطة سيرنا من transcri محددةنقطة لاختبار وظيفة البروتين الضروري MTOC المصاحب، pericentrin. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف الظروف التحليل المناعي لتقييم تكوين المغزل الانتصافي في البويضات.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant Mare&#39;s Serum Gonadotropin (PMSG)</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>367222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium (MEM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>*Recipe outlined in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earle&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-7510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid, sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G, potassium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, disodium salt dihydrate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential Amino Acids (50x)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11130-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Mixture (100x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milrinone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmbryoMax M2 Media with Hepes</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MR-015-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNAs targeting Pericentrin</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>GS18541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control siRNAs&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>SI03650318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16% solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Pericentrin (rabbit)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated a-tubulin (mouse)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-6793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti -mouse Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Major Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (SMZ 800)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Fluorescent Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet Micro-injections System</td>
			<td>Eppenforf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro manipulators</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-injection needles (femtotips)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipettes (VacuTip)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm culture dishes</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 mm CA Filter System</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>430768</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

meiotic spindle assessment in mouse oocytes by sirna-mediated silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

يوفر Microinjection من الرناوات siRNAs نهج فعال لتدهور مرنا واستنزاف البروتين لاحق في البويضات، والتي تمكن الاختبارات الوظيفية بكفاءة ومحددة للغاية من العوامل المستهدفة المختلفة في المختبر. بعد ذلك، يتم استخدام المناعي للتحليل النمط الظاهري محدد وكذلك للتحقق من صحة اس?...

Watch this Scientific Journal Video about Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing at JoVE.com

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

هنا، نقدم بروتوكول معين استنزاف مرنا بوساطة سيرنا تليها التحليل المناعي لتقييم الجمعية المغزل الانتصافي والتنظيم في البويضات الماوس. هذا البروتوكول هو مناسبة لفي المختبر استنزاف النصوص والتقييم الوظيفي للمغزل مختلفة و / أو عوامل المرتبطة MTOC في البويضات.

تقييم المغزل الانتصافي في ماوس البويضات التي كتبها بوساطة سيرنا إسكات

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

meiotic-spindle-assessment-mouse-oocytes-sirna-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Views.  College of Veterinary Medicine, University of Georgia.  هنا، نقدم بروتوكول معين استنزاف مرنا بوساطة سيرنا تليها التحليل المناعي لتقييم الجمعية المغزل الانتصافي والتنظيم في البويضات الماوس. هذا البروتوكول هو مناسبة لفي المختبر استنزاف النصوص والتقييم الوظيفي للمغزل مختلفة و / أو عوامل ال?...

Video: Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

نقل النووي في البويضات ماوس

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

استرجاع البويضات ماوس

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

جمع والحفظ بالتبريد من البويضات والأجنة الهامستر ماوس

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

في الجسم الحي التصوير والعلاجات العلاجية في الفأر نموذج مثلي من سرطان المبيض

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

تدفق تنقية الخلوي للخلايا الفأر الانتصافي

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

يعيش التصوير الكالسيوم الخلية المشتركة مع وساطة سيرنا إسكات الجينات يحدد كا 2 + قنوات تسرب في غشاء ER وآلياتها التنظيمية

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

الأجرعية بوساطة الفيروسات إسكات الجينات المستحثة الفحص في القطن

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Previous studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells (ECs) survival, induced apoptotic cell death, a major obstacle in developing a cell culture system with prolonged ITSN-1s inhibition1. Using cationic liposomes as carriers, we explored the silencing of ITSN-1s gene in mouse lungs by systemic administration of siRNA targeting ITSN-1 gene (siRNAITSN). Cationic liposomes offer several advantages for siRNA delivery: safe with repeated dosing, nonimmunogenic, nontoxic, and easy to produce2. Liposomes performance and biological activity depend on their size, charge, lipid composition, stability, dose and route of administration3Here, efficient and specific KDITSN in mouse lungs has been obtained using a cholesterol and dimethyl dioctadecyl ammonium bromide combination. Intravenous delivery of siRNAITSN/cationic liposome complexes transiently knocked down ITSN-1s protein and mRNA in mouse lungs at day 3, which recovered after additional 3 days. Taking advantage of the cationic liposomes as a repeatable safe carrier, the study extended for 24 days. Thus, retro-orbital treatment with freshly generated complexes was administered every 3rd day, inducing sustained KDITSN throughout the study4. Mouse tissues collected at several time points post-siRNAITSN were subjected to electron microscopy (EM) analyses to evaluate the effects of chronic KDITSN, in lung endothelium. High-resolution EM imaging allowed us to evaluate the morphological changes caused by KDITSN in the lung vascular bed (i.e. disruption of the endothelial barrier, decreased number of caveolae and upregulation of alternative transport pathways), characteristics non-detectable by light microscopy. Overall these findings established an important role of ITSN-1s in the ECs function and lung homeostasis, while illustrating the effectiveness of siRNA-liposomes delivery in vivo.

Repeated retro-orbital injections of cationic liposomes/siRNA/ITSN-1s complexes in mice, every 72 hours for 24 days, efficiently deliver the siRNA duplex to the mouse lung microvasculature reducing ITSN-1s mRNA and protein expression by 75%. This technique is highly reproducible in an animal model, has no adverse effects and avoids fatalities.

إسكات طويلة الأجل من Intersectin-1S في الرئتين الماوس عن طريق المتكررة تسليم سيرنا محددة عبر الليبوزومات الموجبة. تقييم تأثيرات ضربة قاضية بواسطة المجهر الإلكتروني

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...