وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل وزارة إلينوي للصحة العامة والمؤسسة الوطنية للعلوم (DBI - 0852416).

1. وظيفة الجهاز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجهاز يحتوي على إدراج ميتة 6 الركائز التي تعشش في لوحة 6 - جيدا القياسية. يتدفق الغاز إلى عمود ، عبر شبكة ميكروفلويديك عند قاعدة العمود ، وتدفقات التراجع عن الجهاز. في قاعدة العمود تشكيل الجدار أسفل متناهية هو 100 ميكرون سميكة غشاء PDMS الغاز نفاذية الأكسجين الذي يسمح نشرها بين متناهية الغاز ووسائل الإعلام الثقافة. وبالتالي ، فإن الجهاز يعمل عن طريق إنشاء الانحدار الذي يدفع التركيز على تركيز الأكسجين وسائل الإعلام من أجل التوصل إلى القيمة المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجهاز يوفر عددا من المزايا على الحجرة نقص الأوكسجين وغيرها من أنظمة تهوية الخلية : 1) يقلل المسار نشر أوكسجين السماح التحكم أسرع الزمانية ، 2) من شأنه أن يعزز السيطرة المكانية على الأوكسجين ، كما يعتمد على تصميم عمود متناهية ، 3) تمتلك أصغر البصمة المختبر والتعليم العالي لزيادة الكفاءة الإنتاجية التجريبية ، و 4) تتكيف مع الأدوات المشتركة ثقافة خلية (على سبيل المثال لوحة multiwell) دون الحاجة إلى المعرفة المتخصصة والمعدات. </li></ol> 2. جهاز تلفيق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أول مجموعة متماثلة هو الركيزة مع مصبوب في قالب PDMS Delran تشكيله من قبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل الغاز ملفقة متناهية في أسفل كل عمود باستخدام معيار SU - 8 ضوئيه وPDMS صب متماثلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غير ملفقة الغاز نفاذية الغشاء عن طريق الدوران محددة من PDMS على رقاقة السيليكون لتحقيق سمك المطلوب. في هذا المثال نستخدم غشاء 100 ميكرون سميكة التي كانت ملفقة من خلال الدوران 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثانية ثم 900 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مستعبدين جميع المكونات معا بعد العلاج البلازما الأوكسجين مع جهاز محمول البلازما (النموذجي BD - 20 ، تكنيك الكهربائية والمنتجات). </li></ol> 3. الجهاز الإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف إدراج الجهاز في لوحة ، مع التأكد من تجنب الفقاعات. الصيد الجهاز أثناء الإدراج يساعد على طرد فقاعات من جانب واحد. للتجارب خلية مقرها الفعلي ، لا بد من القيام بهذه الخطوة داخل غطاء تدفق الصفحي العقيمة. وتقلص إلى حد كبير من فرص تلوث مرة يتم إدراج الجهاز ، لذلك يمكن أن يتم التجميع عبر إلى حاضنة في بيئة غير معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل أنابيب من خزان الغاز المصدر إلى منافذ مدخل ومخرج الجهاز. لخلية مقرها التجارب ، ينبغي أن يكون حاضنة للثقافة حفرة لتأشيرة دخول ، وينبغي أن أنابيب توصيل الأنابيب بعد تحمل الجهاز ووضعه في الحاضنة. نتوخى الحذر لتجنب الضغط الزائد على الجهاز ، الذي يمكن أن تشوه PDMS يكفي لسحق الخلايا الكامنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من إغلاق منظم التدفق الدقة قبل فتح المنظم الأعلى للدبابات لتجنب فيضان الجهاز. بدء تدفق الغاز. بلطف تدفق الدقة فتح المنظم لمعدل التدفق المطلوب (50-100 مل / دقيقة). يراقب عن كثب على مدى قيمة ساعة المقبلة ، وإجراء التعديلات حسب الحاجة ، حيث أن انخفاض الضغط في حين سيتم تغيير النظام equilibrates ، تغيير معدل التدفق. لتجنب تشكيل فقاعات في وسائل الإعلام ، والحد من معدل التدفق الى ما بين 10-20 دقيقة / مل بعد أولية مدتها 15 دقيقة مع موازنة ارتفاع معدل التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة تجريبية المطلوب ، ووقف تدفق الغاز ، وإزالة لوحة ، وخلايا العملية وفقا لذلك (مثل ليز ، وصمة عار ، والعد ، الخ.) </li></ol> 4. الجهاز التحقق من صحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد ومكان وجود مواقع على الأوكسجين الفلورسنت (ماكر) شريحة استشعار (اعتمادا على شروط المصادقة) التي سيتم استخدامها لقياس الأوكسجين. الشريحة تحتوي على صبغة الفلورسنت الروثينيوم طلاء التي تطفئ بواسطة الأوكسجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعرض الشريحة مباشرة إلى 10 ، 0 ، والأكسجين 21 ٪ من خزان الغاز والتقاط الصور بعد 5 دقائق للموازنة سليمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير صورة كثافة يعني لكل موقف وتركيز الأوكسجين مؤامرة كما تعتمد على كثافة الفلورسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء منحنى المعايرة منحنيات خطية من المناسب أن خط 00-10 ٪ ، وسطر 10-21 ٪. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدم التجانس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء مراكز متعددة تغطي عرض القناة عند فاصل زمني محدد (على سبيل المثال كل 1 مم). علما أنه قد يكون هناك تداخل الصور اعتمادا على التباعد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز الأوكسجين في السطح بشكل جيد من خلال الجهاز </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موازنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار ثلاث نقاط على الشريحة التي ماكر لقياس تركيز الأوكسجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد التقاط الصورة الأولى في مستويات الأكسجين المحيطة ، وفتح منظم التدفق الدقيق لبدء تدفق الغاز في الجهاز. التقاط الصور على فترات مناسبة لتقييم مدى ومدة الأوكسجين concentrموازنة العنصر (مثلا كل 10 ثانية لمدة 30 دقيقة). </li></ol></li></ol> 5. تطبيقات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التئام الجروح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقبل يوم من التجربة ، ونقع في إدراج PDMS معقمة خالية من مصل المتوسطة للحد من الغاز تمنع تشكيل فقاعة في البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا إلى 100 ٪ في لوحة confluency 6 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء خدوش على التوالي في monolayers مع طرف P200 ماصة لمحاكاة الجروح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وسائل الإعلام الخلية ، وشطف مع وسائل الإعلام 5 مل ، ونضح مرة أخرى. من المهم أن لا تخل أحادي الطبقة من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الملء مع 4 آبار متوسطة خالية مل مصل للحد من انتشار الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان إدراج في الآبار وتوصيل كل بئر إلى تركيز الأوكسجين المقابلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 مكان جيد لوحة مع إدراج ساخنة على خشبة المسرح في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الصور الفاصل الزمني للخلايا عند الفاصل الزمني المطلوب والمدة الإجمالية. ويمكن استخدام T_Scratch MATLAB ، وهي خوارزمية قياس الجرح ، لتحليل مساحة الدامي. </li></ol></li></ol> 6. ممثل النتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجهاز التحقق من صحة يسلك جهاز ادخال تحسينات كبيرة على مدى نقص الأوكسجين في الغرفة ميتة من حيث الوقت ومدى موازنة الأكسجين ، الأمر الذي يتطلب أقل من 2 دقيقة لتحقيق الاستقرار للأوكسجين 0.5 ٪. كان غشاء الجهاز جيدا حجم الفجوة السفلية العامل الحاسم في تحديد كفاءة موازنة ، مع أحجام أكبر من الفجوة التي تتطلب المزيد من الوقت للوصول إلى حالة استقرار قيم تركيز الأوكسجين. يسمح الجهاز أيضا قدرا كبيرا من السيطرة على الأوكسجين المكانية في بئر واحدة ، مما يسمح بتشكيل ظروف متعددة ، وتوليد الأوكسجين حتى التشكيل دوري عبر سطح البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التئام الجروح تعرضت monolayers الخلية إلى 10 ٪ أو 21 ٪ أكسجين ومساحة الجرح تم تحليل أكثر من مرة. مغلق الخدوش تتعرض للأوكسجين 21 ٪ أبطأ و 10 ٪ أسرع. الشكل 1 يبين صورا لنقطة الصفر على مدار 17 ساعة. الرسوم البيانية في الشكل 5 تظهر في المئة من مساحة الجرح مفتوحا أمام كل من تركيز الأوكسجين لمدة التجربة. </li></ol> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig1tmb.jpg" alt="الشكل 1" border="0" /></a> الشكل 1. التخطيطي والمخططات التي توضح ميزات الجهاز. غير ملفقة الجهاز إدراج الأكسجين ضوئيه التقليدية (شبكة ميكروفلويديك) ، صب متماثلة (شبكة ميكروفلويديك وسقالة إدراج) ، وتعريف الغزل PDMS (الغاز نفاذية الغشاء). أ) جهاز الاوكسجين المتداخلة في لوحة 6 - جيدا. ب) أمثلة على 24 و 96 - جيدا صفائف العمود. ج) التخطيطي مستعرضة عمود. الأوكسجين يتدفق الجهاز من خلال مدخل ويسافر عبر شبكة ميكروفلويديك في الجزء السفلي من العمود. يمكن الأوكسجين منتشر بحرية عبر الغشاء PDMS الغاز نفاذية في الجزء السفلي من العمود ، ويذوب في وسائل الإعلام الثقافة. D) صورة المجهر إظهار ملامح مختلفة من عمود واحد من قناة أعلاه ، مع زجاج المشاركات المستعبدين للدراسات موازنة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig2tmb.jpg" alt="الشكل 2" border="0" /></a> الشكل 2. التحقق من صحة الجهاز مع أجهزة استشعار الأوكسجين. تميزت توتر الأوكسجين داخل كل بئر باستخدام الأكسجين الروثينيوم مستو الاستشعار. يتضمن كل الخلائط الأكسجين النيتروجين متوازنة و 5 ٪ CO 2 للالمؤقت وسائل الإعلام. أ) رسم يوضح تأثير ارتفاع آخر ، وبالتالي الأكسجين بعد نشرها بين الغشاء والخلايا ، في الوقت موازنة والفعالية. المرتفعات التي أنشئت قطع الزجاج المشاركات متجهة إلى أسفل الجهاز. كل ثلاثة أضعاف موازنة العائد أحجام آخر تحسنت كثيرا خلال غرفة ميتة. علما بأن الوقت على نطاق السجل. ب) رسم تصور موازنة الأكسجين زمن الاستجابة السريعة للجهاز الفجوة مم 0.2. كما اتخذت C) موقف متعدد linescans عبر البئر تحت متناهية لضمان تجانس تركيز الأوكسجين الذي قدمه الجهاز. رسم بياني يصور قياس تركيز الأوكسجين بعد غرس 0 ٪ ، 10 ٪ ، والأكسجين 21 ٪ لمدة 10 دقيقة. D) يحتفظ الجهاز بفعالية الأكسجين 10 ٪ على مدى 5 أيام. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig3tmb.jpg" alt="الشكل 3" border="0" /></a> الشكل 3. التجريب مع تصاميم أكثر تعقيدا الأكسجين متناهية. أ) الإعداد المزدوجة حالة مستقرة متناهية غلة 0 ٪ و 21 ٪ أكثر من ملف الأكسجين 14 يوما. ب) نمط interdigitated والمتعرجة من 500 ميكرومتر microchannels عرض تمتد عبر الالنتائج دعامة ه في التشكيل الأكسجين بصفة دورية. علما بأن البيانات يصور ممثل واحد فقط المحاكمة كما كان من الصعب محاذاة متناهية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig5tmb.jpg" alt="الشكل 4" border="0" /></a> الشكل 4. الصور Timelapse اغلاق الجرح 0 ، 7 ، و 17 ساعة بعد الصفر الأولي. تم تسليم الخلايا الأوكسجين 21 ٪ طوال مدة التجربة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig6.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig6tmb.jpg" alt="الشكل 5" border="0" /></a> الشكل 5. تأثير على معدل تركيز الأوكسجين في التئام الجروح مقايسة الصفر.

وملفقة من قبل جهاز ضوئيه SU - 8 القياسية ، صب المتماثلة ، وتعريف الغزل ومصنوع بالكامل من polydimethylsiloxane. يتم إدخال الغاز في الجهاز لإنشاء معامل تركيز عمود متناهية بين وسائل الإعلام والثقافة ، ونظام القيادة نحو تركيز الأوكسجين التوازن المطلوب. وقد تبين أن الجهاز لتعدل على نحو فعال الأوكسجين الزمانية والمكانية داخل البئر ، وكذلك تعدل السلوك الخلوية بشكل مناسب. يتم تعريف الزخرفة المكاني للالأوكسجين من قبل متناهية على قاعدة العمود ، لذلك يمكن أن تنفذ مجموعة متنوعة من التصاميم في صياغة والضوئية الرئيسية. بالإضافة إلى ذلك ، من المتوقع ضخ الغاز المطلوب في مرحلة الغاز من البئر لتحسين وقت موازنة ومدى نقص الأكسجة. ويمكن تكييف شبكة ميكروفلويديك الاختلاط إلى الجهاز لتوفير وسيلة لإنتاج الغاز مخاليط الرواية من الأسهم فقط من الدبابات الغاز قليلة. أخيرا ، فإن آلية لتبادل وسائل الاعلام للقضاء على الحاجة لإزالة الجهاز من لوحة multiwell ، التي قد تستجيب الخلايا. الجهاز له تطبيقات في أي السابقين في المختبر أو التجربة الحية التي تتطلب السيطرة على تركيز الأوكسجين. والأكسجين هو متغير مهم الفسيولوجية التي تؤثر على الغالبية العظمى من مسارات الإشارات ، من محدودية مجالات البحوث التي من شأنها أن تستفيد من الابتكار لدى الباحث. بعض المجالات التي يمكن أن تستفيد من السيطرة على الزماني تعزيز تركيز الأوكسجين الانبثاث تشمل السرطان وتوقف التنفس أثناء النوم ، ونقص التروية القلبية الاصابة ضخه ، ضمن أشياء أخرى كثيرة. على سبيل المثال ، ارتبط نقص الأكسجة المتقطعة مع أكثر أنواع السرطان الغازية ، upregulating عددا من الجينات المرتبطة metastastis النسبية لنقص الأكسجة المستمر وnormoxia. السيطرة المكانية المهم أيضا ، كما هي التدرجات الأكسجين حاسما في التنمية ، وتحديد مناطق الكبد وسمية الدواء ، والخلايا الجذعية المتخصصة. سيقوم الجهاز المعروضة في هذه المقالة يستفيد عدد من المجالات البحثية من خلال توفير نظام البصمة مع أصغر المختبر ، والاحتياجات التشغيلية بسيطة نسبيا ، والسيطرة على أكبر بكثير التعرض الاوكسجين الى الخلايا.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PDMS-Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Planar FOXY sensor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ocean Optics</td>
<td>FOXY-SGS-M</td>
<td>Coated microscope slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Gas regulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega</td>
<td>FL-1472-G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gas</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Airgas</td>
<td>Custom mixes</td>
<td>All have 5% CO2</td>
</tr>
<tr>
<td>SU-8 2150</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microchem</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SAFC Biosciences</td>
<td>M3803</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>30-2020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7513</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fabrication and operation of an oxygen insert for adherent cellular cultures 

الأكسجين هو المغير الرئيسية للمسارات الخلوية كثيرة ، ولكن الأجهزة الحالية التي تسمح<em&gt; في المختبر</em&gt; تعديل الأكسجين تفشل في تلبية الاحتياجات من البحوث الطبية الحيوية. غرفة ميتة يوفر نظام بسيط للسيطرة على الأوكسجين في أوعية الثقافة القياسية ، لكنه يفتقر تحكم دقيق الزمانية والمكانية على مدى تركيز الأوكسجين على سطح الخلية ، ومنع تطبيقه في دراسة مجموعة من الظواهر الفسيولوجية. وقد تحسنت نظم أخرى على غرفة ميتة ، ولكنها تتطلب المعرفة المتخصصة والمعدات اللازمة لتشغيلها ، مما يجعلها مخيفة للباحث في المتوسط. وقد تم وضع لوحات ادخال microfabricated multiwell على نحو أكثر فعالية التحكم في تركيز الأوكسجين الزماني والمكاني للظواهر وجدت أفضل نموذج الفسيولوجية<em&gt; في الجسم الحي</em&gt;. منصة تتألف من ادخال polydimethylsiloxane أن أعشاش إلى لوحة multiwell القياسية ويعمل كشبكة الغاز ميكروفلويديك السلبي مع غشاء الغاز نفاذية الرامية لتعديل تسليم الاوكسجين الى خلايا ملتصقة. الجهاز سهل الاستخدام ومرتبط اسطوانات الغاز التي توفر لضغوط لتقديم تركيز الأوكسجين المطلوب في النظام الأساسي. تلفيق ينطوي على مزيج من ضوئيه SU - 8 القياسية ، صب المتماثلة ، وتعريف PDMS الغزل على رقاقة السيليكون. مستعبدين مكونات الجهاز بعد المعالجة السطحية باستخدام نظام البلازما باليد. ويتم إنجاز التحقق من صحة مع جهاز استشعار الأوكسجين الفلورسنت مستو. الوقت هو موازنة بناء على أمر من دقيقة ، ويمكن التوصل إلى تشكيلة واسعة من التشكيلات الأكسجين على أساس تصميم الجهاز ، مثل ملف دوري يتحقق في هذه الدراسة ، وحتى التدرجات الاوكسجين الى تقليد تلك التي وجدت<em&gt; في الجسم الحي</em&gt;. ويمكن للجهاز تعقيم للثقافة الخلية باستخدام الأساليب الشائعة دون فقدان وظيفة. الجهاز لدراسة انطباق<em&gt; في المختبر</emسيظهر&gt; ردا التئام الجروح.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures at JoVE.com

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

تلفيق والتحقق من منصة الإضافية التي توفر تعزيز الرقابة على الأوكسجين المكاني والزماني في صفيحة 6 - جيدا. الجهاز قابل للتكيف لعدد من النظم والثقافة ، ويمكن استخدامها للتحقق من آثار الأوكسجين على التئام الجروح.

تصنيع وتشغيل إدخال الأوكسجين للثقافات الخلوية منتسب

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

fabrication-operation-an-oxygen-insert-for-adherent-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

9.6K Views.  University of Illinois. تلفيق والتحقق من منصة الإضافية التي توفر تعزيز الرقابة على الأوكسجين المكاني والزماني في صفيحة 6 - جيدا. الجهاز قابل للتكيف لعدد من النظم والثقافة ، ويمكن استخدامها للتحقق من آثار الأوكسجين على التئام الجروح.

Video: Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

في تقطير التحت خلوية الموقع من خلايا الثدييات وغير ملتصقة منتسب -

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

مولد الرمع الفحص : خلايا منتسب

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

أداة تحليلية يحدد مقدار التغييرات الخلوية الصرف من التقاط صور ثلاثية الأبعاد الإسفار

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

مقايسة لتقييم سلوك يزدرع الخلوية من اللحمة المتوسطة القحف

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

كشف، تصور وQuantitating الجيل من أنواع الاكسجين التفاعلية في النظام النموذجي الاميبا

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

تطوير نظام إدراج المشارك ثقافة نوعين الخلوية في غياب خلية خلية الاتصال

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

نموذج في المختبر لدراسة التحول الخلوي من هربس كابوزي ساركوما

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

الفيديو خالية من عدسة مجهرية للدينامية والتحليل الكمي للثقافة الخلية ملتصقة

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen infection or challenge with pathogen-associated chemicals (pathogen-associated molecular patterns [PAMPs]), an array of immune responses, including a ROS burst, are quickly induced in plants, which is called PAMP-triggered immunity (PTI). A ROS burst is a hallmark PTI response, which is catalyzed by a group of plasma membrane-localized NADPH oxidases-the RBOH family proteins. The vast majority of ROS comprise hydrogen peroxide (H2O2), which can be easily and steadily detected by a luminol-based chemiluminescence method. Chemiluminescence is a photon-producing reaction in which luminol, or its derivative (such as L-012), undergoes a redox reaction with ROS under the action of a catalyst. This paper describes an optimized L-012-based chemiluminescence method to detect apoplast ROS production in real-time upon PAMP elicitation in rice tissues. The method is easy, steady, standardized, and highly reproducible under firmly controlled conditions.

Here, we describe a method for the real-time detection of apoplastic reactive oxygen species (ROS) production in rice tissues in pathogen-associated molecular pattern-triggered immune response. This method is simple, standardized, and generates highly reproducible results under controlled conditions.

الكشف في الوقت الحقيقي عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الاستجابة المناعية في الأرز باستخدام مقايسة التلألؤ الكيميائي

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of conditioned media remains time-consuming and far from physiological and pathological conditions. Although a few models of co-culture are commercially available, they remain restricted to specific assays and are mostly for two types of cells. 
Here, 3D-printed inserts are used that are compatible with numerous functional assays. The insert allows the separation of one well of a 6-well plate into four compartments. A wide range of combinations can be set. Moreover, windows are designed in each wall of the compartments so that potential intercellular communication between every compartment is possible in the culture medium in a volume-dependent manner. For example, paracrine intercellular communication can be studied between four cell types in monolayer, in 3D (spheroids), or by combining both. In addition, a mix of different cell types can be seeded in the same compartment in 2D or 3D (organoids) format. The absence of a bottom in the 3D-printed inserts allows the usual culture conditions on the plate, possible coating on the plate containing the insert, and direct visualization by optical microscopy. The multiple compartments provide the possibility to collect different cell types independently or to use, in each compartment, different reagents for RNA or protein extraction. In this study, a detailed methodology is provided to use the new 3D-printed insert as a co-culture system. To demonstrate several capacities of this flexible and simple model, previously published functional assays of cell communication were performed in the new 3D-printed inserts and were demonstrated to be reproducible. The 3D-printed inserts and the conventional cell culture using conditioned media led to similar results. In conclusion, the 3D-printed insert is a simple device that can be adapted to numerous models of co-cultures with adherent cell types.

In this paper, a newly designed 3D-printed insert is presented as a model of co-culture and validated through the study of the paracrine intercellular communication between endothelial cells and keratinocytes.

ملحق مبتكر مطبوع ثلاثي الأبعاد مصمم لتمكين ثقافات الخلايا 2D و 3D المباشرة

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...