نشكر مارك Terasaki الأولية للحصول على المشورة حول استخدام المجهر ثنائي الفوتون لخلق المحلية تلف الأنسجة ، وكاثي Joubin للحصول على المشورة بشأن تصاعد لمرور الزمن والتصوير ، ومختبرات وSagasti Portera كايلي مقابل المناقشات. وأجريت تجارب أولية مثل العشب زميل في مختبرات مؤسسة البيولوجية البحرية في وودز هول ، MA. وأيد العمل في المختبر Sagasti من المنح المقدمة من المؤسسة وايتهول ، ومؤسسة Klingenstein ، وشهادة بوروز صندوق ويلكوم جائزة في العلوم البيولوجية.

الجزء 1 : تركيب الأجنة الزرد لمدة طويلة الأجل التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 ٪ منخفضة للذوبان agarose حل التضمين. تذوب في الماء agarose DI عن طريق تسخين في الميكروويف ، قسامة في أنابيب صغيرة وتخزينها في كتلة التدفئة في 42 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الأجنة للتصوير وإزالة chorions عن طريق سحب بلطف بعيدا المشيماء بالملقط. يمكن وضع الأجنة في حل 5 ٪ في 22-24 قارعو الأجراس PTU التسميد آخر ساعة (HPF) لمنع تشكيل الصباغ. هذا يحسن من وضوح التصوير ، كما أنها ضرورية لأداء ثنائي الفوتون axotomies من محاور عصبية حسية. إذا سمح الصباغ الطبيعي للنموذج ، يحجب تألق ذاتي المحاوير على المجهر ثنائي الفوتون. قارعو الأجراس حل لالزرد تحتوي على 116 ملي كلوريد الصوديوم ، و 2.9 ملي بوكل ، 1.8 ملي CaCl 2 ، وHEPES 5mm ، و 7،2 درجة الحموضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الأجنة عن طريق إضافة ~ tricaine 0.02 ٪ لقارعو الأجراس PTU. جعل متأكد من الحيوانات لا تستجيب للمس قبل المتابعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد غرفة التصوير على المدى الطويل من خلال تطبيق الشحوم فراغ إلى جانب واحد من عصابة الزجاج أو التيفلون وتحديد وضعها على زجاج انزلاق الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جنين واحد الى حل agarose 42 درجة مع الماصة الزجاج ، مع الحرص على عدم نقل الكثير من PTU قارعو الأجراس ، ثم نقل الجنين مع قطرة واحدة من agarose على زلة تغطية المعدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموقف المطلوب الجنين مثل agarose يصلب. نضع في اعتبارنا أن غرفة التصوير انقلبت عند الانتهاء بحيث سيتم تغطية زلة السطح العلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان لديك مرحلة الآلية ويمكن أماكن متعددة في صورة واحدة ، كرر الخطوات من 1،4-1،6 لكل الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لترسيخ agarose تماما ، ثم ملء الحلبة مع 0.02 ٪ قارعو الأجراس PTU tricaine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الشحوم فراغ إلى الجانب الآخر من الحلبة (ق) ، ثم تغطية الحلقة (s) مع شريحة زجاجية. الوجه غرفة مغلقة (ق) انتهى. ويمكن استخدام هذه الغرف للتصوير على المجاهر رأسي أو مقلوب. </li></ol> الجزء 2 : اثنان الفوتون axotomy به العرف بنيت اثنين الفوتون المجهر مع ليزر الياقوت TI - الحرباء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستعداد للتصوير. وضع الجنين محمولة (ق) على حامل الشرائح تحت المجهر. التركيز على جنين واحد لتحقيق هدف المياه 40X (0.8 NA). بدوره على الليزر. كنا قادرين على تصور والضرر بتكاثر GFP معربا عن الخلايا العصبية باستخدام المعلمات التالية. لتصور المحاوير في السلطة غير الضارة ، وتعيين ليزر لطول موجة من 910 نانومتر (نانومتر) ، وقوة من 30 الميللي واط (MW المذكورة هي كمية الطاقة في العينة). افتح البرنامج التصوير. نحن نستخدم برامج ScanImage المتقدمة في مختبر كاريل سفوبودا في 2 و 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على التركيز على فحص الجنين مع ليزر ثنائي الفوتون ، موقع محوار كنت ترغب في axotomize ، والتقاط صورة من هذا المحور. علامة المواقف الأول والأخير Z ، والحصول على الصورة ، وجعل الحد الأقصى لإسقاط مداخن Z. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكبير 70X على فرع من محوار كنت ترغب في وقف axotomize والمسح الضوئي. زيادة ميغاواط في العينة إلى قوة مدمرة من 180 ميغاواط ، وإجراء فحص واحد مع الليزر. ونحن نفعل ذلك عن طريق تعيين عدد من شرائح الألف إلى الياء (1) والضغط على &quot;انتزاع&quot;. ينبغي أن يكون هذا كافيا لقطع المحور. انظر المناقشة عن طرق لتحسين هذا الإجراء المجهر الخاص والهدف التجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصغير ، والحد من الطاقة الى 30 ميغاواط ، والتقاط صورة. </li></ol> الجزء 3 : اثنان الفوتون axotomy على زايس مجهر 510 مبائر / اثنين الفوتون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شنت مكان الجنين على خشبة المسرح وجعله هدفا التركيز باستخدام المياه 25X أو موضوعية أخرى مناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على اثنين والفوتون (910 نانومتر) والأرجون (488 نانومتر) ليزر في محيط متعدد المسارات بحيث أنه من الممكن أن تتحول من واحدة إلى أخرى. على الرغم من أن تستخدم على حد سواء ليزر للكشف عن GFP ، انبعاث ثنائي الفوتون هو تصور مع الأحمر ، وانبعاث الليزر الاخضر مع الأرجون للتمييز بين البلدين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ليزر الأرجون لتحديد محور عصبي إلى إصابة. تحت إعدادات علامة Z المقاطع الأولى والأخيرة البصرية. التقاط صورة مبائر وخلق الحد الأقصى من الإسقاط المكدس Z. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار منطقة لتكون محور عصبي الجرحى وتقديم هذه المنطقة في التركيز. إيقاف ليزر الأرجون وتشغيل ليزر ثنائي الفوتون. فحص العينة مع الفوتون اثنين في كثافة الليزر انتقال ~ 9 ٪ للتأكد من أن محور عصبي لا يزال في التركيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;وقف&quot; الزر بحيث أداة المحاصيل ستكون متاحة. استخدام المحاصيل لزوم في مجال الاهتمام. نحن عادة لتقريب 70X ~ (يمكن التحقق من التكبير تحت علامة التبويب &quot;واسطة&quot;). تحت علامة التبويب &quot;قنوات&quot; تغيير شدة الفوتون اثنين من انتقال ~ 9 ٪ لنقل 15-20 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع محور عصبي تنشيط السريع &quot;XY&quot; الزر لحوالي 1 ثانية ، ثم اضغط على زر التوقف لتجنب الأضرار الزائدة. ينبغي أن ينظر إليه كما محوار الحطام المتناثرة إذا كان الإجراء يعمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضمان أن تكون محور عصبيولحقت أضرار التبديل إلى ليزر الأرجون 488 نانومتر ، والتقاط صورة أخرى مبائر ، وخلق توقعات الحد الأقصى. </li></ol> الجزء 4 : متحد البؤر الوقت الفاصل بين التصوير على زايس LSM 510 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستعداد للتصوير. إذا كنت تستخدم مرحلة ساخنة ، تأكد من تشغيله 30 دقيقة على الأقل قبل إعداد وقتك مرور الفيلم. وضع الجنين محمولة (ق) على حامل الشرائح تحت المجهر. التركيز على جنين واحد مع الهدف المنشود الهواء. نستخدم 20X وموضوعية NA 0.5. فتح زايس التصوير 510 LSM البرمجيات. بدوره على الليزر المناسب وإعداد التكوين المطلوب. الآن سنقوم بشرح مفصل لبروتوكول التصوير طويلة الأمد مع LSM زايس البرامج الزمنية المتعددة. ويمكن تكييف هذه الطرق للاستخدام على المجهر الخاصة بك مع برامج التصوير الخاصة بك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقف وتكوين الجنين الأولى في إطار موضوع التوقيت. فتح الفحص ، مرحلة ، ونوافذ متعددة من الزمن. تنشيط سريع الفحص على نافذة المسح الضوئي. الانتقال إلى مرحلة موقف XY المطلوب. علامة المواقف الأول والأخير Z في إطار الفحص. اضغط على التوقف ، ثم متوسط ​​، وأيضا في إطار الفحص. انتظر تفحص الشريحة Z المتوسطة وحتى النهاية ، ثم اضغط علامة الموقف في إطار المرحلة. إذا كنت واحدة فقط التصوير الجنين ، انقر على &quot;واحدة الموقع&quot; التبويب في إطار موضوع التوقيت. انقر على &quot;XYZ يستعاض عن عبارة&quot; ثم على &quot;حفظ التكوين&quot;. توافق عندما طلب منه الكتابة التكوين السابق. انتقل إلى الخطوة 4.4. إذا كان لديك مرحلة ميكانيكية ، يمكنك إعداد مواقع متعددة لصورة الأجنة المتعددة. في هذه الحالة ، يجب تحديد &quot;مواقع متعددة&quot; التبويب قبل تحديد XYZ والتكوين لموقعك الأول. أيضا ، تأكد من أن القائمة المنسدلة أسفل &quot;متعددة المواقع&quot; هو علامة على الموقع 1 ، وذلك في القائمة المنسدلة في القسم التكوين يقول متعددة في الموضع 1 ، قبل النقر على حفظ التكوين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقف وتكوين الأجنة المتبقية الخاص في إطار موضوع التوقيت. تحديد الجنين الخاص بك المقبل ، ثم اضغط على مسح سريع ونقل الى مرحلة الموقف XY المطلوب ، ووضع علامة مواقفكم Z الأولى والأخيرة في إطار الفحص. اضغط على التوقف ، ثم متوسط ​​، وأيضا في إطار الفحص. انتظر تفحص الشريحة Z المتوسطة وحتى النهاية ، ثم اضغط علامة الموقف في إطار المرحلة. انقر على &quot;XYZ استبدال&quot;. تأكد من أن القائمة المنسدلة أسفل &quot;مواقع متعددة&quot; علامة على الموقع 2 ، وذلك في القائمة المنسدلة في القسم التكوين المتعدد يقول الموضع 2 ، ثم انقر على &quot;حفظ التكوين&quot;. توافق عندما طلب منه الكتابة التكوين السابق. كرر هذه العملية لأجنة المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المعلمات من أجل الحصول على الصور في نافذة لوك موضوع. اختر الخيار GR - GL في المقطع &quot;قائمة كتل&quot; ، ثم أدخل الرقم المطلوب من التكرار المجموعة. هذا هو عدد المرات التي مبائر ستكتسب صورة في كل موقع. أدخل الفاصل الزمني المطلوب الانتظار في المقطع معلمات. هذا هو مقدار الوقت من بداية التصوير تكرار واحد لبدء تكرار المقبل. حدد &quot;ZStackXY&quot; في قسم التكوين. كنت أدخل قاعدة اسم الملف في الجزء السفلي. انقر على &quot;صورة DB حدد&quot; واختيار MDB الخاص بك. انقر على زر &quot;خيارات&quot;. حدد المجلد الخاص MDB لحفظ الملفات المؤقتة. الاختيار &quot;ابقاء الصورة النهائية مفتوحة&quot; ، &quot;حفظ الصورة النهائية&quot; ، و &quot;وسط كومة Z&quot;. حدد الفاصل الزمني الانتظار. انقر فوق موافق لإغلاق نافذة الخيارات. انقر على &quot;وقت البدء&quot;. ترك موضوع نافذة مفتوحة لمدة من الزمن من التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات الخاصة بك. عند تصوير مرور الزمن انتهى ، يقوم البرنامج من الزمن موضوع تجميع كافة الملفات المؤقتة في ملف ملخص عن كل موقع. إذا كنت ترغب في إيقاف الفيلم قبل أن يكتمل ، ومن المؤكد أن اضغط على &quot;إنهاء&quot; بدلا من &quot;إيقاف&quot; ، بحيث سيتم إنشاء ملف الموجزة. يجب أن تكون الملفات المؤقتة والملفات المحفوظة ملخص تلقائيا إلى مجلد MDB المعينة. LSM من القائمة البرامج ، انقر على &quot;عرض 3D&quot; ، ثم &quot;الإسقاط&quot;. مع ملف ملخص اخترتها في القائمة المنسدلة ، انقر على &quot;تطبيق&quot;. سوف تولد هذه التوقعات إلى أقصى حد من المكدس Z لكل صورة مبائر. LSM القائمة على البرامج ، انقر على &quot;ملف&quot; ، ثم &quot;تصدير&quot;. حفظ أقصى التوقعات على شكل سلسلة من الملفات TIF. يمكنك ثم إنشاء فيلم من سلسلة من الملفات باستخدام ImageJ TIF أو Pro كويك تايم. ويمكن إرجاع المحاوير في الصور LSM في ثلاثة أبعاد الصورة باستخدام برامج التحليل (مثل NeuroLucida من MicroBrightfield) لتوليد كمية من المعلومات المفصلة حول محوار التشكل. </li></ol> الجزء 5 : نتائج الممثل وهناك تجربة ناجحة يسفر عن تمثيل دقيق لديناميكية الخلويةق الانتعاش محوار من الاصابة. وسوف يكون لديك أجنة سليمة بعد التصوير ، مع عدم وجود انحطاط مرئية ونبضات قوية. ينبغي أن يؤدي إلى تلف axotomy دقيقة ، قطع فقط فرع محدد من محور عصبي. وينبغي أن يكون هناك أي ضرر يلحق المحاور المحيطة بها ، والحد الأدنى من موت الخلية. نعتقد أننا نرى الموت من خلية واحدة البشرة مباشرة عبر موقع axotomy في 50 ٪ ~ من التجارب. إذا كنت مراقبة المزيد من الضرر ، يجب تحسين بك بروتوكول ثنائي الفوتون كما هو موضح في المناقشة.

<ol>
	<li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors.">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Sacconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons.">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li><li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li><li>Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+laser+cellular+microsurgery.">Mechanisms of laser cellular microsurgery.</a> Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).</li></ol>

وقد استخدمنا الأساليب المذكورة على وجه التحديد axotomize المحاوير الحسية المحيطية ومراقبة مباشرة التجدد في الأجنة الحية الزرد. يمكن استخدامها على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير مبائر في الزرد لمراقبة العمليات التنموية كثيرة في الجسم الحي. يمكن تعديل هذا ال?...

two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

منذ فترة طويلة الزرد تستخدم لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية في التنمية من خلال الوقت الفاصل بين التصوير من الجنين شفافة المعيشة. نحن هنا وصف الأسلوب لجبل الأجنة الزرد لمدة طويلة الأجل التصوير وشرح كيفية أتمتة القبض على الوقت الفاصل بين الصور باستخدام المجهر مبائر. نحن تصف أيضا طريقة لخلق رقابة ، والضرر دقيقة لفروع الفردية المحاوير الحسي المحيطي في الزرد باستخدام القوة مركزة ليزر الفيمتو ثانية شنت على مجهر ثنائي الفوتون. يجب أن يكون الأمثل للمعلمات axotomy اثنين الفوتون ناجحة لكل المجهر. وسوف نظهر اثنين الفوتون axotomy على كل مجهر ثنائي الفوتون مخصص بنيت و510 زايس / مبائر ثنائي الفوتون لتقديم مثالين. يمكن أن الخلايا العصبية الحسية الزرد تصور ثلاثي التوائم في GFP خط المعدلة وراثيا معربا عن يقودها المروج الخلايا العصبية الحسية محددة 1. لقد تكيفنا هذا النموذج الثلاثي التوائم الزرد لمراقبة مباشرة الحسية التجدد محوار في العيش الأجنة الزرد. الأجنة تخدير tricaine مع وضعه داخل قطرة من agarose حيث يتصلب. ومختومة يجمد الأجنة داخل غرفة التصوير مليئة قارعو الأجراس (PTU) الفنيل. لقد وجدنا أن الأجنة يمكن تصويرها بشكل مستمر في هذه الغرف ل12-48 ساعة. ثم يتم التقاط صورة واحدة مبائر لتحديد الموقع المطلوب من axotomy. وتقع منطقة الفائدة على مجهر ثنائي الفوتون التصوير تحت محاور عصبية حسية منخفضة الطاقة غير المضرة. بعد التكبير على الموقع المطلوب من axotomy ، يزداد قوة وفحص واحد من تلك المنطقة التي تعرف ما يكفي لقطع محور عصبي. ثم يتم تعيين موقع متعددة الوقت الفاصل بين التصوير حتى على مبائر المجهر لمراقبة مباشرة محواري الانتعاش من الاصابة.

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos at JoVE.com

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

نحن هنا تصف طريقة لتركيب الأجنة الزرد لفترة طويلة الأجل والتصوير ، واثنين من الفوتون التصوير وتقنيات الأنسجة الضرر ، والوقت الفاصل بين التصوير مبائر.

ثنائي الفوتون axotomy والوقت الفاصل بين التصوير مبائر يعيش في الأجنة الزرد

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

two-photon-axotomy-time-lapse-confocal-imaging-live-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Views.  University of California, Los Angeles. نحن هنا تصف طريقة لتركيب الأجنة الزرد لفترة طويلة الأجل والتصوير ، واثنين من الفوتون التصوير وتقنيات الأنسجة الضرر ، والوقت الفاصل بين التصوير مبائر.

Video: Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

يعيش التصوير في القدرة على الحركة والهيكل الخلوي أكتين خلية من الخلايا العصبية الفردية والخلايا العصبية في الأجنة كريست اسماك الزرد

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

ثنائي الفوتون المستندة إلى تنشيط ضوئي في الأجنة الحية اسماك الزرد

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

زرع GFP - معربا عن Blastomeres للتصوير لايف التنمية الشبكية والدماغ في الجنين اسماك الزرد همي

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

متعدد الألوان الوقت الفاصل بين التصوير من اسماك الزرد المعدلة وراثيا : تصور الخلايا الجذعية الشبكية تفعيلها من خلال الخلية المستهدفة تذرية متعلق بالخلايا العصبية

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

استخدام الميكروسكوب الفاصل الزمني لتصور نقص الأكسجين الناجم عن تعطل الحركة في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; الأجنة

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

على المدى الطويل، عالية الدقة الفاصل الزمني متحد البؤر التصوير من<em&gt; الطفلق ل arabidopsis</em&gt; البشرة خلال إنبات

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...