אנו מודים Servane Contal ובוריס Untereiner על תרומתו הטכנית שלהם. אנו מכירים את התמיכה של הפרויקט FNR &quot;FUTOX&quot;.

הפרוטוקול דורש 16 ימים להשלמתו. הזמן הוא מפורט באיור 1. פרטים להכנת חיץ <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת למאגר תמוגה (3mL לדגימה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת למאגר כביסה (50 מ&quot;ל לדגימה). מאגר זה צריך להיות מקורר מראש ומאוחסנים ב -20 ° C במקפיא עד לניתוח נוסף ושמרה על הקרח במהלך ההליך כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת למאגר משקעים (20mL לדגימה). מאגר זה צריך להיות מקורר מראש ומאוחסנים ב -20 ° C במקפיא עד הצורך ושמרה על הקרח במהלך ההליך כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבודה צריכה להתבצע מעדיפים לתוך תא קר 4 ° C. </li></ul> הפטרייה מינים שלושה זנים המשמשים מנתח proteomic סווגו להיות graminearum Fusarium על סמך תכונות מורפולוגיות שלהם תרגום התארכות-Alpha-1 גורם ניתוח (אודונל et al., 1998) זנים אלו שייכים לאוסף ליפמן CRP-גבריאל נשמרו ואוחסנו ב - 80 מעלות 15% גליצרול. הכנת mycelia פטריות שעובדו על V8 במשך 4 ימים של 25 מעלות צלזיוס לסירוגין תקופה האור והחושך כל 12 שעות. תרבויות היו מפוצלים באמצעות להב סטרילי חתיכות של התרבויות הללו שימשו כדי לחסן 250 מ&quot;ל צלוחיות Erlenmeyer המכילה 100 מ&quot;ל של רעלן וישכנע התקשורת. Mycelia נבצרו לאחר 10 ימים הופרדו בינוני ידי סינון התרבות עם מסנן סטרילי. Mycelia נשטפו 3 פעמים עם מים סטריליים כדי להסיר שאריות בינוני ותרכובות אחרות. לאחר מכן, אנו קפא מיד את התאים על ידי הוספת חנקן נוזלי ושמר את דגימות ב -80 ° C. תיאור כללי של מיצוי החלבון דגימות חלבון חולצו באמצעות השיטה המתוארת 3A הדמות 3B. הדגימות היו Fusarium הקרקע בחנקן נוזלי ואת אבקת נאסף 10 מ&quot;ל צינורות טפלון. דגימות הודגרו אז 30 דקות עם למאגר תמוגה, מורתחים במשך 10 דקות, centrifuged 2 פעמים בטמפרטורת החדר (12000g במשך 15 דקות). Supernatants נאספו מודגרות ב -20 מעלות עם משקעים חיץ בין לילה. לאחר צנטריפוגה ב 4 ° C 30000g במשך 45 דקות, את כדורי של חלבונים זירז נשטפו 3 פעמים עם אצטון קר המכילה DTT. לבסוף, היו כדורי אוויר יבש החלבונים היו resolubilized במאגר תיוג, התאמת ה-pH ל 8. מדגם קטן של 30 מ&quot;ל הוסר עבור כימות חלבון הכולל supernatant הנותרים אוחסן ב -20 ° C עד אלקטרופורזה חלבון. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. ציר הזמן של ההליך. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. Scheme למפעילים מרובים מדגם עיבוד. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3atmb.jpg" alt="איור 3a" border="0" /> איור 3 א. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3btmb.jpg" alt="איור 3b" border="0" /> איור 3 ב. אנא <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig3a.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 3a, או <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig3b.jpg">כאן</a> לגרסה גדולה יותר של 3b דמות. דמויות 3a-b תרשימי זרימה לתהליך מיצוי החלבון (A: יום ראשון, ב &#39;: היום השני).. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig4tmb.jpg" alt="איור 4" border="0" /> איור 4. 1D תמונה של תמציות חלבון. חלבונים נוהלו עד הגירה מלאה של כחול עד סוף הג&#39;ל כי היה מוכתם סגול לבה. אנא <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig4.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 4.

<ol>
	<li>Bridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Extraction+from+Fungi.">Protein Extraction from Fungi.</a> Protein Purification Protocols. , 39-48 (1996).</li><li>Jiao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+carbon+sources+on+trichothecene+production+and+Tri+gene+expression+by+Fusarium+graminearum+in+liquid+culture.">Effects of different carbon sources on trichothecene production and Tri gene expression by Fusarium graminearum in liquid culture.</a> FEMS Microbiol Lett. 285, 212-219 (2008).</li><li>Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+filamentous+fungi.">Proteomics of filamentous fungi.</a> Trends in Biotechnology. 25, 395-400 (2007).</li><li>Milles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+proteomic+approach+to+monitor+protein+synthesis+in+mycotoxin+producing+moulds.">Development of a proteomic approach to monitor protein synthesis in mycotoxin producing moulds.</a> Mycotoxin Res. 23, 161-165 (2007).</li><li>Morrison, N., Field, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concept+of+sample+in+OMICS+technology.">Concept of sample in OMICS technology.</a> OMICS. 10, 127-137 (2006).</li><li>O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+evolutionary+origins+of+the+fungus+causing+Panama+disease+of+banana:+Concordant+evidence+from+nuclear+and+mitochondrial+gene+genealogies.">Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies.</a> PNAS. 95, 2044-2049 (1998).</li><li>Paper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomics+of+extracellular+proteins+in+vitro+and+in+planta+from+the+pathogenic+fungus+Fusarium+graminearum.">Comparative proteomics of extracellular proteins in vitro and in planta from the pathogenic fungus Fusarium graminearum.</a> Proteomics. 7, 3171-3183 (2007).</li><li>Pasquali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+in+science.+Protocol+videos:+the+implications+for+research+and+society.">Video in science. Protocol videos: the implications for research and society.</a> EMBO Rep. 8, 712-716 (2007).</li><li>Taylor, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimum+information+about+a+proteomics+experiment+(MIAPE).">The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE).</a> Nat Biotechnol. 25, 887-893 (2007).</li><li>Taylor, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analyses+of+Fusarium+graminearum+grown+under+mycotoxin-inducing+conditions.">Proteomic analyses of Fusarium graminearum grown under mycotoxin-inducing conditions.</a> Proteomics. 8, 2256-2265 (2008).</li></ol>

עניין אחרונים גישות proteomic בתוך תחום הביולוגיה פטרייתי הוביל מספר מוגבר של פרסומים באמצעות טכניקה זו (הנסקרת כמו קים et al. 2007). שיטות להפקת חלבון מסתמכים על שילוב של מיצוי הליכים, הם לעתים קרובות תיאר בקושי בסעיפים מתודולוגיים דורשים מומחיות בהתמודדות עם שיטות פתרון בעיות פוטנציאליות. באשר &quot;omics&quot; גישות אחרות, הגדרת סטנדרטים עבור עיבוד מדגם נתונים היא חיונית על מנת ליצור מידע מדעי אמין. יתר על כן דגימות ונהלים של מניפולציה יש לתאר באופן הולם על מנת לאפשר פרשנות תוצאה משותף בין ניסויים שונים &quot;omics&quot;. זה יהיה חיוני ניצול מלא של פוטנציאל הכרייה צולבות נתונים גנומיקה, metabolomics, ... (מוריסון et al. 2006). מידע מינימלי על ניסוי proteomic כבר ניסחו וקבוצות עבודה הוקמו כדי להתמודד עם כל ההיבטים של ניסוי (ג&#39;ל אלקטרופורזה, ספקטרומטריית מסה, אינטראקציות מולקולריות, שינויים חלבון, מידענות Proteomics, עיבוד המדגם). כרגע אין מידע מוגדר זמינים הליכי עיבוד המדגם. לאור החשיבות של מיצוי הליכים חלבון בקביעת איכות הסופי של מחקרים proteomic, כדי ליישם נהלים יכולים להגדיל תקינה במסגרת הנחיות MIAPE (Taylor et al. 2007), הצענו את השימוש בפרוטוקול וידאו המפרט מדגם עיבוד. תיאור וידאו של ניסויים עשוי לתרום באופן משמעותי כדי להגדיל את מספר מידע על עיבוד המדגם שעלולים לגרום שחזור טוב יותר של &quot;omics&quot; ניסויים (Pasquali, 2007). ואכן, שחזור פני מעבדות היא דרישה בסיסית כדי להבטיח את תקפות תוצאות proteomics (http://www.fixingproteomics.org). שחזור צולבת מעבדה מושפע משני גורמים: instrumentations שונים המפעילים מניפולציות שונות דגימות. בפרוטוקול שתואר, אנו מציעים לבצע ביולוגי משכפל מעורבים מפעילי מרובים (איור 2 ו - וידאו) כדי להגביר את האמינות של הנתונים (כלומר וריאציה טכני של התוצאות נלקחת בחשבון). ההליך המתואר להפקת חלבון מבוססת על SDS וחימום. זה היה הראו בעבר כדי להבטיח טוהר כמות טובה של חלבונים (Bridge 1996). SDS יחד עם רותחים מתמוסס קירות התא, חלבונים הידרופובי ומונע היווצרות משקעים oligomers כי להפיל של חלבונים. רתיחה מאפשר גם איון של פרוטאזות. את אותו אפקט מיוצר גם על ידי EDTA, PMSF ו מעכב פרוטאז להשלים מיני. DTT מסיר גשרים דיסולפיד פנימה בין חלבונים להקל solubilization חלבון. על מנת להסיר SDS לפני IEF, חלבונים הם זירז ידי אצטון / TCA / DTT. יתר על כן, אצטון / TCA / DTT משקעים מאפשר הסרת חלק מזהמים כגון שומנים, חומצות גרעין, מלחי ו / או תרכובות פנוליות כאשר תרכובות אלו נמצאים. כמו SDS, מולקולות אלה ולמנוע הגירה טוב במהלך IEF. בעקבות משקעים זה, יש צורך לשטוף את החלבונים זירז ידי אצטון / DTT, על מנת להסיר TCA כפי שהוא יכול להפריע IEF. מדגם הכנה טובה היא המפתח לתוצאות טובות. לשם כך, היא גם חיונית כדי למנוע זיהום של חלבונים מן הסביבה לעבוד עם כפפות אבקת חופשי כיבוד נהלי מעבדה טובים. מנקודת מבט טכנית, במסגרת פרוטוקול המתואר, השלבים הקריטיים ביותר להשגת כמות מספקת של חלבונים וטוהר שני שלבים. ראשית, שלב שבו שחיקה הרס מוחלט של התא חיונית לשחרור חלבונים, ושנית, טיהור חלבונים הכולל, המקיף את שלב הסרת רוב ה-DNA, שומנים ומזהמים אחרים שעשויים להפריע הגירה של חלבונים.

מדיה ופתרונות מחשב כף יד: 39 גרם תפוחי אדמה דקסטרוז אגר (Difco); 1 ליטר מים מזוקקים. אגר V8: 200 מ&quot;ל V8 (קמפבל, ארה&quot;ב), 2g CaCO3 (Sigma), אגר 16G (DIFCO), 800 מ&quot;ל מים מזוקקים גרימת רעלן התקשורת: 1g K 2 HPO 4, 0.5g KCl, 0.5g MgSO 4 7H 2 O, 10 מ&quot;ג FeEDTA, 2g חומצה גלוטמית L, סוכרוז 10g ב 1 ליטר של מים מזוקקים. תמוגה חוצץ: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td></td><td> 100 מ&quot;ל </td><td> הריכוז הסופי </td><td></td></tr><tr><td> טריס-HCL pH8 </td><td> 5 מ&quot;ל </td><td> 50mm </td><td> 1M </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 2G או 10 מ&quot;ל </td><td> 2% </td><td> 20% </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 500ml </td><td> 10mm </td><td> 2M </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 20mL </td><td> 0.1mm </td><td> 0.5m </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 200 מ&quot;ל </td><td></td><td></td></tr><tr><td> השלם מעכב פרוטאז מיני </td><td> 1 לוח </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מים </td><td> Qsp </td><td></td><td></td></tr></table> רטיבות הצפת: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td></td><td> 100 מ&quot;ל </td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> TCA </td><td> 20mL </td><td> 20% </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 0.1mL </td><td> 0.1% </td></tr><tr><td> Aceton </td><td> Qsp </td><td></td></tr></table> כביסה חוצץ: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td></td><td> 100 מ&quot;ל </td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 0.1mL </td><td> 0.1% </td></tr><tr><td> Aceton </td><td> 100 מ&quot;ל </td><td></td></tr></table> Labelling חוצץ (חנות ב -18 מעלות צלזיוס aliquots קטן): <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td></td><td> 1mL </td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> דשן </td><td> 140 מ&quot;ג </td><td> 7m </td></tr><tr><td> Thiourea </td><td> 50 מ&quot;ג </td><td> 2M </td></tr><tr><td> בחורים </td><td> 40 מ&quot;ג </td><td> 4% </td></tr><tr><td> טריס </td><td> 30 μL </td><td> 30 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> מים </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td></td></tr></table>

toxin induction and protein extraction from fusarium spp. cultures for proteomic studies

Fusaria הם פטריות פילמנטיות מסוגל לייצר רעלים שונים. Fusarium mycotoxins כגון deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric חומצה, moniliformin, וכו &#39;.. יש השפעות שליליות על הבריאות הן של בני אדם וחיות וחלקם נחשבים כגורמים pathogenicity. מחקרים הראו proteomic להיות יעילים בפענוח מנגנוני ייצור הרעלן (Taylor et al., 2008), כמו גם לזיהוי גורמים פתוגניים פוטנציאל (נייר et al. 2007, Houterman et al. 2007) ב Fusaria. זה הופך אפוא יסוד להקים שיטות אמין להשוואה בין מחקרים proteomic כדי להסתמך על ההבדלים האמיתיים למצוא ביטוי חלבון בין ניסויים, זנים ומעבדות. הליך זה יתוארו לתרום ברמה מוגברת של סטנדרטיזציה של הנהלים proteomic על ידי שתי דרכים. פרוטוקול צולם משמש כדי להגדיל את רמת הפרטים ניתן לתאר בדיוק. יתר על כן, את הזמינות של נהלים סטנדרטיים כדי תהליך ביולוגי משכפל צריך להבטיח עמידות גבוהה יותר של נתונים, תוך לקיחה בחשבון גם את הגורם האנושי בתוך reproducibility הטכני של ההליך החילוץ. פרוטוקול המתואר דורש 16 ימים להשלמת שלו: ארבעה עשר ימים עבור תרבויות יומיים להפקת חלבונים (איור 1). בקצרה, זנים Fusarium גדלים על התקשורת מוצק במשך 4 ימים, הם מפוצלים אז ידנית ומועברים תוך גרימת מדיה שונה רעלן (יאו et al, 2008.) במשך 10 ימים. תפטיר נאסף על ידי סינון דרך שכבת Miracloth. גריסה מבוצעת בחדר קר. מפעילי שונים שבוצעו מיצוי משכפל (n = 3) על מנת לקחת בחשבון את ההטיה עקב שינויים טכניים (איור 2). הפקת התבסס על מאגר SDS / DTT כמתואר Taylor et al. (2008) עם שינויים קלים. מיצוי חלבון סך נדרש תהליך משקעים של חלבונים באמצעות Aceton / TCA / DTT כביסה חיץ בין לילה אצטון / DTT (דמות 3a, 3b). חלבונים היו resolubilized לבסוף חיץ חלבון תיוג לכמת. תוצאות ממוצא היו דמיינו את הג&#39;ל 1D (איור 4, SDS-PAGE), לפני שתמשיך 2D ג&#39;ל (IEF / SDS-PAGE). ההליך אותו ניתן ליישם עבור ניתוחים proteomic על התקשורת גדל אחרים ופטריות פילמנטיות אחרים (מיילס et al. 2007).

Watch this Scientific Journal Video about Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies at JoVE.com

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

מיצוי חלבון עבור ניתוחים proteomic במינים פטרייתי דורש רמה גבוהה של סטנדרטיזציה כדי להתבצע על פי מידע המינימום על ניסוי (MIAPE) הנחיות proteomic. אנו מציגים וידאו פרוטוקול הכולל הליך מזעור הטיה במהלך הניסוי אינדוקציה רעלן והוצאה חלבון מן<em&gt; Fusarium spp.</em

רעלן אינדוקציה ואת מיצוי חלבון מן Fusarium Spp. תרבויות ללימודי proteomic

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

toxin-induction-protein-extraction-from-fusarium-spp-cultures-for

Research

JoVE Journal

Biology

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

16.9K Views.  Centre de Recherche Public-Gabriel Lippmann. מיצוי חלבון עבור ניתוחים proteomic במינים פטרייתי דורש רמה גבוהה של סטנדרטיזציה כדי להתבצע על פי מידע המינימום על ניסוי (MIAPE) הנחיות proteomic. אנו מציגים וידאו פרוטוקול הכולל הליך מזעור הטיה במהלך הניסוי אינדוקציה רעלן והוצאה חלבון מן Fusarium spp.

Video: Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

Micro-דיסקציה של מוח החולדה עבור הפקת RNA או חלבון מן אזור מסוים במוח

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

ההפרדה Electrophoretic של חלבונים

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Interview: Protein Folding and Studies of Neurodegenerative Diseases

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the protein folding is at the core of the modern biology. In addition to their traditional biochemical functions, proteins can mediate transfer of biological information and therefore can be considered a genetic material. This recently discovered function of proteins has important implications for studies of human disorders. Dr. Lindquist also describes current experimental approaches to investigate the mechanism of neurodegenerative diseases based on genetic studies in model organisms.

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the protein folding is at the core of the modern biology. In addition to their traditional biochemical functions, proteins can mediate transfer of biological information and therefore can be considered a genetic material. This recently discovered function of proteins has important implications for studies of human disorders. Dr. Lindquist also describes current experimental approaches to investigate the mechanism of neurodegenerative diseases based on genetic studies in model organisms.

ראיון: קיפול חלבונים ולימודי של מחלות ניווניות

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

הכנת המוח עכברוש תרבויות מצטבר עבור Neuron ופיתוח מחקרים גליה

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces fruiting bodies, called perithecia, on carrot agar. Perithecia contain numerous tissue types, produced at specific stages of perithecium development. These include (in order of appearance) formation of the perithecium initials (which give rise to the ascogenous hyphae), the outer wall, paraphyses (sterile mycelia which occupy the center of the perithecium until the asci develop), the asci, and the ascospores within the asci14. The development of each of these tissues is separated by approximately 24 hours and has been the basis of transcriptomic studies during sexual development12,8. Refer to Hallen et al. (2007) for a more thorough description of development, including photographs of each stage. Here, we present the methods for generating and harvesting synchronously developing lawns of perithecia for temporal studies of gene regulation, development, and physiological processes. Although these methods are written specifically to be used with F. graminearum, the techniques can be used for a variety of other fungi, provided that fruiting can be induced in culture and there is some synchrony to development. We have recently adapted this protocol to study the sexual development of F. verticillioides. Although individual perithecia must be hand picked in this species, because a lawn of developing perithecia could not be induced, the process worked well for studying development (Sikhakolli and Trail, unpublished).
The most important function of fungal fruiting bodies is the dispersal of spores. In many of the species of Ascomycota (ascus producing fungi), spores are shot from the ascus, due to the generation of turgor pressure within the ascus, driving ejection of spores (and epiplasmic fluid) through the pore in the ascus tip2,7. Our studies of forcible ascospore discharge have resulted in development of a "spore discharge assay", which we use to screen for mutations in the process. Here we present the details of this assay.
F. graminearum is homothallic, and thus can form fruiting bodies in the absence of a compatible partner. The advantage of homothallism is that crossing is not necessary to generate offspring homozygous for a particular trait, a facet that has facilitated the study of sexual development in this species14,7. However, heterothallic strains have been generated that can be used for crossing5,9. It is also possible to cross homothallic strains to obtain mutants for several genes in one strain1. This is done by coinoculating one Petri dish with 2 strains. Along the meeting point, the majority of perithecia will be recombinant (provided a mutation in one of the parent strains does not inhibit outcrossing). As perithecia age, they exude ascospores en masse instead of forcibly discharging them. The resulting spore exudate (called a cirrhus) sits at the tip of the perithecium and can easily be removed for recovery of individual spores. Here we present a protocol to facilitate the identification of recombinant perithecia and the recovery of recombinant progeny.

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Sexual crosses and isolation of recombinant progeny are important research tools for the filamentous fungus, Fusarium graminearum, The techniques necessary successfully carry out these processes are presented.

התפתחות מינית והפרשות Ascospore ב Fusarium graminearum</em

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא תרבויות השעיה

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

לדוגמא הכנת proteomic מפורמלין קבועה ורקמות פרפין Embedded

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional characterization of venom proteins has important biomedical applications, including the identification of drug leads or probes for cellular receptors. Spiders are the most species rich clade of venomous organisms, but the venoms of only a few species are well-understood, in part due to the difficulty associated with collecting minute quantities of venom from small animals. This paper presents a protocol for the collection of venom from spiders using electrical stimulation, demonstrating the procedure on the Western black widow (Latrodectus hesperus). The collected venom is useful for varied downstream analyses including direct protein identification via mass spectrometry, functional assays, and stimulation of venom gene expression for transcriptomic studies. This technique has the advantage over protocols that isolate venom from whole gland homogenates, which do not separate genuine venom components from cellular proteins that are not secreted as part of the venom. Representative results demonstrate the detection of known venom peptides from the collected sample using mass spectrometry. The venom collection procedure is followed by a protocol for dissecting spider venom glands, with results demonstrating that this leads to the characterization of venom-expressed proteins and peptides at the sequence level.

This article provides a protocol for the extraction of venom from spiders using electrical stimulation in order to 1) conduct proteomic characterization, 2) stimulate venom gland gene expression, and 3) perform functional studies of venoms. This is followed by a description of venom gland microdissections for gene expression studies.

הפקה של ארס וארס בלוטת Microdissections מהעכבישים לproteomic וניתוח transcriptomic

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields of regenerative medicine, basic cell biology, treatment of diseases, and reprogramming of cells. Here, we describe a step by step protocol for generation of modified mRNA with reduced immune activation potential and increased stability, quality control of produced mRNA, transfection of cells with mRNA and verification of the induced protein expression by flow cytometry. Up to 3 days after a single transfection with eGFP mRNA, the transfected HEK293 cells produce eGFP. In this video article, the synthesis of eGFP mRNA is described as an example. However, the procedure can be applied for production of other desired mRNA. Using the synthetic modified mRNA, cells can be induced to transiently express the desired proteins, which they normally would not express.

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In this video article, we describe the in vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in cells.

במבחנת הסינתזה של mRNA השתנה לאינדוקציה של ביטוי חלבון בתאים אנושיים

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי Cys Cell-חדיר<sub&gt; 2</sub&gt; כלי-<sub&gt; 2</sub&gt; Domains אבץ האצבע

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...