Diferenciação de células-tronco embrionárias <ol><li> Coletar um frasco perto confluentes de células-tronco embrionárias (ESC), através de tratamento com tripsina ESC. </li><li> Ressuspender as células em 5 mL de mídia Diferenciação e transferir para um T25 não-revestido de gelatina. Incubar a 37 ° C por 45 minutos. Recuperar o sobrenadante e coletar células através de centrifugação. Nota: fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) das culturas ESC anexar prontamente aos T25 não-revestido de gelatina e, portanto, estão esgotados a partir da cultura durante esta etapa de galvanização. Se você não é o seu cultivo em MEFs ESC, você pode pular a placa pré-. </li><li> Ressuspender MEF-esgotados ESC na mídia Diferenciação em 333.333 mL cells/50. Esta concentração resulta em 100 mL ESC/15. </li><li> Usando multi-canal de pipetador, placa ESC a 100 mL cells/15 queda em 15 cm 2 placas de petri. Com uma pipeta de 8 canais, você deve ser capaz de caber aproximadamente 18-22 fileiras de gotas por placa (cerca de 5 ml por placa). Nota: Para este protocolo, 2-5 15 cm 2 pratos de gotas será mais do que suficiente e deve render 2-5 x 10 6 de seis dias EB células derivadas. </li><li> Suavemente virar placas para inverter gotas. Incubar a 37 ° C 5% CO 2 por 48 horas. </li><li> Piscina cai rodando suavemente placas e transferir para tubo de 15 mL cônico. Enxaguar pratos com 4-6 mL de PBS e adicionar à mesma 15 mL cônico. Nota: Você pode piscina até cinco placas de gota em suspensão. O EBS vai crescer à medida que continuam a diferenciar e se eles são muito concentrados tendem a formar grumos grandes. </li><li> Permitir EBs agrupados para resolver pela força da gravidade (cerca de 10 minutos). Aspirar o sobrenadante sem perturbar EBs. Delicadamente ressuspender em 10 mL de mídia Diferenciação e transferência a 10 cm da placa de petri não-aderente. </li><li> Colocar a placa de petri na placa shaker a 50 rpm e incubar a 37 ° C 5% CO 2. </li><li> 24 horas depois (dia quatro de diferenciação), placas de turbulência para se concentrar EBs no centro da placa de Petri. Cuidadosamente troca de 50% dos meios de comunicação (5 mL) com 5 mL de mídia Diferenciação fresco. Retorno placa para incubadora por mais dois dias. </li></ol> EB dissociação e infecção com MSCV-HoxB4-IRES-GFP <ol><li> No dia seis de diferenciação, a transferência de EBs a 15 mL do tubo cônico. Deixa-se repousar por gravidade. </li><li> Aspirar mídia e ressuspender em 10 mL PBS. Permitir EBs para reassentar pela gravidade. Aspirar PBS. </li><li> Adicionar 250 mL mix enzima dissociação e 1 mL de PBS. Incubar em banho-maria 37 ° C por 20 minutos, ocasionalmente turbilhão tubo para misturar enzimas e EBs. </li><li> Adicionar 8 mL da enzima livre de buffer de dissociação. </li><li> Triturar a mistura usando pipeta de 5 ml até EBs são totalmente dissociados (cerca de 10 vezes; pipetagem excessiva aumentará a morte dentro do EB derivados preparação celular). <ol><li> Mistura será nublado com células como dissociar EBs. </li><li> Colocando a ponteira contra a parte inferior do tubo cônico durante a trituração vai criar uma força de cisalhamento que vai facilitar muito a dissociação. </li></ol></li><li> Coletar células através de centrifugação. </li><li> Ressuspender EB células derivadas em 5 mL de IMDM 10% e contagem usando trypan exclusão azul Nota: Entre quatro dias e seis dias de diferenciação, EBs cavitar o que resulta em uma grande quantidade de apoptose e death.Thus celular, no sexto dia, mais de 30% da EB células derivadas pode manchar com azul de tripano. </li><li> Ressuspender as células EB-derivados de 100.000 células / 2 mL de 10% IMDM + sobrenadante viral de tal forma que um MOI de 5-10 é achieved.Add sulfato de protamina para uma concentração final de 8 mg / mL. Nota: Prepare o suficiente EB / mix sobrenadante viral ao prato quatro chapas 6-bem (assumindo que 2 mL / poço). </li><li> Placa de 2 mL EB / mix sobrenadante viral por poço de quatro 6 placas bem pré-revestida com OP9 células do estroma (veja abaixo). </li><li> Centrífuga placas a 2500 rpm em temperatura ambiente por 90 minutos. Transferência de placas para incubadora a 37 ° C 5% CO 2. </li><li> 4-6 horas mais tarde, a colheita sobrenadante a partir de chapas e recolher as células potencial remanescente em suspensão através de centrifugação. </li><li> Ressuspender pellet (pode ser pequeno) em 48 mL IMDM 10% + citocinas. Dispense 2 mL / poço de ressuspensão de original de quatro bem-6 placas em que a infecção foi realizada e sobrenadante foi coletado. Nota: Sempre prepare 10% IMDM + citocinas fresco no tempo de uso. </li><li> Incubar as placas a 37 ° C 5% CO 2 por sete dias. Colônias deve ser aparente por dia após a infecção e quatro grandes e bem formado por sete dias. A expansão robusta deve render 40-60 colônias / bem no dia sete. </li><li> No sétimo dia pós-infecção, coletar e piscina todas as células (incluindo OP9 estroma) de todos os poços por tratamento com tripsina. Nota: NÃO descartar sobrenadante ou PBS lava empregados durante tripsina treatment.At neste ponto da cultura, algumas colônias podem ser apenas vagamente aderente e existem muitas células flutuar livrementing em suspension.Collect e piscina todos os lava e sobrenadante para garantir que nenhum células potencialmente valiosos são descartados. </li><li> Ressuspender as células em 8 mL IMDM fresca a 10% + citocinas. Distribuir 2 ml / frasco em quatro frascos T75. Adicionar um adicional de 13 mls citocinas + 10% IMDM em cada balão. Incubar a 37 ° C 5% CO 2 por três dias (um total de dez dias após a infecção). </li></ol> Cultura e chapeamento de OP9 estroma <ol><li> Manter OP9 estroma de acordo com protocolos padrão em 20% a-MEM. OP9 células vão alterar as propriedades quando cultivadas a confluência. Sempre dividido em 80% confluência em não mais de 1:03 dividido. </li><li> 24 horas antes da infecção do dia seis EB células derivadas com MSCV-HoxB4-IRES-GFP, placa OP9 25.000 células / poço de quatro bem-6 placas em 20% ao MEM. </li></ol> Fracionamento de recolha e transplante <ol><li> Coletar células expandidas em OP9 estroma de 10 dias através de tratamento com tripsina. Contagem de células. Nota: NÃO descartar sobrenadante ou PBS lava empregadas durante o tratamento de tripsina. Neste ponto, na cultura, algumas colônias podem ser apenas vagamente aderente e existem muitas células flutuando no suspension.Collect e piscina todos os lava e sobrenadante para garantir que nenhum células potencialmente valiosos são descartados. Nota: Uma boa expansão deve render entre 40-50 x 10 6 células / placa 6-bem original infectado, para um total de 160-200 x 10 6 células. </li><li> Células podem ser fracionados através da selecção do grânulo magnético ou FACS acordo com técnicas padronizadas neste ponto no protocolo. </li><li> Para o transplante, as células entregar via retro-orbital ou injeção veia da cauda para Rag-2/gc destinatários deficiente (pesando entre 15-22 gramas) submetido a uma dose fracionada de 9,25 Gy de radiação 2,5 horas. além. Nota: É importante que o peso dos animais cair entre 15-22 gramas no momento da irradiação. Se eles são maiores do que 22 gramas, 9,25 gy não será uma dose suficiente de radiação para garantir a ablação apropriado e células não podem mediar resgate de irradiação letal e / ou enxertar o compartimento hematopoiético. Se o transplante animais de maior porte, a dose de irradiação adequada deve ser determinada experimentalmente. </li><li> A dose mínima de 2-5 x 10 6 células / animal é necessário para garantir resgate de irradiação letal. Se fracionar as células, injetar 2-5 x 10 6 células equivalentes (por exemplo, se a população de interesse representa 10% do pool de células não fracionada, injetar 2-5 x 10 5 células / animal). Nota: Se injetar&gt; 2 x 10 6 células, SEMPRE injetar via veia da cauda para evitar a formação de teratomas em órbita, o que pode resultar quando os números elevados de células são entregues retro-orbital. </li><li> Manter Rag-2 - / - / gc - / - destinatários deficiente em gaiolas autoclavado. Dependendo da &quot;limpeza&quot; do estabelecimento animal, pós-transplante animais podem exigir a administração de água acidificada ou Trimethiprim-Sulfasoxazole (Septra) para a 5 semanas seguintes de radiação letal. </li><li> Esperar&gt; GFP 90% + ES-derivados de leucócitos no sangue periférico em três semanas pós-transplante. Enxerto deve ser multi-linhagem, embora os linfócitos são conhecidos por silêncio retroviral HoxB4-IRES-GFP. </li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice</td>
<td>Animal</td>
<td>Taconic Farm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plate shaker</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>33998-360</td>
<td>Orbital Shaker by Ikaworks</td>
</tr>
<tr>
<td>Multi-channel pipettor</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>15000-174</td>
<td>ePet by BioHit</td>
</tr>
<tr>
<td>ES trypsin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15090-046</td>
<td>0.25% Trypsin in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Standard trypsin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invtrogen</td>
<td>25300-062</td>
<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Buffer</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>20012-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Enzyme-free dissociation buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13151-014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissociation enzyme mix</td>
<td>Buffer</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17104-019</td>
<td>500 mg Collagenase IV</td>
</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H2126</td>
<td>freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.</td>
</tr>
<tr>
<td>DNAse</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D4527</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10-017CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protamine sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P3369</td>
<td>8 ug/mL</td>
</tr>
<tr>
<td>EB differentiation media</td>
<td>medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Please view recipe on attached Protocol.doc</td>
</tr>
<tr>
<td>10% IMDM</td>
<td>medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Please view recipe on attached Protocol.doc</td>
</tr>
<tr>
<td>10% IMDM+cytokines</td>
<td>medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Please view recipe on attached Protocol.doc</td>
</tr>
<tr>
<td>20% anti-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Please view recipe on attached Protocol.doc</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

derivation of hematopoietic stem cells from murine embryonic stem cells

Uma célula-tronco é definida como uma célula com capacidade para tanto se auto-renovar e gerar descendência diferenciada múltiplas. Células-tronco embrionárias (ESC) são derivadas do blastocisto do embrião e são pluripotentes na capacidade differentiative. Seu potencial differentiative vasta fez-lhes o foco de muita pesquisa centrada na deduzir como persuadi-los para gerar tipos de células clinicamente útil. A derivação bem-sucedida de células-tronco hematopoiéticas (HSC) de rato ESC foi recentemente realizado e pode ser visualizado neste protocolo de vídeo. HSC, sem dúvida, a população de células clinicamente mais explorados, são usados ​​para tratar uma miríade de malignidades hematopoiéticas e distúrbios. No entanto, muitos pacientes que poderiam se beneficiar da terapia HSC não tem acesso a doadores compatíveis. ESC poderiam fornecer uma fonte alternativa de HSC para estes pacientes. O protocolo a seguir estabelece uma linha de base a partir da qual ESC-HSC podem ser estudados e informar os esforços para isolar HSC da ESC humana. Neste protocolo, ESC são diferenciados como corpos embrióides (EBs) por 6 dias disponíveis comercialmente soro pré-selecionados para a diferenciação ótima hematopoiéticas. EBs são, então, dissociado e infectados com HoxB4 retroviral. Infectados EB células derivadas são semeadas em OP9 estroma, uma linhagem de células de medula óssea estromal derivado da calvária de /-M-CSF - ratos, e co-cultivados na presença de hematopoiese promover citocinas por dez dias. Durante este co-cultura, as células infectadas expandir muito, resultando na geração de uma piscina heterogêneo de 100s de milhões de células. Estas células podem então ser usados ​​para resgatar e reconstituir camundongos letalmente irradiados.

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Este protocolo detalhes a derivação de células-tronco hematopoéticas para transplante de células-tronco embrionárias de rato (ESC) e sua posterior injeção em camundongos letalmente irradiados destinatário. Brevemente, ESC são diferenciados como corpos embrióides, que depois são infectadas com HoxB4 retroviral e co-cultivados com células do estroma OP9 e citocinas hematopoiéticas.

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

derivation-hematopoietic-stem-cells-from-murine-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

13.2K visualizações.  Harvard Medical School. Este protocolo detalhes a derivação de células-tronco hematopoéticas para transplante de células-tronco embrionárias de rato (ESC) e sua posterior injeção em camundongos letalmente irradiados destinatário. Brevemente, ESC são diferenciados como corpos embrióides, que depois são infectadas com HoxB4 retroviral e co-cultivados com células do estroma OP9 e citocinas hematopoiéticas.