تمايز الخلايا الجذعية الجنينية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع قارورة متكدسة بالقرب من الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) عن طريق العلاج مع التربسين ESC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 5 مل من وسائل الإعلام ونقل التمايز إلى T25 الجيلاتين غير المغلفة. احتضان في 37 لمدة 45 دقائق درجة مئوية. استرداد طاف وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ملاحظة : الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEFs) من الثقافات ESC نعلق بسهولة إلى T25 غير المغلفة الجيلاتين ، وبالتالي فهي تقلص من الثقافة خلال هذه الخطوة الطلاء. إذا كنت لا استزراع ESC الخاص بك على MEFs ، يمكنك تخطي لوحة مسبقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend MEF - ESC المنضب في وسائل الإعلام في التفريق مل cells/50 333333. هذا التركيز في نتائج مل ESC/15 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام متعدد القنوات pipettor ، لوحة ESC في 100 مل قطرة cells/15 على لوحات بتري 15 سم 2. مع pipettor 8 قنوات ، يجب أن تكون قادرة على احتواء حوالي 18-22 الصفوف من قطرات في لوحة (حوالي 5ml لكل لوحة). ملاحظة : للحصول على هذا البروتوكول ، 2-5 سم 2 15 الاطباق قطرات ستكون أكثر من كافية ، وينبغي أن تسفر 2-5 × 10 6 ستة أيام EB الخلايا المشتقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوجه بلطف لوحات لعكس قطرات. احتضان في 37 ° C CO 2 5 ٪ لمدة 48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع قطرات بلطف بواسطة دوامات لوحات ونقل إلى أنبوب 15 مل المخروطية. شطف مع لوحات 4-6 مل من برنامج تلفزيوني ، ويضاف إلى نفسه المخروطية 15 مليلتر. ملاحظة : قد تجمع ما يصل الى خمس لوحات قطرة شنقا. سوف تنمو EBS لأنها لا تزال تفرق واذا كانت تتركز أيضا أنها تميل إلى تشكيل كتل كبيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح EBS مجمعة لتسوية عن طريق الجاذبية (حوالي 10 دقيقة). نضح طاف دون إزعاج EBS. resuspend بلطف وسائل الاعلام في 10 مل من التمايز ونقل إلى 10 سم طبق بتري غير ملتصقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان بتري على لوحة لوحة شاكر في 50 دورة في الدقيقة و 37 درجة في احتضان ثاني C 5 ٪ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة (أربعة أيام من تمايز) ، لوحات دوامة التركيز الحديدية في وسط طبق بتري. بعناية تبادل 50 ٪ من وسائل الإعلام (5 مل) مع 5 مل الإعلام التمايز الطازجة. عودة إلى لوحة حاضنة لمدة يومين آخرين. </li></ol> EB تفارق وعدوى MSCV - HoxB4 - IRES - GFP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم السادس من التمايز ، ونقل إلى أنبوب EBS 15 مليلتر المخروطية. السماح لتسوية عن طريق الجاذبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في وسائل الإعلام وresuspend PBS 10 مل. EBS تسمح لإعادة توطين بواسطة الجاذبية. نضح برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 مل من مزيج انزيم تفارق PBS و 1 مل. احتضان في حمام مائي 37 ° C لمدة 20 دقيقة ، وأحيانا يحوم أنبوب لخلط الأنزيمات وEBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 8 مل تفارق عازلة خالية من الانزيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متمزج الخليط باستخدام ماصة 5 مل حتى يتم فصلها تماما EBS (حوالي 10 مرة ؛ pipetting المفرط ستزيد الموت داخل EB - مشتقة إعداد الخلية). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف يصبح غائما مع خليط الخلايا كما تنأى EBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف يضع طرف ضد ماصة أسفل أنبوب مخروطي سحن خلال إنشاء قوة القص الذي سيسهل كثيرا التفكك. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend EB الخلايا المشتقة في 5 مل من IMDM 10 ٪ وعدد استبعاد استخدام التريبان الأزرق ملاحظة : بين يوم وأربعة وستة أيام من التمايز ، EBS التجويف الذي ينتج كمية كبيرة من الخلايا والخلايا death.Thus ، في ستة أيام ، ما يزيد عن 30 ٪ من الخلايا المشتقة EB قد صمة عار مع الأزرق التريبان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا المشتقة في EB - 100000 خلية / 2 مل من 10 ٪ + IMDM الفيروسية مثل طاف هو أن وزارة الداخلية من 5-10 achieved.Add سلفات بروتامين إلى تركيز النهائي من 8 ملغ / مل. ملاحظة : إعداد ما يكفي EB / مزيج طاف الفيروسية لوحة أربع صفائح 6 - جيدا (على افتراض 2 مل / جيد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة EB 2 مل / مزيج طاف الفيروسية لكل بئر من أربع لوحات 6 جيدا قبل مطلي مع الخلايا سدى OP9 (أنظر أدناه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ألواح الطرد المركزي في 2500 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة. لوحات نقل الحاضنة 37 درجة مئوية في 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4-6 ساعات في وقت لاحق ، والحصاد طاف من لوحات وجمع أي الخلايا المتبقية المحتملة في التعليق عن طريق الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend بيليه (قد تكون صغيرة) في IMDM مل 48 10 ٪ + السيتوكينات. الاستغناء 2 مل / جيدا لإعادة تعليق لوحات أصلية 6 - جيدا الأربعة التي أجريت العدوى وجمعت طاف. ملاحظة : تعد دائما 10 ٪ + IMDM السيتوكينات الطازجة في وقت الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات في 37 ° C CO 2 5 ٪ لمدة سبعة أيام. وينبغي أن يكون واضحا المستعمرات يوم آخر عن طريق العدوى الأربعة وكبيرة وبشكل جيد من قبل سبعة ايام. وينبغي أن يكون التوسع القوي العائد 40-60 المستعمرات / جيد على سبعة ايام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على سبعة ايام عدوى آخر ، وجمع وتجمع كافة الخلايا (بما في ذلك OP9 سدى) من جميع الآبار التي المعاملة مع التربسين. ملاحظة : لا تجاهل طاف أو توظيفهم خلال برنامج تلفزيوني يغسل treatment.At التربسين هذه النقطة في الثقافة ، وبعض المستعمرات قد تكون ملتصقة فقط فضفاضة ، وهناك العديد من الخلايا floaتينغ في suspension.Collect وحمام سباحة وطاف يغسل كل لضمان أن يتم تجاهل وجود خلايا ذات قيمة عالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend خلايا جديدة في 8 IMDM مل + 10 ٪ السيتوكينات. توزيع تراخيص 2 / القارورة في قوارير T75 الأربعة. إضافة تراخيص إضافية 13 + 10 ٪ IMDM السيتوكينات إلى كل القارورة. احتضان عند 37 درجة مئوية 5 ٪ CO 2 لمدة ثلاثة أيام (أي ما مجموعه عشرة إصابة آخر أيام). </li></ol> الثقافة وتصفيح سدى OP9 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على OP9 سدى وفقا لبروتوكولات قياسية في 20 ٪ ، MEM. وسوف تغيير خصائص الخلايا OP9 عندما نما إلى confluency. انقسام دائما بنسبة 80 ٪ في confluency لا يزيد 01:03 الانقسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل 24 ساعة من العدوى من الخلايا المشتقة من يوم EB ستة مع MSCV - HoxB4 - IRES - GFP ، لوحة الخلايا OP9 25000 / أربعة جيدا جيدا 6 لوحات في 20 ٪ MEM. </li></ol> جمع والتجزيء والزرع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا الموسع بشأن OP9 سدى لمدة عشرة أيام عن طريق العلاج مع التربسين. عدد الخلايا. يغسل المستعملة لا تجاهل طاف أو برنامج تلفزيوني أثناء العلاج التربسين : مذكرة. عند هذه النقطة في الثقافة ، وبعض المستعمرات قد تكون ملتصقة فقط فضفاضة ، وهناك العديد من الخلايا تطفو في suspension.Collect وحمام سباحة وطاف يغسل كل لضمان أن يتم تجاهل وجود خلايا ذات قيمة عالية. ملاحظة : يجب أن توسع جيدة العائد بين 4-50 خلايا س 6 10 / 6 الأصلية ، كذلك لوحة المصابة ، ليصبح المجموع 160-200 س 6 10 الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد تكون مجزأة الخلايا عبر اختيار حبة المغناطيسي أو وفقا لنظام مراقبة الأصول الميدانية التقنيات القياسية في هذه النقطة في البروتوكول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للزرع ، وتقديم الخلايا عبر المدار الرجعية أو الذيل حقن الوريد إلى المستلمين ناقصة Rag-2/gc (وزنها بين 15-22 جرام) تعرض لجرعة انقسام 9.25 غراي من 2.5 ساعة التشعيع. وبصرف النظر. ملاحظة : من المهم جدا أن وزن الحيوانات تقع بين 15-22 غراما في وقت التشعيع. إذا كانت أكبر من 22 غراما ، وسوف لا يكون 9.25 غراي جرعة كافية من التشعيع لضمان الاجتثاث المناسبة والخلايا قد لا توسط الانقاذ من الإشعاع المميتة و / أو تدبر المقصورة للدم. إذا زرع الحيوانات الكبيرة ، يجب تحديد الجرعة المناسبة تشعيع تجريبيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مطلوب جرعة الحد الأدنى من 2-5 خلايا 6 × 10 / الحيوانية لضمان انقاذ من الإشعاع القاتل. إذا تجزئة الخلايا ، وضخ 2-5 × 10 6 خلية حكمه (على سبيل المثال إذا كان السكان من الاهتمام تمثل 10 ٪ من تجمع الخلايا غير المجزأ ، وضخ 2-5 × 10 5 خلية / الحيوان). ملاحظة : إذا كان عن طريق الحقن&gt; 2 × 10 6 خلايا ، وضخ دائما عن طريق الوريد لتجنب تشكيل ذيل مسخي في المدار ، مما قد يؤدي عندما يتم تسليم أعداد كبيرة من الخلايا orbitally الرجعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على خرقة - 2 -- / -- / GC -- / -- متلقي قاصرة في أقفاص تعقيمها. اعتمادا على &quot;نظافة&quot; للمنشأة حيوانية ، قد زرع في مرحلة ما بعد حيوانات تتطلب ادارة المياه المحمضة أو Trimethiprim Sulfasoxazole - (Septra) في الأسابيع التالية 5 الإشعاع المميتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نتوقع&gt; GFP 90 ٪ + ES - مشتقة الكريات البيض في الدم المحيطي في 3 أسابيع بعد الزرع. وينبغي أن تكون متعددة Engraftment النسب ، وإن كان من المعروف أن الخلايا الليمفاوية الصمت فيروسات HoxB4 - IRES - GFP. </li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice</td>
<td>Animal</td>
<td>Taconic Farm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plate shaker</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>33998-360</td>
<td>Orbital Shaker by Ikaworks</td>
</tr>
<tr>
<td>Multi-channel pipettor</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>15000-174</td>
<td>ePet by BioHit</td>
</tr>
<tr>
<td>ES trypsin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15090-046</td>
<td>0.25% Trypsin in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Standard trypsin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invtrogen</td>
<td>25300-062</td>
<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Buffer</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>20012-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Enzyme-free dissociation buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13151-014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissociation enzyme mix</td>
<td>Buffer</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17104-019</td>
<td>500 mg Collagenase IV</td>
</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H2126</td>
<td>freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.</td>
</tr>
<tr>
<td>DNAse</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D4527</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10-017CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protamine sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P3369</td>
<td>8 ug/mL</td>
</tr>
<tr>
<td>EB differentiation media</td>
<td>medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Please view recipe on attached Protocol.doc</td>
</tr>
<tr>
<td>10% IMDM</td>
<td>medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Please view recipe on attached Protocol.doc</td>
</tr>
<tr>
<td>10% IMDM+cytokines</td>
<td>medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Please view recipe on attached Protocol.doc</td>
</tr>
<tr>
<td>20% anti-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Please view recipe on attached Protocol.doc</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

derivation of hematopoietic stem cells from murine embryonic stem cells

وتعرف الخلايا الجذعية في زنزانة مع القدرة على تجديد الذات على حد سواء ، وتوليد سلالة مختلفة متعددة. يتم اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) من الكيسة الجنين في وقت مبكر والمحفزة في قدرة differentiative. جعلت إمكاناتها differentiative العظمى منهم تركيز الكثير من الأبحاث تركز على استنتاج كيفية اقناعهم لتوليد أنواع الخلايا مفيدة سريريا. وقد تم مؤخرا بنجاح اشتقاق الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) من الماوس ESC المنجز ويمكن تصور هذا البروتوكول في الفيديو. وتستخدم HSC ، يمكن القول إن سكان الخلية الأكثر استغلالا سريريا ، لعلاج عدد لا يحصى من الأمراض الخبيثة للدم واضطرابات. ومع ذلك ، العديد من المرضى التي قد تستفيد من العلاج HSC عدم الوصول إلى الجهات المانحة المناسبة. يمكن ESC توفير مصدر بديل للشهادة الثانوية العامة لهؤلاء المرضى. بروتوكول التالية تضع الأساس الذي يمكن من خلاله درس ESC - HSC وإعلام جهودا لعزل HSC من ESC الإنسان. في هذا البروتوكول ، ويتم التمييز ESC كهيئات مضغي الشكل (EBS) لمدة 6 أيام في المتاحة تجاريا تمايز الأمثل المصل بعد فرزهم للدم. EBS يتم فصلها ثم المصابين HoxB4 فيروسات. ومطلي المصابة EB - مشتقة الخلايا على OP9 سدى ، وهو خط نخاع العظم الخلايا المشتقة من انسجة من calvaria / - M - CSF -- الفئران ، وشارك في تربيتها في حضور تعزيز السيتوكينات تكون الدم لمدة عشرة أيام. خلال هذه الثقافة المشتركة ، وتوسيع الخلايا المصابة بشكل كبير ، مما أدى إلى توليد مجموعة غير متجانسة من 100s من الملايين من الخلايا. ويمكن بعد هذه الخلايا يمكن استخدامها لانقاذ الفئران وإعادة المشع القاتلة.

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

تفاصيل هذا البروتوكول اشتقاق زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم من الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) ، والحقن في وقت لاحق في الفئران المتلقي المشع القاتلة. باختصار ، كانت متباينة ESC كهيئات مضغي الشكل ، والذي يصاب بعد ذلك مع HoxB4 فيروسات وشارك في تربيتها مع OP9 الخلايا اللحمية والسيتوكينات المكونة للدم.

اشتقاق خلايا الجذعية المكونة للدم من الفئران خلايا الجذعية الجنينية

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

derivation-hematopoietic-stem-cells-from-murine-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

13.2K Views.  Harvard Medical School. تفاصيل هذا البروتوكول اشتقاق زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم من الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) ، والحقن في وقت لاحق في الفئران المتلقي المشع القاتلة. باختصار ، كانت متباينة ESC كهيئات مضغي الشكل ، والذي يصاب بعد ذلك مع HoxB4 فيروسات وشارك في تربيتها مع OP9 الخلايا الل?...

Video: Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

انتشار الخلايا الجنينية البشرية (ES) الجذعية

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

العزلة وزرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

العزلة وتحليل الخلايا الجذعية المكونة للدم من المشيمة

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

مناعي لونين من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These regions are crucial in establishing the blood system in the embryos and leads to the eventual movement of stem cells into the fetal liver and then development of adult stem cells in the bonemarrow. Early hematopoietic stem cells can be isolated from these organs through microdissection of the embryo followed by flow cytometric sorting to obtain a more pure population. It remains unclear how these stem cell populations contribute to the fetal and adult stem cell pool.   Also, our lab investigates how early stem cells functionally differ from fetal and adult hematopoietic stem cells. Furthermore, our lab sorts different populations of hematopoietic stem cells and test their functional role in the context of a variety of genetic models. In this video, we demonstrate the micro-dissection procedure we commonly use and also show the results of a typical FACS plotfter isolating these rare populations, it is possible to perform a variety of functional assays including: colony assays and bone marrow transplants. 



This video shows how to micro-dissect the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region from embryos and use flow cytometry to sort hematopoietic stem cells.

عزل الخلايا الجذعية المكونة للدم في وقت مبكر من الكيس المحي الفئران وAGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

العزلة واشتقاق خلايا الفأر الجنينية بيرشوت

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

اشتقاق الخلايا الجذعية من الأرومة الغاذية Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

كفاءة اشتقاق السلائف القلب البشري وافرة القوة العضلية من خلايا المنشأ الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

المظهري التحليل وعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم الفئران والأسلاف النسب، الملتزم

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...