وأود أن أشكر DE الدكتور إخفاء Akutsu لتقاسم له NT الحيل والدكتور ستيفن وسوليفان غاريت Birkhoff لقراءة نقدية للبروتوكول.

التحضير : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن العثور على وصف تفصيلي لفرط الإباضة وmicrodrop ثقافة الجنين في مكان آخر 2. </li><li class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طبق بتري مع microdrops من مستنبت جنين (على سبيل المثال KSOM ، Chemicon). مع تغطية الزيوت المعدنية (وينبغي اختبار دفعات الزيوت المعدنية من أجل التوافق مع ثقافة الجنين). يوازن في 37 درجة مئوية في الهواء بالإضافة إلى 5 ٪ CO 2. (وفي الحرارية الكترون الحاضنة للمياه 3110 تغلف أو ما يعادلها) </li><li class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طبق لعزل البويضات : قطرات مكان hepes مخزنة CZB وهيالورونيداز (0.1 ٪ ث / ت ، سيجما) في نصف الطبق وHCZB في النصف الآخر. مع تغطية الزيوت المعدنية. الحفاظ على طبق الحارة على مرحلة ساخنة من مجهر تشريح. </li><li class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير المجهر : ضع ماصة بعقد القطر الخارجي للμ م حوالي 50 (أصغر قليلا من قطر البويضة) ، وفتح μ م حوالي 20 في حامل ماصة واحدة. ماصات عقد سهلة لجعل بالمعدات اللازمة ، ومجتذب إبرة (سوتر الآلات) وmicroforge (Narishige) ، ولكن يمكن أيضا أن تكون شراؤها من Humagen. تحميل 3-5 ل μ الزئبق في ذيل micropipette (الداخلية قطرها متر μ 8). تجنب تسرب الزئبق. إعداد الطبق مع قطرات صغيرة عدة في كل من 11 ٪ ث / ت PVP (بوفيدون) في HCZB و 5 μ غ / مل مثبط حركة الخلايا B في HCZB. استخدام غطاء طبق بيتري بدلا من الطبق نفسه غطاء لديه حافة القصير الذي لن تتدخل مع حركة عقد وماصات قلع. محاذاة ماصة عقد وقلع ماصة في انخفاض HCZB. نضح a HZCB قليلا الى غيض من ماصة القابضة. </li><li class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلايا المانحة يعتمد إلى حد كبير على نوع من الخلايا والتجربة المحقق تعتزم القيام بها. بصفة عامة ، ينبغي أن يعامل الخلايا المانحة مع انزيم بروتين مثل التربسين وأبقى على الجليد للحد من الالتصاق حتى نقلها. </li><li class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء إنسانية الفئران 14-15 بعد ساعات من إدارة قوات حرس السواحل الهايتية. ناقلة البيضات الحصاد وتشريح لها في قطرات HCZB - هيالورونيداز الدافئة. بعد تقريبا. 5 دقائق ، وسوف تكون حرة في الغالب البويضات من خلايا الركام. ثم ينبغي أن يكون غسلها عدة مرات في HCZB ، ثم غسلها مرة أخرى في قطرات KSOM قبل معايرتها ، ويوضع في الحاضنة حتى قلع. </li></ol> استئصال تتم المعالجات مع micromanipulators الهيدروليكية (Narishige) على مجهر مقلوب ، مثل TE200 نيكون. ويستخدم micromanipulator بيزو (Primetech) لحفر الشفافة زونا. ويمكن شراء شقة ذات الرؤوس وقلع ماصات نقل من Humagen. تنظيف وتليين ماصة قلع في قطرات PVP بطرد قطرات الزئبق المجهرية والشفط وطرد PVP. لمنع الالتصاق من الإبرة ، ينبغي أن يتم نفس الإجراء بين كل مجموعة من البويضات التي يتم منزوعة النواة أو نقلها. وضع مجموعة صغيرة من البويضات في الانخفاض B - HCZB مثبط حركة الخلايا. وينبغي تكييف حجم المجموعة إلى مستوى من الخبرة من المحقق. لا ينبغي أن تبقى البويضات على المسرح لمدة أطول من 20-30 دقيقة. نقل الصكوك إلى قطرات B - HCZB مثبط حركة الخلايا. ينبغي جلب ماصة عقد وماصة استئصال متماشيا مع الطائرة الاستوائية من البويضة. هذا لن يكون ممكنا إذا كان لديه عقد ماصة قطرها الخارجي أصغر قليلا من البويضة نفسها. تدوير بويضة حتى يمكن رؤية المغزل الطورية الانكسار مختلفة. إذا كان مبتدئا لا تستطيع رؤية المغزل ، ويمكن التعرف على لوحة الطورية باستخدام الحمض النووي هويشت الصبغة والإضاءة فوق البنفسجية ، مع ذلك ، أنه لا يتوافق مع التطور الجنيني كفاءة. موقف المغزل الطورية في 3:00 والاحتفاظ بها بشكل جيد مع ماصة القابضة. تطبيق البقول بيزو لاختراق الشفافة زونا. لوحة اللمس الطورية مع ماصة قلع. مرة واحدة يمكن أن تكون مقاومة المغزل الطورية &#39;شعر&#39; ، نضح المغزل وسحب الإبرة. السيتوبلازم البويضة هو السائل ، والمغزل الطورية التحركات ولكن كما أجمة عندما تطرق مع ماصة. في محاولة لتقليل كمية السيتوبلازم التي يتم إزالتها مع المغزل. بعد أن تم منزوعة النواة مجموعة من البويضات ، ويغسل لهم من خلال مستنبت جنين ووضعها في الحاضنة حتى نقلها. لا ينبغي أن بعض البويضات منزوعة النواة ولكن ينبغي أن يتم نقل وتفعيلها يكون بمثابة الرقابة لاستئصال. فإن هذه البويضات شظية في غضون عدة ساعات ، مشيرا إلى استئصال ناجحة. نقل النووي خلايا المكان الى حل PVP (11 ٪ في HCZB PVP). إذا كان كثير من الحيوانات المستنسخة القبض على خلية المرحلة 1 ، ينبغي خفض تركيز PVP إلى 5 ٪ أو أقل. خلايا المزيج جيدا الطرافةح PVP. تلتقط الخلايا مع ماصة مع القطر الداخلي أصغر قليلا من قطر الخلية. يجب على غشاء الخلية على كسر الطموح. في بعض الحالات ، يمكن استخدام طرد المتكررة والطموح فضلا عن تطبيق البقول بيزو لطيف لكسر الخلية المانحة. وينبغي بذل قطرة جديدة من الخلايا المانحة مع كل مجموعة من البويضات نقله ، والخلايا المانحة تصبح لزجة بعد بعض الوقت. حقن الخلايا المانحة بعد وقت قصير من كسر كسر الغشاء. لنقل ، والتركيز على متن الطائرة الاستوائية في البويضة نفسها بدلا من الطائرة الاستوائية من زونا الشفافة ، ونقل موقف وماصة عقد في نفس الطائرة. عقد البويضة بما في ذلك الجزء من السيتوبلازم لها بحزم. اختراق الشفافة زونا باستخدام نبضات بيزو. جعل النواة المانحة لغيض من ماصة ، ثم دفع غيض ماصة تقريبا إلى الجانب الآخر من بويضة منزوعة النواة ، على مقربة من ماصة عقد ، مما يجعل من ثلم في أعماق الخلية البيضية. نضح على كمية صغيرة جدا من السيتوبلازم البويضة في ماصة ، وتطبيق واحد بيزو نبض ضعيف لكسر غشاء البويضة ، إخراج النواة من الجهات المانحة ، وسحب الإبرة بسرعة بينما الشفط في غشاء هيولي في الطرف الأيمن من ثلم. في وقت واحد ، وسحب الإبرة والشفط ، وينبغي أن يكون من الممكن لإغلاق ثقب التي خلفها NT. وهذا الثقب إزالة &quot;تقنية تقليل عدد البويضات التي ليز خلال NT. غسل البويضات بناؤها في KSOM وإعادتها إلى حاضنة لساعات 1-3. تنشيط البويضة تعد واحدة من نصف الطبق مع قطرات من الكالسيوم MCZB مجانا والنصف الآخر مع قطرات من الكالسيوم MCZB مجانا زائد 2 + 10MM الأب و 5 μ غ / مل مثبط حركة الخلايا B لكبح القطبية قذف الجسم. يوازن لمدة 30 دقيقة. CO 2 أقل من 5 ٪ في الهواء. يغسل جيدا في الأجنة NT - MCZB الكالسيوم الحرة ومكان لهم بعد ذلك في مجموعات صغيرة في قطرات مختلفة من الكالسيوم MCZB الحرة. عودة الطبق إلى حاضنة والثقافة لمدة 5-6 ساعات. للسيطرة على تفعيل بروتوكول للظروف اصطناعية والثقافة الجنين ، يجب استخدام البويضات غير منزوعة النواة. كما ستعمل على تطوير الاجنة بكرية التوالد. بعد التنشيط ، وغسل الأجنة من خلال أجنة KSOM وضعها في الحاضنة لمدة طويلة الأجل الثقافة. وينبغي أن تكون مرئية Pronuclei في هذه المرحلة الزمنية ، مشيرا إلى نقل ناجحة. كتاب الطبخ الجنين الثقافة وسائل الإعلام سيد الأملاح تبدأ عالى النقاء 980 ​​مل O 2 H العقيمة في زجاجة 1 لتر إضافة مكونات الجافة : كلوريد الصوديوم 4760 ملغ (81mM) سيغما S - 5886 بوكل 360 ملغ (5mM) سيغما P - 5405 MgSO 4 • 7H 2 O 290 ملغ (1.18mM) سيغما M - 2773 KH 2 ص 160 4 ملغ (1.17mM) سيغما P - 5655 EDTA 2NA 40 ملغ (0.1mM) سيغما E - 6635 الجلوكوز (D) 1000 ملغ (و 5.5mm) سيغما G - 6152 إضافة مكونات السائل NA - اكتات (حمض اللبنيك) 5.3 مل &amp; نباهوجان ساماج ؛ سيغما 44263 Pen&#39;Strep 10 مل Gibco 15140-122 للاملاح ألبوم MCZB : فلتر تعقيم 500 مل أملاح الرئيسي (جيد لمدة 3-4 شهور ؛ المحل في 4 درجات مئوية) للاملاح ألبوم HCZB : تبدأ مع 500 مليلتر أملاح الرئيسية إضافة 50 ملغم PVA (البارد للذوبان ؛ سيغما P - 8136) يحرك المزيج لمدة 30-60 دقيقة ومعقمة تصفية (جيد لمدة 3 أشهر ؛ المحل في 4 درجات مئوية) كاليفورنيا + + الحرة MCZB (لتنشيط البويضات في 5 ٪ CO 2) تبدأ مع 99 مل من أملاح الأسهم MCZB إضافة مكونات الجافة : 211 ملغ 3 NaHCO سيغما S - 5761 NA - البيروفات (حمض البيروفيك) 3 ملغ سيغما P - 4562 الجلوتامين L - 15mg سيغما G - 8540 ألبومين المصل البقري (BSA) 500 ملغ سيغما A - 3311 تذوب جميع المكونات حتى دوامة ؛ تصفية العقيمة. HCZB (للالمجهرية في الغلاف الجوي المحيط) تبدأ مع 99 مل من أملاح الأسهم HCZB إضافة مكونات الجافة : Hepes - 520 ملغ نا سيغما H - 3784 NaHCO 3 42 ملغ سيغما S - 5761 إضافة مكونات السائل : 128 ملي CaCl 2 (18.8g / لتر) 1 مل سيغما C - 7902 ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.5 مع حمض الهيدروكلوريك N 1 دوامة حتى المنحل ؛ تصفية العقيمة.

<ol>
	<li>Eggan, K., Jaenisch, R., Pease, S., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches. , (2006).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R., Press, C. S. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo. , (2003).</li><li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei.">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394, 369-374 (1998).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

حظا سعيدا!

يرجى التحقق من التراكيب مخازن إضافية في إطار البروتوكول.

nuclear transfer into mouse oocytes

يمكن نقل النووي في بويضة غير مخصبة استعادة التنموية المحتملة للخلية متمايزة. هذا يدل على أن عمليات التنمية الأساسية ، والتمايز والشيخوخة هي اللاجينية بدلا من العمليات الجينية. على عكس هذه العمليات تفتح آفاقا مثيرة في البحوث الأساسية ، وأكثر في المستقبل البعيد ، في مجال الطب التجديدي. في الماوس ، يمكن اشتقاق خلايا جذعية جنينية من أجنة مستنسخة المرحلة سابق للانغراس. مثل الخلايا الجذعية الجنينية لديها القدرة على أن تؤدي إلى جميع أنواع الخلايا للكائن أخلاقي. الأهم من ذلك ، هذه الخلايا متطابقة وراثيا إلى الجهة المانحة. إذا كان ينطبق على الإنسان ، وهذا من شأنه أن يسمح للاشتقاق الخلايا الجذعية من المريض. ويمكن عندئذ أن تكون هذه الخلايا المتمايزة في نوع من الخلايا المتضررة للمريض ، ودرس في المختبر ، أو استخدامها لتحل محل الخلايا التالفة أو المفقودة. دراسة نقل النووي في الفأر لا يزال هاما لأنها يمكن أن تبلغنا عن مبادئ برمجة النووية. والمقصود من هذا الفيلم والبروتوكول المرافق له للمساعدة في تعلم نقل النووي في الفأر ، وهو أسلوب وضعت في البداية في مجموعة من Yanagimachi الأستاذ (اكاياما وآخرون 1998).

Watch this Scientific Journal Video about Nuclear Transfer into Mouse Oocytes at JoVE.com

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

والمقصود من هذا الفيلم والبروتوكول للمساعدة في نقل التعلم النووية.

نقل النووي في البويضات ماوس

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Research

JoVE Journal

Biology

17.7K Views.  Harvard. والمقصود من هذا الفيلم والبروتوكول للمساعدة في نقل التعلم النووية.

Video: Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

استرجاع البويضات ماوس

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection من البويضات المورق القيطم

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

جمع والحفظ بالتبريد من البويضات والأجنة الهامستر ماوس

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

تصور التعريب في الحمض النووي الريبي القيطم البويضات

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

تسميد البويضات القيطم باستخدام أسلوب نقل المضيف

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Direct Tracheal Instillation of Solutes into Mouse Lung

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs. This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the lung, and is therefore often incorporated in studies aimed at studying alveoli. We provide a detailed survival protocol for performing intratracheal instillations in mice. Using this approach, one can target delivery of test solutes or solids (such as lung therapeutics, surfactants, viruses, and small oligonucleotides) into the distal lung. Tracheal instillations may be the preferred methodology, over inhalation protocols that may primarily target the upper respiratory tract and possibly expose the investigator to potentially hazardous substances. Additionally, in using the tracheal instillation protocol, animals can fully recover from the non-invasive procedure. This allows for making subsequent physiological measurements on test animals, or reinstallation using the same animal. The amount of instillate introduced into the lung must be carefully determined and osmotically balanced to ensure animal recovery. Typically, 30-75 &mu;L instillate volume can be introduced into mouse lung.

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs. This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the lung, and is therefore often incorporated in studies aimed at studying alveoli. We provide a detailed survival protocol for performing intratracheal instillations in mice.

القصبة الهوائية التقطير المباشر للمواد المذابة في الرئة ماوس

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs.  This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

في الجسم الحي التصوير والعلاجات العلاجية في الفأر نموذج مثلي من سرطان المبيض

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

نقل الجينات في أجنة الدجاج أقدم من قبل<em&gt; OVO السابقين</em&gt; Electroporation

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model

The transfer of preimplantation embryos to a surrogate female is a required step for the production of genetically modified mice or to study the effects of epigenetic alterations originated during preimplantation development on subsequent fetal development and adult health. The use of an effective and consistent embryo transfer technique is crucial to enhance the generation of genetically modified animals and to determine the effect of different treatments on implantation rates and survival to term. Embryos at the blastocyst stage are usually transferred by uterine transfer, performing a puncture in the uterine wall to introduce the embryo manipulation pipette. The orifice performed in the uterus does not close after the pipette has been withdrawn, and the embryos can outflow to the abdominal cavity due to the positive pressure of the uterus. The puncture can also produce a hemorrhage that impairs implantation, blocks the transfer pipette and may affect embryo development, especially when embryos without zona are transferred. Consequently, this technique often results in very variable and overall low embryo survival rates. Avoiding these negative effects, utero-tubal embryo transfer take advantage of the utero-tubal junction as a natural barrier that impedes embryo outflow and avoid the puncture of the uterine wall. Vasectomized males are required for obtaining pseudopregnant recipients. A technique to perform vasectomy is described as a complement to the utero-tubal embryo transfer.

Utero-tubal embryo transfer uses the utero-tubal junction as a barrier to prevent the embryo outflow that may occur when performing uterine transfer. Vasectomized males are required to obtain pseudopregnant recipients for embryo transfer. Both techniques are discussed.

الرحم-البوقي نقل الأجنة وقطع القناة الدافقة في نموذج الفأر

The transfer of preimplantation embryos to a surrogate female is a required step for the production of genetically modified mice or to study the effects ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

قياس الحمض النووي من التلف وإصلاح في ماوس Splenocytes بعد المزمنة<em&gt; في فيفو</em&gt; التعرض لجرعات منخفضة جدا من بيتا وغاما والأشعة السينية

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...