שיטות הפריה חוץ גופית ו diploids gynogenetic פותחו על ידי דג הזברה Charline ווקר במעבדה של ג&#39;ורג&#39; Streisinger באוניברסיטת אורגון ב -1970 ו -1980. השיטה המתוארת כאן היא ללא שינוי לעומת פרוטוקולים של Charline אשר זמינים במלואם בספר דג הזברה 3. שיטות הפריה חוץ גופית ו diploids gynogenetic פותחו על ידי דג הזברה Charline ווקר במעבדה של ג&#39;ורג&#39; Streisinger באוניברסיטת אורגון ב -1970 ו -1980. השיטה המתוארת כאן היא ללא שינוי לעומת פרוטוקולים של Charline אשר זמינים במלואם בספר דג הזברה 3.

סקירה כללית של לחץ מוקדם הערה: מתכונים רבים של חומרים כימיים המשמשים פרוטוקול זה כמו tricaine מים, דגים מלוחים הנקס זמינים באופן מקוון בפרק 10 של הספר דג הזברה 3 ( <a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html</a> ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצרת העוברים על ידי הפריה חוץ גופית באמצעות זרע מומת UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר את הביציות המופרות כדי בקבוקון זכוכית (עם כובע הצמד פלסטיק) מלאה עד גדותיה במים ביצה. מכסים את הקצה הפתוח של הבקבוקון עם סדין דק של לטקס גומי הצמד העליון (שלתוכו חור נחתך) על הבקבוקון על הגומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הבקבוקון בעיתונות הידראולי ב 1.4 דקות לאחר ההפריה להעלות את הלחץ 8,000 psi (שים לב לוחץ רבים מכוילים לקרוא את הלחץ המופעל על בוכנה 2 אינץ&#39; קוטר, וקריאה חייב להיות מומר psi) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בשעה 6 דקות לאחר ההפריה, בהדרגה לשחרר את הלחץ על פני תקופה של דקות 1. </li></ol> בתחילת הליך מפורט לחץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני הניסוי <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעות אחר הצהריים המאוחרות, זכרים ונקבות נפרדים להיות לחצה. כל בן זכר יכול לשמש מאז הוא לא יהיה תורם החומר הגנטי. נקבות צריך להיראות גדולים שומן בבטן. זכרים צריך להיראות צהוב מלא חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק נשים וגברים לילה בנפרד מחזיק טנקים שבו הם יכולים לגשת בקלות בבוקר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בוקר של הניסוי <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון הנקס; להוסיף סודיום ביקרבונט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מביאים מתקן דגים: דלי קרח, הנקס, Tricaine, טיימר, שפופרות לאיסוף הזרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Tricaine מדולל במים דגים </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף הזרע <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת בקבוקון ברורה של פתרון הנקס על הקרח. מדוד ~ 50 μl לכל זכר להתמצות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי 3 או 4 גברים בכל פעם על ידי טבילה tricaine. הם יכולים להיות הרים מתוך ההרדמה בכפית פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף במים דגים כתם &quot;רטוב יבש&quot; על מגבת נייר (חשוב מאוד: מפעיל זרע מים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר דג בעל קצף תחת stereomicroscope בהגדלה נמוכה עם עלית תאורה. הפרד את סנפירי גחון עם מלקחיים בעמדה microcapillary בפתיחת הביב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבץ את הצדדים של הדג בעדינות אך בתקיפות עם חלקה (Millipore) מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו זרע חלבי לצאת נקבובית המין, לאסוף אותו microcapillary באמצעות שאיבה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת זרע מהזכרים מספר מלוחים קר כקרח של האנק. זרע מהזכרים 50-10 היא נאותה להפריה של כמה מאות ביצים. הזרע בקור של הנקס ימשיך להפרות ביציות ביעילות במשך כמה שעות או אפילו ימים. &quot;גלגל העין&quot; ריכוז הזרע, איסוף מספיק כדי לעשות השעיה מעונן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> UV להשבית זרע <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את תחתית צלחת פטרי כוס עם קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים watchglass על גבי קרח בצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר, להעביר את הזרע במבחנה על watchglass. הקפידו להגיע כמה שיותר הזרע לתוך פיפטה ככל האפשר בלי לקחת את כל בועות האוויר עם זה. כמו כן, אין בועת זרע watchglass כפי שאתה לגרש אותם מן פיפטה. לגרש הזרע שכבה דקה אפילו, על זכוכית השעון. לבטל את זה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת פטרי לתוך UV צולבות linker </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל crosslinker 2 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה CLEAN, להסיר את זרע watchglass ולהעביר אותו צינור הזרע Eppendorf מסומן מקום UV ו על הקרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף ביצה הפריה במבחנה <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי שלוש או ארבע נקבות בכל פעם tricaine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף במים דגים כתם &quot;רטוב יבש&quot; על מגבת נייר. עודף מים יתנפחו את הביצים למנוע הפריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום הנשי צלחת פלסטיק 35 מ&quot;מ פטרי עם לחה) לא רטובה (אצבעות, לחצו בעדינות אך בתקיפות על הבטן. אם היא מוכנה להטיל ביצים, הם ייצאו די בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הביצים עם מרית וחוזרים הנשי למים. ביצים טובות הן בצבע צהבהב, שקוף, בעוד הביצים נשארו הנקבה יותר מדי זמן לבנות ומימיות (ראה להלן). כדי להבטיח מקבל ביצים טוב, לאסוף אותם במהלך 2 השעות הראשונות לאחר האורות לבוא במתקן דגים. שמור על הביצים מכוסה כדי למנוע ייבוש החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30-50 μl של ההשעיה זרע UV על הביצים, מערבבים בעדינות עם קצה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מידיly להוסיף כ - 1 מ&quot;ל של מים ודגים ולהתחיל טיימר. ביצים שמאל לפתח בשלב זה יהיה haploids. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . הלחץ מוקדם הערה: צעדים AG חייב להתבצע בתוך 90 שניות של הפריה! <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת טיימר באותו רגע ביצים מופעלים על ידי תוספת של מים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכו כמה דקות ומוסיפים עוד מים, לערבל את הביצים במרכז המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש חתוכים ומלוטשים פיפטה פסטר, להעביר את הביציות המופרות על צלוחיות הלחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך, מוסיפים מים ביצה יותר מבחנות, כך הם כמעט עולה על גדותיו, משאיר טיפה של מים על שפת צלוחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים על גבי גומי חרוז מים לאבטח את מכסה הפלסטיק מעל הגומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הבקבוקון (ים) במהופך בצילינדר בלחץ, הוספת מים ביצה יותר כדי למלא את המיכל. שים את הדף על הגליל מאובטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את גליל בעיתונות עם הבוכנה מעלה להחיל £ 8,000 / מ&quot;ר. פנימה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את גליל בעיתונות עד 6 דקות אחרי זמן ההפעלה (זמן כולל של 4.5 דקות של לחץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעה 6 דקות לאחר ההפעלה, להסיר את גליל מהעיתונות, ולהסיר את בקבוקוני מהגליל. בזהירות לייבש את בקבוקוני כדי למנוע קירור של העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איפוס גליל ולמלא אותה במים ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את בקבוקוני הבא חלקית על ידי מילוי אותם עם מים ביצה לפי הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור לכל קבוצות של ביצים. </li></ol></li></ol> הערה: גליל תקיים עד 3 מבחנות בכל פעם, כך שאולי תרצה לדחות את ההפריה של הביצים כמה דקות כדי לראות אם נקבות אחרות כבר tricaine לתת ביצים. זה יעזור לזרז את הדברים על ידי טיפול בקבוצות יותר בבת אחת. כמו כן, זוכר שפעם העיתונות נמצא בשימוש, לא לשים דגים יותר tricaine עד השלמת הטיפול. מתן דגים להישאר ההרדמה יותר מדי זמן יכול להרוג אותם. שנית, אם אתה לסחוט דגים ואילו העיתונות נמצאת בשימוש, ולקבל ביצים, הם עשויים להיות יבשים מדי כדי להיות בת קיימא עד שהעיתונות ניתן להשתמש שוב.

<ol>
	<li>Streisinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+analyses+and+gene-centromere+distances+in+zebrafish.">Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish.</a> Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).</li><li>Streisinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half-tetrad+analysis+in+zebrafish:+mapping+the+ros+mutation+and+the+centromere+of+linkage+group+I.">Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I.</a> Genetics. 139 (4), 1727-1727 (1995).</li><li>Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+pressure+screens.">Early pressure screens.</a> Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).</li><li>Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromere-linkage+analysis+and+consolidation+of+the+zebrafish+genetic+map.">Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map.</a> Genetics. 142 (4), 1277-1277 (1996).</li><li>Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+mutants+with+disrupted+early+T-cell+and+thymus+development+identified+in+early+pressure+screen.">Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen.</a> Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).</li></ol>

חשוב לוודא כי עוברי המיוצר על ידי שיטה זו diploids gynogenetic נכון. כמו שולטת, ליצור מקבץ הביצים דיפלואידי נורמלי (על ידי שמירה על הצידה כמה זרע ללא איון-UV) ואת המצמד של עוברים הפלואידים (על ידי שמירה בצד מקבץ של ביציות מופרות עם זרע UV מבלי לעבור דרך ההליך EP). ב 1 הודעה יום עוברים ?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tricaine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Watch glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>French Press</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pressure cylinder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Instant ocean</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cut off the narrow end, fire polish</td>
</tr>
<tr>
<td>UV cross-linker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microcapillaries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

making gynogenetic diploid zebrafish by early pressure

Heterozygosity אאוקריוטים דיפלואידי לעתים קרובות גורם מחקרים גנטיים מסורבלת. שיטות המייצרים דיפלואידי קיימא צאצאים הומוזיגוטים ישירות מן הנקבות הטרוזיגוטיים לאפשר לנשים mutagenized F1 כדי להיות מוקרן ישירות למסך גנטי קדימה מואצת מוטציות מזיקות. Streisinger et al.<sup&gt; 1,2</sup&gt; תיאר שיטות להכנת gynogenetic (הומוזיגוטים) דג הזברה דיפלואידי ידי הפעלת ביצי דג הזברה עם זרע אור אולטרה סגול מומת ומניעת גם את meiotic השני או הדיוויזיה הראשונה תא zygotic באמצעות טיפולים פיזיים (חום או לחץ) כי microtubules deploymerize. &quot;הלחץ מוקדם&quot; (EP) בלוקים השיטה השנייה המיוזה, אשר מתרחשת זמן קצר לאחר ההפריה. השיטה EP מייצרת אחוז גבוה של עוברים קיימא שיכול להתפתח למבוגרים פורה משני המינים. השיטה יוצרת בעוברים שהם הומוזיגוטים בכל לוקוסים למעט אלה הופרדו centromere שלהם על ידי רקומבינציה במהלך המיוזה הראשונה מוטציות הומוזיגוטים מזוהים ב מצמדים EP בבית בין 50% ל לוקוסים centromeric ופחות מ -1% עבור לוקוסים telomeric. שיטה זו היא להעתיק מילה במילה מתוך הספר דג הזברה<sup&gt; 3</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure at JoVE.com

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

זוהי שיטה להפקת דיפלואידי gynogenetic עוברי דג הזברה (אשר עוברים רק תרומה גנטית מגיע מהאם) על ידי חסימת חלוקת meiotic מחרה מחזיק אחריה מיד לאחר ההפריה עם זרע אור אולטרה סגול מומת. עוברים EP אינם הומוזיגוטים במלואה עקב רקומבינציה במהלך החלוקה meiotic הראשון, אולם הם הומוזיגוטים בכלל לוקוסים שלא היה מופרד centromere שלהם על ידי רקומבינציה.

ביצוע דיפלואידי דג הזברה Gynogenetic על ידי לחץ מוקדמת

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

making-gynogenetic-diploid-zebrafish-by-early-pressure

Research

JoVE Journal

Biology

13.4K Views.  University of Oregon. זוהי שיטה להפקת דיפלואידי gynogenetic עוברי דג הזברה (אשר עוברים רק תרומה גנטית מגיע מהאם) על ידי חסימת חלוקת meiotic מחרה מחזיק אחריה מיד לאחר ההפריה עם זרע אור אולטרה סגול מומת. עוברים EP אינם הומוזיגוטים במלואה עקב רקומבינציה במהלך החלוקה meiotic הראשון, אולם הם הומוזיגוטי...

Video: Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1. To achieve this goal 6-10 systematic sections should be probed covering the entire structure. Typically this involves processing 1/5 sections which leaves a significant amount of material unprocessed. In order to maximize the material, we propose an inexpensive method for preserving fixed tissue as part of a long-term storage research plan. As tissue is sliced and processed for the desired stain or antibody, alternate sections should be systematically placed in antigen preserve at -20&deg;C for future processing. Using 24-well plates, sections can be placed in order for future retrieval. Using this method, tissue can be stored and processed for immunohistochemistry over the course of years.

Brain banking and systematic sampling of biological material provides the basis for unbiased stereology and maximizes the potential data obtained from each specimen.

בנקאות המוח: הפיכת רוב דוגמאות המחקר שלך

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1.  To ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

בלחץ אטמוספרי מולקולרית והדמיה של רקמות ביולוגיות באמצעות Biofilms LAESI המוניים ספקטרומטריית

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

ניתוח ישיר של תאים בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה בלחץ אטמוספרי

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

הדמיה Glycans בעוברים דג הזברה על ידי תיוג מטבולית וכימיה לחץ Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

ייצור של הפלואידים עוברי דג הזברה על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הפריה

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

ניתוח Glucocorticoid צואה: לא פולשני ניטור הכליה ב Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...