התמיינות של תאים עובריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף בקבוקון ומחוברות ליד של תאים עובריים (ESC) דרך הטיפול עם טריפסין ESC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים 5 מ&quot;ל של התקשורת גזירה להעביר שאינו מצופה ג&#39;לטין T25. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. אחזר supernatant לאסוף תאים באמצעות צנטריפוגה. הערה: fibroblasts עכבר עובריים (MEFs) מן התרבויות ESC לצרף בקלות הלא מצופה ג&#39;לטין T25 ובכך מתרוקנים מתרבות במהלך שלב זה ציפוי. אם אתה לא culturing ESC על MEFs, אתה יכול לדלג על צלחת מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend-MEF מדולדל ESC בתקשורת בידול בכל מ&quot;ל cells/50 333,333. ריכוז התוצאה ESC/15 100 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש רב ערוצי pipettor, צלחת ESC על ירידה cells/15 100 מ&quot;ל ב -15 ס&quot;מ 2 צלחות פטרי. Pipettor עם 8 ערוצים, אתה אמור להיות מסוגל להתאים על 18-22 שורות של טיפות לכל צלחת (כ 5 מ&quot;ל לכל צלחת). הערה: לקבלת הפרוטוקול הזה, 2-5 15 ס&quot;מ 2 מנות של טיפות יהיה יותר מהדרוש ויש תשואה 2-5 x 10 6 ששת הימים EB-derived תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להעיף צלחות כדי להפוך טיפות. לדגור על 37 ° C 5% CO 2 למשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת טיפות ידי בעדינות מתערבל צלחות להעביר צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. לשטוף צלחות עם 4-6 מ&quot;ל של PBS ולהוסיף אותו 15 מ&quot;ל חרוטי. הערה: ייתכן הבריכה עד חמש צלחות ירידה תלוי. EBS יגדל כפי שהם ממשיכים להבדיל אם הם מרוכזים מדי והם נוטים ליצור גושים גדולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר EBS ונקווה להתיישב על ידי כוח הכבידה (כ -10 דקות). לשאוב supernatant מבלי להפריע EBS. Resuspend בעדינות 10 מ&quot;ל בידול התקשורת והעברת עד 10 צלחת לא חסיד ס&quot;מ פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת על צלחת פטרי שייקר בסל&quot;ד 50 ו לדגור על 37 ° C 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר מכן (יום ארבעה בידול), צלחות מערבולת להתרכז EBS במרכז של צלחת פטרי. בזהירות להחליף 50% לתקשורת (5 מ&quot;ל) עם 5 מ&quot;ל מדיה בידול טריים. חזור אל צלחת החממה במשך יומיים נוספים. </li></ol> EB דיסוציאציה וזיהום עם MSCV-HoxB4-IRES-GFP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום שישה בידול, העברת EBS על צינור 15 מ&quot;ל חרוטי. אפשר להתיישב על ידי כוח הכבידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב מדיה resuspend ב 10 מ&quot;ל PBS. EBS אפשר ליישב על ידי כוח הכבידה. לשאוב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 250 מ&quot;ל לערבב דיסוציאציה האנזים 1 מ&quot;ל PBS. דגירה באמבט מים C ° 37 במשך 20 דקות, לפעמים מתערבל צינור לערבב אנזימים EBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ 8 מ&quot;ל אנזים ללא ניתוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate התערובת בעזרת פיפטה 5 מ&quot;ל עד EBS הם מנותקים לחלוטין (בערך 10 פעמים; pipetting מופרז תגדיל את מותו בתוך בהכנת-EB נגזר התא). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת יהיה מעונן עם תאים כמו EBS לנתק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנחת קצה פיפטה נגד התחתון של צינור חרוטי במהלך טחינה דקה תיצור כוח גזירה כי יהיה מאוד להקל על ניתוק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים באמצעות צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend EB-derived תאים 5 מ&quot;ל של IMDM 10% מהסכום באמצעות הרחקה trypan כחול הערה: בין יום לארבעה ימים שישה בידול, EBS למער שתוצאתה כמות גדולה של אפופטוזיס ו death.Thus התא, ביום השישי, למעלה מ -30% EB-derived תאים עשויים כתם כחול עם trypan. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend EB-נגזרת ב 100,000 תאים / 2 מ&quot;ל של 10% + IMDM ויראלי supernatant כזה משרד הפנים של 50-10 הוא achieved.Add סולפט protamine לריכוז סופי של 8 מ&quot;ג / מ&quot;ל. הערה: הכן EB מספיק / לערבב supernatant ויראלי לצלחת ארבע צלחות 6-היטב (בהנחה 2 mL / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 2 מ&quot;ל EB / לערבב היטב לכל supernatant ויראלי של ארבע 6 צלחות היטב מראש מצופה OP9 תאים stroma (ראה להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צלחות ב 2500 סל&quot;ד בטמפרטורת החדר למשך 90 דקות. העברת צלחות החממה ב 37 ° C 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4-6 שעות לאחר מכן, מסיק supernatant מתוך צלחות לאסוף את כל התאים הנותרים פוטנציאל ההשעיה באמצעות צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה (עשוי להיות קטן) ב IMDM מ&quot;ל 48 10% + ציטוקינים. לוותר על 2 מ&quot;ל / היטב resuspension המקורי four-6 גם צלחות שבו זיהום בוצע supernatant נאסף. הערה: תמיד להכין 10% IMDM + ציטוקינים טרי בזמן השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות ב 37 ° C 5% CO 2 למשך שבעה ימים. מושבות צריכה להיות ברורה על ידי זיהום four שלאחר יום גדול בנוי היטב על ידי שבעה ימים. הרחבת חזקים צריכים להניב 40-60 מושבות / גם ביום שבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על שבעה זיהום שלאחר יום, לאסוף בריכת כל התאים (כולל OP9 stroma) מבארות כל ידי טיפול עם טריפסין. הערה: אין להשליך supernatant או PBS שוטף המועסקים במהלך טריפסין treatment.At הנקודה הזו בתרבות, מושבות מסוימים עשויים להיות חסיד רק באופן רופף ויש תאים רבים floaהטבעת suspension.Collect ובריכת כל מתרחץ supernatant על מנת להבטיח כי לא התאים ערך פוטנציאלי מבוטלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב IMDM 8 מ&quot;ל טרי 10% + ציטוקינים. הפץ 2 MLS / בקבוקון לארבע צלוחיות T75. הוסף נוספת 13 MLS 10% + ציטוקינים IMDM אל בקבוק אחד. לדגור על 37 ° C 5% CO 2 למשך שלושה ימים (סה&quot;כ עשרה ימים של זיהום הודעה). </li></ol> התרבות ציפוי של OP9 stroma <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור OP9 stroma פי פרוטוקולים סטנדרטיים ב 20%, ממ. OP9 התאים יהיה לשנות את מאפייני כאשר גדלה confluency. לפצל תמיד ב 80% confluency על הפיצול לא יותר מ 01:03. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לפני ההדבקה של שישה יום EB-derived תאים עם MSCV-HoxB4-IRES-GFP, צלחת 25,000 OP9 תאים / טוב של ארבעה 6 צלחות גם 20% מ-. </li></ol> , אוסף חלוקה והשתלות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים מורחבת על stroma OP9 עשרה ימים באמצעות טיפול עם טריפסין. ספירת תאים. הערה: אין להשליך supernatant או PBS שוטף המועסקים במהלך הטיפול טריפסין. בשלב זה בתרבות, מושבות מסוימים עשויים להיות חסיד רק באופן רופף ויש תאים רבים צפים suspension.Collect ובריכת כל מתרחץ supernatant על ​​מנת להבטיח כי לא התאים ערך פוטנציאלי מבוטלים. הערה: הרחבה טוב צריך התשואות בין 40-50 x 10 6 תאים / צלחת המקורי 6-גם נגוע, עבור סכום כולל של 160-200 x 10 6 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים עשויים להיות מופרדים באמצעות מבחר חרוז או FACS מגנטי על פי טכניקות סטנדרטיות בשלב זה בפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתלה, לספק תאים באמצעות רטרו מסלולית או הזרקה לווריד הזנב לנמענים לקוי Rag-2/gc (במשקל בין 15-22 גרם) נתון מנה פיצול של 9.25 gy של 2.5 שעות הקרנה. בנפרד. הערה: זה קריטי, כי המשקל של בעלי החיים ליפול בין 15-22 גרם בזמן של קרינה. אם הם גדולים יותר מאשר 22 גרם, 9.25 gy לא יהיה מנה מספקת של הקרנה, כדי להבטיח את אבלציה המתאימים תאים לא יכול לתווך להציל הקרנה קטלנית ו / או נקלטים תא hematopoietic. אם השתלת בעלי חיים גדולים יותר, במינון קרינה המתאים צריכה להיקבע באופן ניסיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מינון מינימלי של 2-5 x 10 6 תאים / החי נדרשת ערבות להציל הקרנה קטלנית. אם fractionating התאים, להזריק 2-5 x 10 6 ושווי התא (לדוגמא, אם האוכלוסייה עניין מייצג 10% בריכת unfractionated של תאים, להזריק 2-5 x 10 5 תאים / בעלי חיים). הערה: אם הזרקת&gt; 2 x 10 6 תאים, תמיד מזריקים דרך וריד הזנב, כדי למנוע היווצרות תפלצת במסלול, אשר עלול לגרום כאשר מספר רב של תאים מועברות בסגנון רטרו orbitally. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על סמרטוט-2 - / - / GC - / - מקבלי לקוי בכלובים autoclaved. בהתאם &quot;ניקיון&quot; של המתקן החי, השתלת פוסט חיות עשויים לדרוש הממשל מים acidified או Trimethiprim-Sulfasoxazole (Septra) במשך 5 שבועות לאחר קרינה קטלנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפו&gt; GFP 90% + ES-derived לויקוציטים בדם ההיקפי בבית 3 שבועות לאחר ההשתלה. Engraftment צריך להיות רב השושלת, למרות לימפוציטים ידועים שתיקה retroviral HoxB4-IRES-GFP. </li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice</td>
<td>Animal</td>
<td>Taconic Farm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plate shaker</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>33998-360</td>
<td>Orbital Shaker by Ikaworks</td>
</tr>
<tr>
<td>Multi-channel pipettor</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>15000-174</td>
<td>ePet by BioHit</td>
</tr>
<tr>
<td>ES trypsin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15090-046</td>
<td>0.25% Trypsin in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Standard trypsin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invtrogen</td>
<td>25300-062</td>
<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Buffer</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>20012-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Enzyme-free dissociation buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13151-014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissociation enzyme mix</td>
<td>Buffer</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17104-019</td>
<td>500 mg Collagenase IV</td>
</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H2126</td>
<td>freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.</td>
</tr>
<tr>
<td>DNAse</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D4527</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10-017CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protamine sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P3369</td>
<td>8 ug/mL</td>
</tr>
<tr>
<td>EB differentiation media</td>
<td>medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Please view recipe on attached Protocol.doc</td>
</tr>
<tr>
<td>10% IMDM</td>
<td>medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Please view recipe on attached Protocol.doc</td>
</tr>
<tr>
<td>10% IMDM+cytokines</td>
<td>medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Please view recipe on attached Protocol.doc</td>
</tr>
<tr>
<td>20% anti-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Please view recipe on attached Protocol.doc</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

derivation of hematopoietic stem cells from murine embryonic stem cells

תא גזע מוגדר בתא עם היכולת הן עצמית לחדש וליצור בידול צאצאים מרובים. לתאי גזע עובריים (ESC) נגזרות הבלסטוציסט העובר מוקדם הם pluripotent ביכולת differentiative. פוטנציאל עצום differentiative שלהם הפכה אותם למוקד של מחקר רב התרכזו והסיק איך לפתות אותם כדי לייצר תאים מסוגים שימושי קלינית. גזרה מוצלחת של בתאי גזע hematopoietic (HSC) מהעכבר ESC לאחרונה הושג וניתן דמיינו בפרוטוקול הווידאו הזאת. HSC, ניתן לטעון את האוכלוסייה תא ביותר לנצל קלינית, משמשות לטיפול מספר עצום של ממאירויות והפרעות hematopoietic. עם זאת, חולים רבים שעשויים להפיק תועלת מטיפול HSC חוסר גישה תורמים מתאימים. ESC יכול לספק מקור חלופי של HSC עבור חולים אלו. פרוטוקול הבאה קובעת הבסיס שממנו ESC-HSC ניתן ללמוד ולהודיע ​​המאמצים לבודד HSC מ ESC האדם. בפרוטוקול זה, ESC הם להבדיל גופים embryoid (EBS) במשך 6 ימים בידול זמינים מסחרית מראש לגילוי נסיוב hematopoietic אופטימלית. EBS הם ניתק אז נגוע HoxB4 retroviral. אינפקטד EB-derived תאים מצופה על OP9 stroma, מח עצם קו סטרומה תא נגזר מכסה הגולגולת של M-CSF-/ - עכברים, ושיתוף בתרבית בנוכחות hematopoiesis קידום ציטוקינים למשך עשרה ימים. במהלך תרבות משותפת זו, תאים נגועים להרחיב באופן משמעותי, וכתוצאה מכך הדור בריכה הטרוגנית של 100s של מיליוני תאים. תאים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי עכברים הצלה מחדש מוקרן קטלנית.

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

זה פרוטוקול הפרטים גזירת להשתלה בתאי גזע hematopoietic מתאי גזע עובריים של עכבר (ESC) הזרקת הבאים שלהם לעכברים הנמען מוקרן קטלנית. בקצרה, הם ESC להבדיל גופים embryoid, אשר נגועים אז עם HoxB4 retroviral ושיתוף תרבותי עם OP9 תאים סטרומה וציטוקינים hematopoietic.

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

derivation-hematopoietic-stem-cells-from-murine-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

13.2K Views.  Harvard Medical School. זה פרוטוקול הפרטים גזירת להשתלה בתאי גזע hematopoietic מתאי גזע עובריים של עכבר (ESC) הזרקת הבאים שלהם לעכברים הנמען מוקרן קטלנית. בקצרה, הם ESC להבדיל גופים embryoid, אשר נגועים אז עם HoxB4 retroviral ושיתוף תרבותי עם OP9 תאים סטרומה וציטוקינים hematopoietic.

Video: Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

רביה של האדם גזע עובריים (ES) תאים

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

בידוד והשתלות של בתאי גזע hematopoietic (HSCs)

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

גזירת בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

בידוד ניתוח בתאי גזע hematopoietic מן השליה

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These regions are crucial in establishing the blood system in the embryos and leads to the eventual movement of stem cells into the fetal liver and then development of adult stem cells in the bonemarrow. Early hematopoietic stem cells can be isolated from these organs through microdissection of the embryo followed by flow cytometric sorting to obtain a more pure population. It remains unclear how these stem cell populations contribute to the fetal and adult stem cell pool.   Also, our lab investigates how early stem cells functionally differ from fetal and adult hematopoietic stem cells. Furthermore, our lab sorts different populations of hematopoietic stem cells and test their functional role in the context of a variety of genetic models. In this video, we demonstrate the micro-dissection procedure we commonly use and also show the results of a typical FACS plotfter isolating these rare populations, it is possible to perform a variety of functional assays including: colony assays and bone marrow transplants. 



This video shows how to micro-dissect the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region from embryos and use flow cytometry to sort hematopoietic stem cells.

בידוד מוקדם בתאי גזע hematopoietic מ Murine חלמון Sac ו AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

גזירת Trophoblast עכבר בתאי גזע Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...