نشكر Servane Contal وUntereiner بوريس لمساهمتهم الفنية. نعترف دعم FNR مشروع &quot;FUTOX&quot;.

البروتوكول يتطلب 16 يوما لاستكماله. الإطار الزمني هو مفصل في الشكل 1. تفاصيل لإعداد العازلة <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحضير للتحلل العازلة (3mL لكل عينة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة الغسيل (50mL لكل عينة). وينبغي أن يكون هذا المخزن قبل المبردة وتخزينها على -20 درجة مئوية في الثلاجة حتى إجراء مزيد من التحليل ويحرص على الجليد خلال الإجراء بأكمله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة هطول الأمطار (20mL لكل عينة). وينبغي أن يكون هذا المخزن قبل المبردة وتخزينها على -20 درجة مئوية في الثلاجة لحين الحاجة إليها ويحرص على الجليد خلال الإجراء بأكمله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي العمل بشكل تفضيلي ستنفذ في الغرفة الباردة عند 4 درجات مئوية. </li></ul> الأنواع الفطرية صنفت ثلاث سلالات تستخدم لتحليل البروتين أن يكون فيوزاريوم graminearum على أساس خصائصها الشكلية والترجمة ، الاستطالة ألفا - 1 عامل التحليل (أودونيل وآخرون ، 1998) تنتمي هذه السلالات لجمع يبمان - CRP جبريل وكان مسك وتخزينها في -- 80 درجة مئوية في 15 ٪ الجلسرين. إعداد فطر تم الانتهاء من زراعة الفطريات على V8 لمدة 4 أيام في درجة حرارة 25 مئوية بالتناوب فترة الضوء والظلام في كل ساعة 12. وكانت مجزأة الثقافات باستخدام شفرة معقمة وقطعة من هذه الثقافات كانت تستخدم لتطعيم 250 مل تحتوي على قوارير مخروطي سعة 100 مل من السم الذي يحفز وسائل الإعلام. كانت تحصد فطر بعد 10 أيام وفصلوا عن المتوسط ​​عن طريق تصفية الثقافة مع مرشح العقيمة. وجرفت المياه فطر 3 مرات مع الماء المعقم لإزالة بقايا والمتوسطة وغيرها من المركبات. ونحن على الفور ثم جمدت الخلايا بإضافة النيتروجين السائل وحافظت على عينات من -80 درجة مئوية. الوصف العام للاستخراج البروتين تم استخراج عينات من البروتين باستخدام الأسلوب هو موضح في الشكل 3A و 3B. كانت الأرض عينات فيوزاريوم في النيتروجين السائل والمسحوق وجمعت في 10 مل أنابيب تفلون. وكانت العينات المحتضنة ثم 30 دقيقة مع تحلل العازلة ، المغلي لمدة 10 دقائق ، وطرد 2 مرات في درجة حرارة الغرفة (12000g لمدة 15 دقيقة). تم جمع supernatants والمحتضنة في -20 درجة مئوية مع هطول الأمطار العازلة بين عشية وضحاها. بعد الطرد المركزي في 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة 30000g ، تم غسلها الكريات من البروتينات عجلت 3 مرات مع الأسيتون الباردة التي تحتوي على DTT. أخيرا ، كانت كريات الهواء المجفف وكانت resolubilized البروتينات الموجودة في المخزن المؤقت وضع العلامات ، وتعديل درجة الحموضة إلى 8. تمت إزالة عينة فرعية مؤلفة من 30 مل لتقدير البروتين الكلي وتخزين طاف المتبقية في -20 درجة مئوية حتى رحلان البروتين. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. الجدول الزمني لهذا الإجراء. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. مخطط لشركات متعددة تجهيز العينة. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3atmb.jpg" alt="الشكل 3A" border="0" /> 3A الرقم. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3btmb.jpg" alt="الرقم 3B" border="0" /> 3B الرقم. الرجاء <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig3a.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الرقم 3A ، أو <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig3b.jpg">هنا</a> لنسخة أكبر من 3B الرقم. الأرقام - 3A ب مخططات انسيابية لاستخراج البروتين الداخلي (A : اليوم الأول ؛ B : اليوم الثاني). <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig4tmb.jpg" alt="الشكل 4" border="0" /> الشكل 4. صورة 1D مقتطفات من البروتين. تم تشغيل البروتينات حتى الهجرة كاملة من اللون الأزرق إلى نهاية الجل الذي ملطخة بيربل الحمم البركانية. الرجاء <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig4.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الرقم 4.

<ol>
	<li>Bridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Extraction+from+Fungi.">Protein Extraction from Fungi.</a> Protein Purification Protocols. , 39-48 (1996).</li><li>Jiao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+carbon+sources+on+trichothecene+production+and+Tri+gene+expression+by+Fusarium+graminearum+in+liquid+culture.">Effects of different carbon sources on trichothecene production and Tri gene expression by Fusarium graminearum in liquid culture.</a> FEMS Microbiol Lett. 285, 212-219 (2008).</li><li>Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+filamentous+fungi.">Proteomics of filamentous fungi.</a> Trends in Biotechnology. 25, 395-400 (2007).</li><li>Milles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+proteomic+approach+to+monitor+protein+synthesis+in+mycotoxin+producing+moulds.">Development of a proteomic approach to monitor protein synthesis in mycotoxin producing moulds.</a> Mycotoxin Res. 23, 161-165 (2007).</li><li>Morrison, N., Field, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concept+of+sample+in+OMICS+technology.">Concept of sample in OMICS technology.</a> OMICS. 10, 127-137 (2006).</li><li>O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+evolutionary+origins+of+the+fungus+causing+Panama+disease+of+banana:+Concordant+evidence+from+nuclear+and+mitochondrial+gene+genealogies.">Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies.</a> PNAS. 95, 2044-2049 (1998).</li><li>Paper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomics+of+extracellular+proteins+in+vitro+and+in+planta+from+the+pathogenic+fungus+Fusarium+graminearum.">Comparative proteomics of extracellular proteins in vitro and in planta from the pathogenic fungus Fusarium graminearum.</a> Proteomics. 7, 3171-3183 (2007).</li><li>Pasquali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+in+science.+Protocol+videos:+the+implications+for+research+and+society.">Video in science. Protocol videos: the implications for research and society.</a> EMBO Rep. 8, 712-716 (2007).</li><li>Taylor, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimum+information+about+a+proteomics+experiment+(MIAPE).">The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE).</a> Nat Biotechnol. 25, 887-893 (2007).</li><li>Taylor, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analyses+of+Fusarium+graminearum+grown+under+mycotoxin-inducing+conditions.">Proteomic analyses of Fusarium graminearum grown under mycotoxin-inducing conditions.</a> Proteomics. 8, 2256-2265 (2008).</li></ol>

الاهتمام مؤخرا في النهج البروتين داخل نطاق الأحياء الفطرية أدى إلى زيادة عدد المطبوعات باستخدام هذه التقنية (كما هو الحال في استعراض كيم وآخرون ، 2007). طرق لاستخراج البروتين تعتمد على مزيج من إجراءات استخراج ؛ غالبا ما وصفوه بصعوبة في المقاطع المنهجية وتتطلب خبرة في التعامل مع أساليب المشاكل المحتملة. كما لغيرها من النهج &quot;omics&quot; ، ووضع معايير لتجهيز العينات والبيانات الضرورية من أجل توليد معلومات علمية موثوقة. وعلاوة على ذلك ينبغي أن تكون العينات وإجراءات التلاعب صفها على نحو كاف من أجل السماح للتفسير مشترك بين مختلف التجارب نتيجة &quot;omics&quot;. سيكون هذا أمرا أساسيا لاستغلال كامل امكانيات عبر البيانات التعدين في الجينوميات ، البروتيوميات ، metabolomics... (موريسون وآخرون ، 2006). وقد تمت صياغة الحد الأدنى من المعلومات عن تجربة والبروتين قد تم تشكيل مجموعة عمل من أجل التصدي لجميع جوانب تجربة (جل الكهربائي ، مطياف الكتلة ، التفاعلات الجزيئية ، تعديلات البروتين ، البروتيوميات المعلوماتية وتجهيز عينة). في هذه اللحظة توجد معلومات محددة متاحة بشأن إجراءات تجهيز العينات. نظرا لأهمية إجراءات استخراج البروتين في تحديد نوعية البروتين النهائي من الدراسات ، من أجل تنفيذ الإجراءات التي يمكن أن تزيد التوحيد في إطار المبادئ التوجيهية MIAPE (تايلور وآخرون ، 2007) ، واقترحنا استخدام بروتوكول الفيديو بالتفصيل العينة التجهيز. وقد وصف الفيديو من التجارب تساهم بقدر كبير في زيادة عدد المعلومات عن تجهيز العينات التي قد تؤدي إلى أفضل استنساخ التجارب &quot;omics&quot; (باسكوالي ، 2007). في الواقع ، عبر استنساخ المختبرات هو شرط أساسي من أجل ضمان صحة نتائج البروتيوميات (http://www.fixingproteomics.org). يتأثر استنساخ عبر المختبر من قبل اثنين من العوامل : أدوات القياس المختلفة ، ومختلف العاملين التلاعب العينات. في البروتوكول وصفها ، فإننا نقترح على أداء البيولوجية يتطابق تضم مشغلي متعددة (الشكل 2 والفيديو) لزيادة موثوقية من البيانات (يتم اتخاذ أي تباين النتائج الفنية للفي الاعتبار). ويستند الإجراء الموضح لاستخراج البروتين في SDS والتدفئة. سبق ان عرضه هذا لضمان نقاء وكمية جيدة من البروتينات (جسر 1996). SDS مقرونا الغليان يذوب جدران الخلايا والبروتينات مسعور ويمنع تشكيل oligomers الأمطار التي تسقط من البروتينات. الغليان كما يسمح لتعطيل البروتياز. ويتم إنتاج نفس التأثير أيضا EDTA ، واستكمال PMSF مثبط البروتياز مصغرة. DTT يزيل الجسور في ثاني كبريتيد بين البروتينات وتيسير solubilization البروتين. من أجل إزالة SDS IEF قبل ، هي التي عجلت البروتينات الأسيتون / TCA / DTT. وعلاوة على ذلك ، والأسيتون / TCA / DTT الأمطار يسمح إزالة بعض الملوثات مثل الدهون والأحماض النووية ، وأملاح و / أو مركبات الفينول عند هذه المركبات موجودة. مثل الحزب الديمقراطي الصربي ، وهذه الجزيئات منع الهجرة جيدة خلال منتدى الطاقة الدولي. بعد هذا التساقط ، فمن الضروري أن يغسل البروتينات التي عجلت الأسيتون / DTT ، من أجل إزالة TCA لأنها يمكن أن تتداخل مع منتدى الطاقة الدولي. وإعداد نموذج جيد هو المفتاح لتحقيق نتائج جيدة. لهذا ، فإنه من الضروري أيضا تجنب تلوث البيئة البروتينات من العمل مع القفازات مسحوق الحرة واحترام الممارسات المختبرية الجيدة. من الناحية التقنية ، في إطار البروتوكول وصفها ، من أهم الخطوات للحصول على كميات كافية من البروتينات والنقاء وعلى مرحلتين. الأولى ، مرحلة طحن حيث التدمير الكامل للالخلية الأساسية للافراج عن البروتينات ، والثانية ، وتنقية البروتينات الكلية ، وهي المرحلة التي تشمل ازالة الغالبية العظمى من الحمض النووي ، والدهون وغيرها من الملوثات التي قد تتداخل مع الهجرة من البروتينات.

وسائل الاعلام والحلول PDA : 39 غرام سكر العنب آجار البطاطس (Difco) (1) ؛ L المياه المقطرة. V8 آغار : 200 مل V8 (كامبل ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، 2G CaCO3 (سيغما) ، آجار 16G (DIFCO) ، 800 مل ماء مقطر حث وسائل الاعلام توكسين : 1G K 2 هبو 4 ، بوكل 0.5g ، 0.5g MgSO 4 7H 2 O ، 10 ملغ FeEDTA ، حمض الجلوتاميك 2G L ، والسكروز 10G في 1L من الماء المقطر. تحلل الاحتياطي : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td></td><td> 100ML </td><td> التركيز النهائي </td><td></td></tr><tr><td> تريس - HCL pH8 </td><td> 5mL </td><td> 50mM </td><td> 1M </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 2G أو 10ML </td><td> 2 ٪ </td><td> 20 ٪ </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 500mL </td><td> 10MM </td><td> 2M </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 20mL </td><td> 0.1mM </td><td> 0.5M </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 200mL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> مثبط البروتياز كاملة مصغرة </td><td> 1 قرص </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ماء </td><td> QSP </td><td></td><td></td></tr></table> هطول الأمطار الاحتياطي : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td></td><td> 100ML </td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> TCA </td><td> 20mL </td><td> 20 ٪ </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 0.1mL </td><td> 0.1 ٪ </td></tr><tr><td> Aceton </td><td> QSP </td><td></td></tr></table> غسل الاحتياطي : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td></td><td> 100ML </td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 0.1mL </td><td> 0.1 ٪ </td></tr><tr><td> Aceton </td><td> 100ML </td><td></td></tr></table> وسمها الاحتياطي (مخزن في -18 درجة مئوية في aliquots الصغيرة) : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td></td><td> 1mL </td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> اليوريا </td><td> 140 ملغ </td><td> 7M </td></tr><tr><td> ثيويوريا </td><td> 50 ملغ </td><td> 2M </td></tr><tr><td> الفصلان </td><td> 40 ملغ </td><td> 4 ٪ </td></tr><tr><td> تريس </td><td> 30 ميكرولتر </td><td> 30 ملم </td></tr><tr><td> ماء </td><td> 1 مل </td><td></td></tr></table>

toxin induction and protein extraction from fusarium spp. cultures for proteomic studies

Fusaria والفطريات الخيطية قادرة على انتاج سموم مختلفة. السموم الفطرية مثل فيوزاريوم deoxynivalenol ، nivalenol ، T2 ، zearelenone ، fusaric حامض ، moniliformin ، الخ... لها آثار ضارة على صحة الإنسان والحيوان على حد سواء ، وتعتبر بعض العوامل المرضية و. وأظهرت دراسات البروتين أن تكون فعالة لآليات فك رموز إنتاج توكسين (تايلور وآخرون ، 2008) فضلا عن تحديد العوامل المسببة المحتملة (ورقة وآخرون ، 2007 ، Houterman وآخرون ، 2007) في Fusaria. لذا يصبح من الأساسي لتأسيس وسائل موثوق بها لمقارنة بين الدراسات البروتين من أجل الاعتماد على الاختلافات الحقيقية موجودة في تعبير البروتين بين التجارب وسلالات والمختبرات. وينبغي أن الإجراء الذي سيتم وصفه تساهم في زيادة مستوى البروتين توحيد الإجراءات من قبل اثنين من الطرق. يتم استخدام بروتوكول تصويره لزيادة مستوى التفاصيل التي يمكن وصفها بدقة. وعلاوة على ذلك ، وتوافر إجراءات موحدة لعملية بيولوجية يعيد ينبغي ضمان متانة أعلى من البيانات ، مع الأخذ في الاعتبار أيضا عامل استنساخ الإنسان داخل الإجراء التقني للاستخراج. وصف البروتوكول يتطلب 16 يوما للانتهاء منه : أربعة عشر يوما للثقافات ويومين لاستخراج البروتين (الشكل 1). لفترة وجيزة ، وتزرع سلالات فيوزاريوم على وسائل الاعلام الصلبة لمدة 4 أيام ، ويتم بعد ذلك مجزأة يدويا ونقل الى وسائل الاعلام إحداث تعديل توكسين (جياو وآخرون ، 2008) لمدة 10 يوما. يتم جمعها عن طريق الترشيح من خلال أفطورة طبقة Miracloth. يتم تنفيذ طاحنة في غرفة باردة. شركات مختلفة تقوم استخراج نسخ متماثلة (ن = 3) من أجل أن تأخذ في الاعتبار تحيز بسبب اختلاف التقنية (الشكل 2). واستند على استخراج العازلة SDS / DTT كما هو موضح في تايلور وآخرون. (2008) مع تعديلات طفيفة. مطلوب استخراج البروتين الكلي عملية ترسيب البروتينات باستخدام Aceton / TCA / DTT غسل العازلة بين عشية وضحاها والأسيتون / DTT (الشكل 3A ، 3B). وأخيرا resolubilized البروتينات في المنطقة العازلة بروتين وضع العلامات وكميا. وكانت نتائج استخراج تصور على هلام 1D (الشكل 4 ، SDS - PAGE) ، قبل الشروع في المواد الهلامية 2D (IEF / SDS - PAGE). ويمكن تطبيق نفس الإجراء على غيرها من البروتين تحليلات وسائل الإعلام وتزايد الفطريات الخيطية الأخرى (مايلز وآخرون ، 2007).

Watch this Scientific Journal Video about Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies at JoVE.com

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

استخراج البروتين لتحليل البروتين في الأنواع الفطرية تتطلب مستويات عالية من التوحيد القياسي لإنجازها وفقا مع الحد الأدنى من المعلومات عن التجربة البروتين (MIAPE) المبادئ التوجيهية. نقدم الفيديو البروتوكول الذي يتضمن إجراء لتقليل التحيز التجريبية خلال تحريض واستخراج السموم من البروتين<em&gt; فيوزاريوم النيابة.</em

التعريفي واستخراج السم من البروتين فيوزاريوم النيابة. الثقافات للدراسات البروتين

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

toxin-induction-protein-extraction-from-fusarium-spp-cultures-for

Research

JoVE Journal

Biology

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

16.9K Views.  Centre de Recherche Public-Gabriel Lippmann. استخراج البروتين لتحليل البروتين في الأنواع الفطرية تتطلب مستويات عالية من التوحيد القياسي لإنجازها وفقا مع الحد الأدنى من المعلومات عن التجربة البروتين (MIAPE) المبادئ التوجيهية. نقدم الفيديو البروتوكول الذي يتضمن إجراء لتقليل التحيز التجريبية خلال تحريض واست?...

Video: Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

الجزئي تشريح الدماغ الجرذ لاستخراج الحمض النووي الريبي أو البروتينات من منطقة الدماغ الخاصة

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

الكهربي فصل البروتينات

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Interview: Protein Folding and Studies of Neurodegenerative Diseases

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the protein folding is at the core of the modern biology. In addition to their traditional biochemical functions, proteins can mediate transfer of biological information and therefore can be considered a genetic material. This recently discovered function of proteins has important implications for studies of human disorders. Dr. Lindquist also describes current experimental approaches to investigate the mechanism of neurodegenerative diseases based on genetic studies in model organisms.

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the protein folding is at the core of the modern biology. In addition to their traditional biochemical functions, proteins can mediate transfer of biological information and therefore can be considered a genetic material. This recently discovered function of proteins has important implications for studies of human disorders. Dr. Lindquist also describes current experimental approaches to investigate the mechanism of neurodegenerative diseases based on genetic studies in model organisms.

مقابلة : طي البروتين ودراسات أمراض الاعصاب

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

التحضير للثقافات الجرذ الحصى الدماغ العصبية للتنمية والدراسات الدبقية

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces fruiting bodies, called perithecia, on carrot agar. Perithecia contain numerous tissue types, produced at specific stages of perithecium development. These include (in order of appearance) formation of the perithecium initials (which give rise to the ascogenous hyphae), the outer wall, paraphyses (sterile mycelia which occupy the center of the perithecium until the asci develop), the asci, and the ascospores within the asci14. The development of each of these tissues is separated by approximately 24 hours and has been the basis of transcriptomic studies during sexual development12,8. Refer to Hallen et al. (2007) for a more thorough description of development, including photographs of each stage. Here, we present the methods for generating and harvesting synchronously developing lawns of perithecia for temporal studies of gene regulation, development, and physiological processes. Although these methods are written specifically to be used with F. graminearum, the techniques can be used for a variety of other fungi, provided that fruiting can be induced in culture and there is some synchrony to development. We have recently adapted this protocol to study the sexual development of F. verticillioides. Although individual perithecia must be hand picked in this species, because a lawn of developing perithecia could not be induced, the process worked well for studying development (Sikhakolli and Trail, unpublished).
The most important function of fungal fruiting bodies is the dispersal of spores. In many of the species of Ascomycota (ascus producing fungi), spores are shot from the ascus, due to the generation of turgor pressure within the ascus, driving ejection of spores (and epiplasmic fluid) through the pore in the ascus tip2,7. Our studies of forcible ascospore discharge have resulted in development of a "spore discharge assay", which we use to screen for mutations in the process. Here we present the details of this assay.
F. graminearum is homothallic, and thus can form fruiting bodies in the absence of a compatible partner. The advantage of homothallism is that crossing is not necessary to generate offspring homozygous for a particular trait, a facet that has facilitated the study of sexual development in this species14,7. However, heterothallic strains have been generated that can be used for crossing5,9. It is also possible to cross homothallic strains to obtain mutants for several genes in one strain1. This is done by coinoculating one Petri dish with 2 strains. Along the meeting point, the majority of perithecia will be recombinant (provided a mutation in one of the parent strains does not inhibit outcrossing). As perithecia age, they exude ascospores en masse instead of forcibly discharging them. The resulting spore exudate (called a cirrhus) sits at the tip of the perithecium and can easily be removed for recovery of individual spores. Here we present a protocol to facilitate the identification of recombinant perithecia and the recovery of recombinant progeny.

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Sexual crosses and isolation of recombinant progeny are important research tools for the filamentous fungus, Fusarium graminearum, The techniques necessary successfully carry out these processes are presented.

الجنسي للتنمية والتفريغ في بوغ زقي فيوزاريوم graminearum</em

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

الأيضية وصفها وغشاء التقطير للالمقارن تحليل البروتين من<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em&gt; الثقافات تعليق خلية

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

إعداد نموذج البروتين من الفورمالين الثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ من نسيج

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional characterization of venom proteins has important biomedical applications, including the identification of drug leads or probes for cellular receptors. Spiders are the most species rich clade of venomous organisms, but the venoms of only a few species are well-understood, in part due to the difficulty associated with collecting minute quantities of venom from small animals. This paper presents a protocol for the collection of venom from spiders using electrical stimulation, demonstrating the procedure on the Western black widow (Latrodectus hesperus). The collected venom is useful for varied downstream analyses including direct protein identification via mass spectrometry, functional assays, and stimulation of venom gene expression for transcriptomic studies. This technique has the advantage over protocols that isolate venom from whole gland homogenates, which do not separate genuine venom components from cellular proteins that are not secreted as part of the venom. Representative results demonstrate the detection of known venom peptides from the collected sample using mass spectrometry. The venom collection procedure is followed by a protocol for dissecting spider venom glands, with results demonstrating that this leads to the characterization of venom-expressed proteins and peptides at the sequence level.

This article provides a protocol for the extraction of venom from spiders using electrical stimulation in order to 1) conduct proteomic characterization, 2) stimulate venom gland gene expression, and 3) perform functional studies of venoms. This is followed by a description of venom gland microdissections for gene expression studies.

استخراج السم والسم الغدة Microdissections من العناكب عن البروتين وتحليلات Transcriptomic

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields of regenerative medicine, basic cell biology, treatment of diseases, and reprogramming of cells. Here, we describe a step by step protocol for generation of modified mRNA with reduced immune activation potential and increased stability, quality control of produced mRNA, transfection of cells with mRNA and verification of the induced protein expression by flow cytometry. Up to 3 days after a single transfection with eGFP mRNA, the transfected HEK293 cells produce eGFP. In this video article, the synthesis of eGFP mRNA is described as an example. However, the procedure can be applied for production of other desired mRNA. Using the synthetic modified mRNA, cells can be induced to transiently express the desired proteins, which they normally would not express.

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In this video article, we describe the in vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in cells.

في المختبر توليف التعديل مرنا للتحريض التعبير البروتين في الخلايا البشرية

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

البروتين التسليم المباشر للخلايا الثدييات عن طريق خلية قابلة للاختراق السيستئين<sub&gt; 2</sub&gt; العاهل<sub&gt; 2</sub&gt; مجالات الزنك الاصبع

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...