تم تطوير أساليب التخصيب في المختبر وdiploids gynogenetic لالزرد ووكر Charline في مختبر جورج Streisinger في جامعة اوريجون في 1970s و 1980s. الطريقة الموضحة هنا هي من دون تغيير بروتوكولات Charline والتي تتوفر في كتاب الكامل في اسماك الزرد 3. تم تطوير أساليب التخصيب في المختبر وdiploids gynogenetic لالزرد ووكر Charline في مختبر جورج Streisinger في جامعة اوريجون في 1970s و 1980s. الطريقة الموضحة هنا هي من دون تغيير بروتوكولات Charline والتي تتوفر في كتاب الكامل في اسماك الزرد 3.

نظرة عامة على الضغط المبكر ملاحظة : وصفات للعديد من الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول مثل tricaine ، أسماك المياه المالحة ، وهانكس على شبكة الإنترنت في الفصل 10 من كتاب اسماك الزرد 3 ( <a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html</a> ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتاج أجنة التي التخصيب في المختبر باستخدام الحيوانات المنوية المعطل للأشعة فوق البنفسجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الفور نقل البويضات المخصبة إلى قارورة زجاجية (مع غطاء من البلاستيك المفاجئة) شغل حتى أسنانها مع الماء البيض. تغطية نهاية مفتوحة للفيال مع ورقة رقيقة من المطاط والمفاجئة الأعلى (الذي كان في قطع حفرة) على القارورة على المطاط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان القنينة في الصحافة الهيدروليكية وبمبلغ 1.4 دقيقة بعد الإخصاب زيادة الضغط على 8000 رطل (لاحظ أنه يتم معايرة مكابس عديدة لقراءة الضغوط التي تمارس على المكبس قطرها 2 بوصة ، ويجب أن يتم تحويلها إلى قراءات رطل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ في 6 دقائق بعد الإخصاب ، والإفراج عن الضغط تدريجيا على مدى فترة من 1 دقيقة. </li></ol> إجراءات تفصيلية الضغط المبكر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم من التجربة <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت متأخر بعد الظهر ، على أن تقلص منفصلة للذكور والإناث. ويمكن استخدام أي من الذكور منذ القديم انه لن تساهم المواد الجينية. وينبغي أن الإناث تبدو كبيرة والدهون في البطن. وينبغي أن ننظر الذكور الصفراء وشيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد الإناث والذكور بين عشية وضحاها على حدة في خزانات حيث يمكن الوصول إليها بسهولة في الصباح. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صباح التجربة <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد هانكس الحل ؛ إضافة بيكربونات الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديمهم للمنشأة السمكية : دلو الثلج ، هانكس ، Tricaine ، الموقت ، وأنابيب لجمع الحيوانات المنوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع Tricaine في أسماك المياه </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الحيوانات المنوية <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد قنينة حل واضح للهانكس على الجليد. أن تكون محشورة قياس ~ 50 ميكرولتر لكل من الذكور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير 3 أو 4 ذكور في وقت واحد عن طريق الغمر في tricaine. ويمكن رفعها من مخدر مع ملعقة من البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في أسماك المياه وصمة عار &quot;الرطب الجاف&quot; على منشفة ورقية (مهم جدا : الماء ينشط الحيوانات المنوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل الأسماك في حامل رغوة تحت stereomicroscope في التكبير المنخفضة مع البرنامج الموسع للتمنيع ، الإضاءة. فصل زعانف الحوض مع ملقط وموقف microcapillary في افتتاح مجرور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السكتة الدماغية جانبي السمك بلطف ولكن بحزم مع ملقط (ميليبور) على نحو سلس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما حليبي الحيوانات المنوية تخرج من مسام الأعضاء التناسلية ، وأنه جمع في microcapillary باستخدام الشفط لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع الحيوانات المنوية من الذكور في العديد من الجليد المالحة الباردة وهانك. الحيوانات المنوية من الذكور 50-10 كافية لتلقيح البيض عدة مئات. والحيوانات المنوية في لهانكس الباردة مواصلة تخصيب البيض بكفاءة لعدة ساعات أو حتى أيام. &quot;مقلة العين&quot; تركيز الحيوانات المنوية ، وجمع ما يكفي لجعل التعليق غائما. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأشعة فوق البنفسجية تعطيل الحيوانات المنوية <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الجزء السفلي من طبق بيتري الزجاج مع الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> watchglass وضع على رأس الجليد في الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة باستور ، ونقل الحيوانات المنوية من أنبوب الاختبار على وwatchglass. تأكد من الحصول على أكبر قدر من الحيوانات المنوية في ماصة ممكن دون تناول أي فقاعات من الهواء معها. أيضا ، لا فقاعة الحيوانات المنوية في watchglass كما كنت طردهم من ماصة. طرد الحيوانات المنوية في طبقة رقيقة حتى على الزجاج ووتش. تجاهل هذا ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع طبق بيتري الى رابط العرضي للأشعة فوق البنفسجية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على crosslinker لمدة 2 دقيقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة نظيفة وإزالة الحيوانات المنوية من watchglass وتحويلها إلى أنبوب إيبندورف ملحوظ الحيوانات المنوية للأشعة فوق البنفسجية ووضعت على الجليد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع البيض والإخصاب في المختبر <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير ثلاث أو أربع إناث في وقت tricaine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في أسماك المياه وصمة عار &quot;الرطب الجاف&quot; على منشفة ورقية. سوف تنتفخ المياه الزائدة من البيض ومنع الإخصاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضع الأنثى في طبق بتري 35 ملم مع البلاستيك والأصابع (وليس الرطب) رطب ، اضغط بلطف ولكن بحزم على البطن. إذا كانت مستعدة لوضع البيض ، وسوف يخرج بسهولة تامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع البيض مع ملعقة والعودة الأنثى في الماء. البيض الجيدة هي مصفر اللون الشفاف ، بينما البيض التي بقيت في الأنثى طويلة جدا من البيض والمائي (أنظر أدناه). لضمان الحصول على البيض جيدا ، وجمع منها خلال الساعات الأولى بعد 2 تتسلط الأضواء على منشأة في الأسماك. إبقاء البيض مغطاة لمنع جفاف التدريجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 30-50 ميكرولتر لتعليق الحيوانات المنوية للأشعة فوق البنفسجية إلى البيض ، ويحرك بلطف مع تلميح ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فوريلاي إضافة حوالي 1 مل من أسماك المياه وبدء الموقت. وغادر لوضع البيض عند هذه النقطة يكون haploids. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . الضغط المبكر ملاحظة : يجب أن يتم إنجاز خطوات خلال 90 ثانية AG التسميد! <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء الموقت في اللحظة التي يتم تفعيلها البيض عن طريق إضافة المياه </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر لحظات قليلة ، وإضافة المزيد من الماء ، ودوامة البيض إلى وسط الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة باستير قطع ومصقول ، ونقل البويضات المخصبة إلى قارورة الضغط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر ، إضافة المزيد من الماء إلى البيض قارورة بحيث تفيض تقريبا ، مما أسفر عن حبة من الماء في الشفة من قوارير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان بارز المطاط على حبة من المياه وتأمين غطاء من البلاستيك المطاط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان القنينة (ق) رأسا على عقب في الاسطوانة الضغط ، إضافة المزيد من الماء البيض لاعادة ملء الاسطوانة. وضعت على رأس الاسطوانة بشكل آمن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع اسطوانة في الصحافة مع ما يصل المكبس وتطبيق £ 8000 / متر مربع. في. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك اسطوانة في الصحافة حتى 6 دقائق بعد وقت التنشيط (لفترة ما مجموعه 4.5 دقيقة من الضغط). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 6 دقائق بعد التنشيط ، إزالة الاسطوانة من الصحافة ، وإزالة قارورة من الاسطوانة. الجافة بعناية قوارير لمنع تبريد للأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة الملء للاسطوانة والبيض مع الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير القنينات المقبل عن طريق ملء جزئيا لهم المياه البيض حسب الحاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار لجميع دفعات من البيض. </li></ol></li></ol> ملاحظة : الاسطوانة سوف يعقد ما يصل الى 3 قوارير في وقت واحد ، لذا قد تحتاج إلى تأخير تلقيح البيض بضع دقائق لمعرفة ما إذا كان بالفعل الأخريات في tricaine إعطاء البيض. وهذا سيساعد على تسريع الأمور أكثر من خلال معالجة دفعات في وقت واحد. أيضا ، تذكر مرة واحدة يتم استخدام الصحافة لا تضع أي المزيد من السمك في tricaine حتى يتم الانتهاء من العلاج. السماح الأسماك على البقاء في التخدير وقتا طويلا ويمكن قتلهم. ثانيا ، إذا كنت ضغط الأسماك في حين يتم استخدام الصحافة ، والحصول على البيض ، فإنها قد تكون جافة جدا لتكون مجدية في الوقت الذي يمكن استخدامه للصحافة مرة أخرى.

<ol>
	<li>Streisinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+analyses+and+gene-centromere+distances+in+zebrafish.">Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish.</a> Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).</li><li>Streisinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half-tetrad+analysis+in+zebrafish:+mapping+the+ros+mutation+and+the+centromere+of+linkage+group+I.">Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I.</a> Genetics. 139 (4), 1727-1727 (1995).</li><li>Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+pressure+screens.">Early pressure screens.</a> Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).</li><li>Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromere-linkage+analysis+and+consolidation+of+the+zebrafish+genetic+map.">Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map.</a> Genetics. 142 (4), 1277-1277 (1996).</li><li>Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+mutants+with+disrupted+early+T-cell+and+thymus+development+identified+in+early+pressure+screen.">Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen.</a> Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).</li></ol>

فمن المهم للتأكد من أن الأجنة التي تنتجها هذه الطريقة هي diploids gynogenetic صحيحا. والضوابط ، وتوليد مخلب مضاعفا من البيض العادي (عن طريق الحفاظ على ادخار بعض الحيوانات المنوية دون تعطيل الأشعة فوق البنفسجية) ومجموعة من الأجنة فرداني (عن طريق الحفاظ على مخلب جانبا من البويضا...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tricaine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Watch glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>French Press</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pressure cylinder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Instant ocean</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cut off the narrow end, fire polish</td>
</tr>
<tr>
<td>UV cross-linker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microcapillaries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

making gynogenetic diploid zebrafish by early pressure

تغاير الزيجوت في حقيقيات النوى مضاعفا كثيرا ما يجعل الدراسات الجينية مرهقة. الأساليب التي تنتج ذرية صالحة ضعفاني متماثل مباشرة من الإناث متخالف يسمح فحص الإناث mutagenized F1 مباشرة عن الطفرات الضارة في الشاشة تسارع الوراثية إلى الأمام. Streisinger وآخرون.<sup&gt; 1،2</supوصف&gt; طرق لجعل gynogenetic الزرد مضاعفا (متماثل) من خلال تفعيل البيض الزرد مع الحيوانات المنوية للضوء الأشعة فوق البنفسجية ومنع المعطل إما الانتصافي الثانية أو الدرجة الاولى لاقحي الخلية باستخدام العلاجات الفيزيائية (الحرارة أو الضغط) التي ميكروتثبول deploymerize. &quot;الضغط المبكر&quot; (EP) كتل الأسلوب الثاني الانقسام المنصف ، والذي يحدث بعد فترة قصيرة من الإخصاب. الطريقة EP تنتج نسبة عالية من أجنة قابلة للحياة التي يمكن أن تتطور إلى البالغين خصبة من كلا الجنسين. الأسلوب يولد الأجنة التي يتم متماثل في جميع مواضع باستثناء تلك التي تم فصلها عن السنترومير من خلال إعادة التركيب خلال الانقسام الاختزالي أولا يتم الكشف عن طفرات متماثل الجينات في براثن EP ما بين 50 ٪ للمواضع القسيم المركزي ، وأقل من 1 ٪ لمواضع telomeric. ويرد هذا الأسلوب حرفيا من كتاب اسماك الزرد<sup&gt; 3</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure at JoVE.com

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

هذا هو أسلوب لتوليد اجنة gynogenetic الزرد مضاعفا (الأجنة التي الوراثية فقط المساهمة يأتي من الأم) من خلال منع الانتصافي الدرجة الثانية مباشرة بعد التسميد مع الحيوانات المنوية للضوء فوق البنفسجي المعطل. EP الأجنة ليست متماثلة اللواقح تماما بسبب إعادة التركيب خلال تقسيم الانتصافي الأولى ، ومع ذلك فهي متماثل في جميع مواضع التي لم يتم فصلها عن السنترومير من خلال إعادة التركيب.

جعل Gynogenetic اسماك الزرد ضعفاني بواسطة الضغط المبكر

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

making-gynogenetic-diploid-zebrafish-by-early-pressure

Research

JoVE Journal

Biology

13.4K Views.  University of Oregon. هذا هو أسلوب لتوليد اجنة gynogenetic الزرد مضاعفا (الأجنة التي الوراثية فقط المساهمة يأتي من الأم) من خلال منع الانتصافي الدرجة الثانية مباشرة بعد التسميد مع الحيوانات المنوية للضوء فوق البنفسجي المعطل. EP الأجنة ليست متماثلة اللواقح تماما بسبب إعادة التركيب خلال تقس...

Video: Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1. To achieve this goal 6-10 systematic sections should be probed covering the entire structure. Typically this involves processing 1/5 sections which leaves a significant amount of material unprocessed. In order to maximize the material, we propose an inexpensive method for preserving fixed tissue as part of a long-term storage research plan. As tissue is sliced and processed for the desired stain or antibody, alternate sections should be systematically placed in antigen preserve at -20&deg;C for future processing. Using 24-well plates, sections can be placed in order for future retrieval. Using this method, tissue can be stored and processed for immunohistochemistry over the course of years.

Brain banking and systematic sampling of biological material provides the basis for unbiased stereology and maximizes the potential data obtained from each specimen.

الخدمات المصرفية للدماغ : جعل معظم العينات بحوث الخاص

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1.  To ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

توليد الأجنة اسماك الزرد همي بواسطة زرع

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

الضغط الجوي التصوير الجزيئي من الأنسجة البيولوجية والأغشية الحيوية التي LAESI طيف الكتلة

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

التحليل المباشر للخلايا واحدة بواسطة الطيف الكتلي في الضغط الجوي

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Glycans التصوير في الأجنة التي وصفها اسماك الزرد الاستقلابية والكيمياء Bioorthogonal انقر

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

في الجسم الحي من Electroporation Morpholinos في شبكية العين اسماك الزرد الكبار

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

إنتاج فرداني الزرد الأجنة عن طريق<em&gt; في المختبر</em&gt; التسميد

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

برازي تحليل جلايكورتيكود: رصد الغدة الكظرية غير الغازية في الخيليات

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...