Nous tenons à remercier Servane Contal et Boris Untereiner pour leur contribution technique. Nous reconnaissons l&#39;appui du FNR &quot;FUTOX&quot; du projet.

Le protocole exige 16 jours pour son achèvement. Le calendrier est détaillé dans la figure 1. Détails pour la préparation des tampons <ul><li> Préparation du tampon de lyse (3 ml par échantillon). </li><li> Préparation du tampon de lavage (50 ml par échantillon). Ce tampon doit être pré-refroidis et conservés à -20 ° C dans le congélateur jusqu&#39;à ce que d&#39;autres analyses et conservés sur la glace pendant toute la procédure. </li><li> Préparation du tampon de précipitation (20 ml par échantillon). Ce tampon doit être pré-refroidis et conservés à -20 ° C dans le congélateur jusqu&#39;à ce que nécessaire et conservé sur la glace durant toute la procédure. </li><li> Les travaux devraient préférentiellement être réalisée dans la chambre froide à 4 ° C. </li></ul> Espèces de champignons Trois souches utilisées pour les analyses protéomiques ont été classés à Fusarium graminearum sur la base de leurs caractéristiques morphologiques et Alpha-1-facteur d&#39;élongation de la traduction d&#39;analyse (O&#39;Donnell et al., 1998) Ces souches appartiennent à la collection du CRP-Gabriel Lippmann et ont été maintenus et conservés à - 80 ° C dans 15% de glycérol. Préparation du mycélium Les champignons ont été cultivés sur V8 de 4 jours à 25 ° C alternant période de lumière et l&#39;obscurité à chaque 12 heures. Les cultures ont été fragmentés en utilisant une lame stérile et des morceaux de ces cultures ont été utilisés pour inoculer 250 ml erlenmeyers contenant 100 ml de toxine induisant des médias. Mycéliums ont été récoltés après 10 jours et ont été séparés de moyenne en filtrant la culture avec un filtre stérile. Mycéliums ont été lavés 3 fois avec de l&#39;eau stérile pour enlever les résidus moyennes et d&#39;autres composés. Nous avons alors immédiatement gelé les cellules en ajoutant l&#39;azote liquide et conservés les échantillons à -80 ° C. Description générale de l&#39;extraction des protéines Les échantillons de protéines ont été extraites selon la méthode décrite dans la figure 3A et 3B. Les échantillons de Fusarium ont été broyés dans l&#39;azote liquide et la poudre a été recueilli dans des tubes en téflon 10 ml. Les échantillons ont ensuite été incubées 30 minutes avec le tampon de lyse, bouillis pendant 10 minutes, puis centrifugé 2 fois à température ambiante (12000g pendant 15 minutes). Les surnageants ont été recueillis et mis en incubation à -20 ° C avec un tampon de précipitations durant la nuit. Après centrifugation à 4 ° C pendant 45 minutes Acheter 30000G, les boulettes de protéines précipitées ont été lavés 3 fois avec de l&#39;acétone froide contenant du DTT. Enfin, les granulés sont séchés à l&#39;air et les protéines ont été remis en solution dans le tampon d&#39;étiquetage, ajuster le pH à 8. Un sous-échantillon de 30 ml a été retiré pour la quantification des protéines totales et le surnageant restant a été stocké à -20 ° C jusqu&#39;à ce que l&#39;électrophorèse des protéines. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Chronologie de la procédure. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Schéma de plusieurs opérateurs de l&#39;échantillon de traitement. <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig3a.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3atmb.jpg" alt="La figure 3a" border="0" /></a> Figure 3a. <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig3b.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3btmb.jpg" alt="Figure 3b" border="0" /></a> Figure 3b. Figures 3a-b diagrammes de flux pour la procédure d&#39;extraction de protéines (A: premier jour; B: deuxième jour).. <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig4tmb.jpg" alt="Figure 4" border="0" /></a> Figure 4. Image 1D d&#39;extraits protéiques. Les protéines ont été déroulera jusqu&#39;au migration complète de bleu à la fin du gel qui a été coloré avec du violet de lave.

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	<li>Bridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Extraction+from+Fungi.">Protein Extraction from Fungi.</a> Protein Purification Protocols. , 39-48 (1996).</li><li>Jiao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+carbon+sources+on+trichothecene+production+and+Tri+gene+expression+by+Fusarium+graminearum+in+liquid+culture.">Effects of different carbon sources on trichothecene production and Tri gene expression by Fusarium graminearum in liquid culture.</a> FEMS Microbiol Lett. 285, 212-219 (2008).</li><li>Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+filamentous+fungi.">Proteomics of filamentous fungi.</a> Trends in Biotechnology. 25, 395-400 (2007).</li><li>Milles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+proteomic+approach+to+monitor+protein+synthesis+in+mycotoxin+producing+moulds.">Development of a proteomic approach to monitor protein synthesis in mycotoxin producing moulds.</a> Mycotoxin Res. 23, 161-165 (2007).</li><li>Morrison, N., Field, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concept+of+sample+in+OMICS+technology.">Concept of sample in OMICS technology.</a> OMICS. 10, 127-137 (2006).</li><li>O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+evolutionary+origins+of+the+fungus+causing+Panama+disease+of+banana:+Concordant+evidence+from+nuclear+and+mitochondrial+gene+genealogies.">Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies.</a> PNAS. 95, 2044-2049 (1998).</li><li>Paper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomics+of+extracellular+proteins+in+vitro+and+in+planta+from+the+pathogenic+fungus+Fusarium+graminearum.">Comparative proteomics of extracellular proteins in vitro and in planta from the pathogenic fungus Fusarium graminearum.</a> Proteomics. 7, 3171-3183 (2007).</li><li>Pasquali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+in+science.+Protocol+videos:+the+implications+for+research+and+society.">Video in science. Protocol videos: the implications for research and society.</a> EMBO Rep. 8, 712-716 (2007).</li><li>Taylor, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimum+information+about+a+proteomics+experiment+(MIAPE).">The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE).</a> Nat Biotechnol. 25, 887-893 (2007).</li><li>Taylor, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analyses+of+Fusarium+graminearum+grown+under+mycotoxin-inducing+conditions.">Proteomic analyses of Fusarium graminearum grown under mycotoxin-inducing conditions.</a> Proteomics. 8, 2256-2265 (2008).</li></ol>

L&#39;intérêt récent pour les approches protéomiques dans le domaine de la biologie des champignons a conduit à une augmentation du nombre de publications utilisant cette technique (tel que revu à Kim et al., 2007). Méthodes pour l&#39;extraction des protéines reposent sur une combinaison des méthodes d&#39;extraction, ils sont souvent à peine décrits dans les sections méthodologiques et nécessitent une expertise dans le traitement des méthodes de dépannage potentiel. Comme pour les autres «omiques» les approches, l&#39;établissement de normes pour le traitement des échantillons et des données est essentielle afin de générer des renseignements scientifiques fiables. Par ailleurs des échantillons et des procédures de manipulation doivent être convenablement décrite afin de permettre l&#39;interprétation des résultats partagés entre les différents «omiques» expériences. Ce serait essentielle pour exploiter pleinement potentialité de la Croix-de data mining en génomique, protéomique, métabolomique, ... (Morrison et al., 2006). Minimum d&#39;informations sur une expérience de protéomique a été rédigé et groupes de travail ont été établis afin d&#39;aborder tous les aspects d&#39;une expérience (électrophorèse sur gel, la spectrométrie de masse, les interactions moléculaires, modifications des protéines, de l&#39;informatique de la protéomique, de traitement des échantillons). Pour l&#39;instant aucune information définis sont disponibles sur les procédures de traitement des échantillons. Compte tenu de l&#39;importance des procédures d&#39;extraction de protéines dans la détermination de la qualité finale des études de protéomique, afin de mettre en œuvre des procédures qui peuvent accroître la normalisation dans le cadre de directives MIAPE (Taylor et al., 2007), nous avons proposé l&#39;utilisation d&#39;un protocole vidéo détaillant l&#39;échantillon de traitement. Video description d&#39;expériences peut contribuer sensiblement à augmenter le nombre d&#39;informations sur le traitement des échantillons qui peuvent conduire à une meilleure reproductibilité des «omiques» des expériences (Pasquali, 2007). En effet, la reproductibilité entre les laboratoires est une exigence fondamentale pour garantir la validité des résultats en protéomique (http://www.fixingproteomics.org). La reproductibilité inter-laboratoire est influencé par deux facteurs: des instrumentations différentes et les différents opérateurs manipulant des échantillons. Dans le protocole décrit, nous proposons d&#39;effectuer biologiques reproduit impliquant plusieurs opérateurs (figure 2 et vidéo) pour augmenter la fiabilité des données (c.-à la variation des résultats techniques est prise en compte). La procédure décrite pour l&#39;extraction des protéines est basé sur la SDD et le chauffage. Cela a été montré précédemment pour garantir une bonne pureté et la quantité de protéines (Pont, 1996). SDS couplée à bouillante en dissout les parois des cellules, des protéines hydrophobes et empêche la formation d&#39;oligomères que les précipitations abort des protéines. D&#39;ébullition permet également l&#39;inactivation de protéases. Le même effet est produit aussi par l&#39;EDTA, PMSF et complète inhibiteur de la protéase mini. TNT supprime des ponts disulfure dans et entre les protéines facilitant la solubilisation des protéines. Afin de supprimer les FDS avant d&#39;IEF, les protéines sont précipitées par l&#39;acétone / TCA / TNT. Par ailleurs, l&#39;acétone / TCA / TNT précipitations permet d&#39;enlever certains contaminants comme les lipides, les acides nucléiques, de sels et / ou composés phénoliques lorsque ces composés sont présents. Comme SDS, ces molécules empêchent une bonne migration lors de l&#39;IEF. Suite à cette précipitation, il est nécessaire de laver les protéines précipitées par l&#39;acétone / TNT, afin d&#39;éliminer le TCA que cela peut interférer avec l&#39;IEF. Une préparation de l&#39;échantillon bonne est la clé de bons résultats. Pour cela, il est également essentiel d&#39;éviter la contamination des protéines à partir de l&#39;environnement de travail avec des gants sans poudre et le respect de bonnes pratiques de laboratoire. D&#39;un point de vue technique, dans le protocole décrit les étapes les plus critiques pour obtenir des quantités suffisantes et la pureté des protéines sont deux phases. Tout d&#39;abord, la phase de broyage où la destruction complète de la cellule est fondamentale pour la libération de protéines et, deuxièmement, la purification de protéines totales, une phase qui englobe la suppression de la majorité des lipides, ADN et d&#39;autres contaminants qui peuvent interférer avec la migration des protéines.

Médias et des solutions PDA: 39 pommes de terre g Dextrose Agar (Difco), 1 L d&#39;eau distillée. Agar V8: V8 de 200 ml (Campbell, USA), 2g CaCO3 (Sigma), Agar 16g (DIFCO), 800 ml d&#39;eau distillée Média induisant toxines: 1g de K 2 HPO 4, 0,5 g de KCl, 0,5 g MgSO 4 7H 2 O, 10 mg FeEDTA, 2g d&#39;acide glutamique L, saccharose 10g dans 1L d&#39;eau distillée. Tampon de lyse: <table border="1"><tr><td></td><td> 100mL </td><td> La concentration finale </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCL pH 8 </td><td> 5mL </td><td> 50mM </td><td> 1M </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 2 g ou 10 ml </td><td> 2% </td><td> 20% </td></tr><tr><td> TNT </td><td> 500mL </td><td> 10mM </td><td> 2M </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 20mL </td><td> 0,1 mM </td><td> 0.5M </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 200mL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Remplissez inhibiteur de la protéase mini </td><td> 1 comprimé </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Eau </td><td> Qsp </td><td></td><td></td></tr></table> Tampon Précipitations: <table border="1"><tr><td></td><td> 100mL </td><td> La concentration finale </td></tr><tr><td> TCA </td><td> 20mL </td><td> 20% </td></tr><tr><td> TNT </td><td> 0,1 ml </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> Acétone </td><td> Qsp </td><td></td></tr></table> Tampon de lavage: <table border="1"><tr><td></td><td> 100mL </td><td> La concentration finale </td></tr><tr><td> TNT </td><td> 0,1 ml </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> Acétone </td><td> 100mL </td><td></td></tr></table> Étiquetage tampon (stocker à -18 ° C dans de petites aliquotes): <table border="1"><tr><td></td><td> 1ml </td><td> La concentration finale </td></tr><tr><td> L&#39;urée </td><td> 140 mg </td><td> 7M </td></tr><tr><td> Thiourée </td><td> 50 mg </td><td> 2M </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> 40 mg </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Tris </td><td> 30 uL </td><td> 30 mM </td></tr><tr><td> Eau </td><td> 1 ml </td><td></td></tr></table>

toxin induction and protein extraction from fusarium spp. cultures for proteomic studies

Fusarium sont des champignons filamenteux capables de produire différentes toxines. Mycotoxines de Fusarium telles que le déoxynivalénol, le nivalénol, T2, zearelenone, fusarique acide, moniliformine, etc .. avoir des effets néfastes sur la santé humaine et animale et certains sont considérés comme des facteurs de pathogénicité. Des études protéomiques ont montré pour être efficace pour déchiffrer les mécanismes de production de toxines (Taylor et al., 2008) ainsi que pour identifier les facteurs pathogènes potentiels (papier et al., 2007, Houterman et al., 2007) dans Fusarium. Il devient donc essentiel d&#39;établir des méthodes fiables permettant de comparer entre les études protéomiques afin de s&#39;appuyer sur des différences réelles dans l&#39;expression de protéines parmi les expériences, les souches et les laboratoires. La procédure qui sera décrite devrait contribuer à une augmentation du niveau de la standardisation des procédures de protéomique de deux manières. Le protocole a filmé est utilisé pour augmenter le niveau de détails qui peuvent être décrits avec précision. Par ailleurs, la disponibilité de procédures normalisées pour traiter biologiques répétitions doit garantir une plus grande robustesse des données, en tenant également compte du facteur humain au sein de la reproductibilité technique de la procédure d&#39;extraction. Le protocole décrit nécessite 16 jours pour sa réalisation: quatorze jours pour les cultures et deux jours pour l&#39;extraction des protéines (figure 1). Brièvement, les souches de Fusarium sont cultivés sur des milieux solides pour quatre jours, ils sont ensuite manuellement fragmentée et transférée dans un média induisant modifiés toxine (Jiao et al, 2008.) Pendant 10 jours. Le mycélium est recueilli par filtration à travers une couche Miracloth. Le broyage est effectué dans une chambre froide. Différents opérateurs ont effectué l&#39;extraction répétitions (n ​​= 3) afin de prendre en compte les biais dus aux variations techniques (figure 2). L&#39;extraction a été basée sur un tampon SDS / DTT comme décrit dans Taylor et al. (2008) avec de légères modifications. L&#39;extraction des protéines totales nécessaires un procédé de précipitation des protéines à l&#39;aide Acétone / TCA / TNT tampon de lavage de nuit et d&#39;acétone / TNT (figure 3a, 3b). Les protéines ont finalement été remis en solution dans le tampon de la protéine-étiquetage et quantifiés. Résultats de l&#39;extraction ont été visualisées sur un gel 1D (Figure 4, SDS-PAGE), avant de procéder à des gels 2D (IEF / SDS-PAGE). La même procédure peut être appliquée pour les analyses protéomiques sur d&#39;autres supports de culture et d&#39;autres champignons filamenteux (Miles et al., 2007).

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Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Extraction de protéines pour les analyses protéomiques espèces fongiques nécessite un niveau élevé de standardisation d&#39;être accomplie selon le minimum d&#39;informations sur une expérience de protéomique (MIAPE) des lignes directrices. Nous vous présentons une vidéo-protocole qui comprend une procédure pour minimiser les biais expérimentaux lors de l&#39;induction de toxines et d&#39;extraction de protéines à partir<em&gt; Fusarium spp.</em

L&#39;induction ou à toxines et d&#39;extraction de protéines à partir Fusarium Spp. Cultures pour les études protéomiques

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

toxin-induction-protein-extraction-from-fusarium-spp-cultures-for

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Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

16.9K vues.  Centre de Recherche Public-Gabriel Lippmann. Extraction de protéines pour les analyses protéomiques espèces fongiques nécessite un niveau élevé de standardisation d'être accomplie selon le minimum d'informations sur une expérience de protéomique (MIAPE) des lignes directrices. Nous vous présentons une vidéo-protocole qui comprend une procédure pour minimiser les biais expérimentaux lors de l'induction de toxines et d'extraction de protéines à partir Fusarium spp.

Vidéo: Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

Micro-dissection du cerveau de rat pour l&#39;ARN ou de l&#39;extraction de protéines à partir région spécifique du cerveau

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

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Biologie

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Séparation électrophorétique de protéines

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Interview: Protein Folding and Studies of Neurodegenerative Diseases

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the protein folding is at the core of the modern biology. In addition to their traditional biochemical functions, proteins can mediate transfer of biological information and therefore can be considered a genetic material. This recently discovered function of proteins has important implications for studies of human disorders. Dr. Lindquist also describes current experimental approaches to investigate the mechanism of neurodegenerative diseases based on genetic studies in model organisms.

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the protein folding is at the core of the modern biology. In addition to their traditional biochemical functions, proteins can mediate transfer of biological information and therefore can be considered a genetic material. This recently discovered function of proteins has important implications for studies of human disorders. Dr. Lindquist also describes current experimental approaches to investigate the mechanism of neurodegenerative diseases based on genetic studies in model organisms.

Interview: repliement des protéines et des études de maladies neurodégénératives

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

Préparation des cultures de cerveau de rat d&#39;agrégation pour Neuron et études sur le développement Glia

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

Microfluidique numérique pour le traitement automatisé protéomiques

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces fruiting bodies, called perithecia, on carrot agar. Perithecia contain numerous tissue types, produced at specific stages of perithecium development. These include (in order of appearance) formation of the perithecium initials (which give rise to the ascogenous hyphae), the outer wall, paraphyses (sterile mycelia which occupy the center of the perithecium until the asci develop), the asci, and the ascospores within the asci14. The development of each of these tissues is separated by approximately 24 hours and has been the basis of transcriptomic studies during sexual development12,8. Refer to Hallen et al. (2007) for a more thorough description of development, including photographs of each stage. Here, we present the methods for generating and harvesting synchronously developing lawns of perithecia for temporal studies of gene regulation, development, and physiological processes. Although these methods are written specifically to be used with F. graminearum, the techniques can be used for a variety of other fungi, provided that fruiting can be induced in culture and there is some synchrony to development. We have recently adapted this protocol to study the sexual development of F. verticillioides. Although individual perithecia must be hand picked in this species, because a lawn of developing perithecia could not be induced, the process worked well for studying development (Sikhakolli and Trail, unpublished).
The most important function of fungal fruiting bodies is the dispersal of spores. In many of the species of Ascomycota (ascus producing fungi), spores are shot from the ascus, due to the generation of turgor pressure within the ascus, driving ejection of spores (and epiplasmic fluid) through the pore in the ascus tip2,7. Our studies of forcible ascospore discharge have resulted in development of a "spore discharge assay", which we use to screen for mutations in the process. Here we present the details of this assay.
F. graminearum is homothallic, and thus can form fruiting bodies in the absence of a compatible partner. The advantage of homothallism is that crossing is not necessary to generate offspring homozygous for a particular trait, a facet that has facilitated the study of sexual development in this species14,7. However, heterothallic strains have been generated that can be used for crossing5,9. It is also possible to cross homothallic strains to obtain mutants for several genes in one strain1. This is done by coinoculating one Petri dish with 2 strains. Along the meeting point, the majority of perithecia will be recombinant (provided a mutation in one of the parent strains does not inhibit outcrossing). As perithecia age, they exude ascospores en masse instead of forcibly discharging them. The resulting spore exudate (called a cirrhus) sits at the tip of the perithecium and can easily be removed for recovery of individual spores. Here we present a protocol to facilitate the identification of recombinant perithecia and the recovery of recombinant progeny.

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Sexual crosses and isolation of recombinant progeny are important research tools for the filamentous fungus, Fusarium graminearum, The techniques necessary successfully carry out these processes are presented.

Développement sexuel et la libération des ascospores dans Fusarium graminearum</em

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Marquage métabolique et la membrane de fractionnement pour comparative Analyse protéomique de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Cultures Suspension cellulaires

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

Protéomique Préparation de l&#39;échantillon de formol et inclus en paraffine fixe tissus

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional characterization of venom proteins has important biomedical applications, including the identification of drug leads or probes for cellular receptors. Spiders are the most species rich clade of venomous organisms, but the venoms of only a few species are well-understood, in part due to the difficulty associated with collecting minute quantities of venom from small animals. This paper presents a protocol for the collection of venom from spiders using electrical stimulation, demonstrating the procedure on the Western black widow (Latrodectus hesperus). The collected venom is useful for varied downstream analyses including direct protein identification via mass spectrometry, functional assays, and stimulation of venom gene expression for transcriptomic studies. This technique has the advantage over protocols that isolate venom from whole gland homogenates, which do not separate genuine venom components from cellular proteins that are not secreted as part of the venom. Representative results demonstrate the detection of known venom peptides from the collected sample using mass spectrometry. The venom collection procedure is followed by a protocol for dissecting spider venom glands, with results demonstrating that this leads to the characterization of venom-expressed proteins and peptides at the sequence level.

This article provides a protocol for the extraction of venom from spiders using electrical stimulation in order to 1) conduct proteomic characterization, 2) stimulate venom gland gene expression, and 3) perform functional studies of venoms. This is followed by a description of venom gland microdissections for gene expression studies.

Extraction de Venom et Venom Gland Microdissections des araignées pour protéomique et transcriptomique Analyses

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Protein livraison directe aux cellules de mammifères en utilisant la cellule perméable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Domaines doigt de zinc

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...