نود أن نشكر أعضاء مختبر المقدسة. وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات الصمم والاتصالات (R01 DC005964 إلى ذلك) وجبهة الخلاص الوطني IGERT 0548890 (HAA). وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للقوانين الولايات المتحدة رعاية الحيوان والمعاهد الوطنية للصحة والمبادئ التوجيهية التي وافق عليها واشنطن رعاية الحيوان بجامعة ولجنة الاستخدام.

الجزء 1. الأجهزة الكهربائية تسجيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحن نستخدم مجموعة multielectrode مستو (ALA الآلات العلمية) مع 10 ميكرومتر شقة أقطاب نيتريد التيتانيوم معزولة مع نيتريد السيليكون. مرتبة 60 في حقلين كهربائي يتألف من شبكة 5x6 مع مركز إلى مركز تباعد من 30 ميكرون. (تكوينات أخرى من الممكن أيضا ؛ كهربائية مع سطح تسجيل 10 ميكرومتر في القطر هي أفضل من أكبر الأقطاب من حيث عزل نشاط الخلايا العصبية واحدة.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتتضخم الإشارات الكهربائية (التضخيم 1000x) باستخدام مكبر للصوت الشرق الأوسط وأفريقيا 1060 (ALA الأدوات العلمية). يتم الحصول على إشارات في 10 كيلوهرتز باستخدام بطاقة الحصول على البيانات (الصكوك الوطنية) وبرنامج مخصص للحصول على البيانات (واحد يمكن أيضا شراء البرمجيات التجارية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يقام في الأنسجة أسفل على MEA بواسطة شبكة من النايلون (53 ميكرون) ، وهو يعلق على إدراج مخصص الذي يلائم بشكل مريح داخل أنبوب الثقافة خاتم من الشرق الأوسط وأفريقيا. </li></ol> الجزء 2. السائلة تسليم الأجهزة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النسيج يتطلب superfusion المستمر ، الذي يضمن لنا من خلال تقديم حل رينغر (115 كلوريد الصوديوم ملم ، وكلوريد البوتاسيوم 5 ملم ، 2 كلوريد الكالسيوم ملم ، 2 كلوريد المغنيسيوم مم ، 25 بيكربونات الصوديوم مم ، 10 HEPES ملم ، و 10 ملي D - (+ ) - الجلوكوز) من مضخة HPLC. يتم تقديم المحفزات التي تؤدي إلى حقن صمام HPLC والتبديل بين والتدفق من خلال حلقة. يتم تزويد كل مضخة HPLC ومضخة حقن الروبوت في المحاقن مع حل رينغر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يبقى الحل الجرس في حمام ماء ساخن (ISOTEMP 105) في 42 درجة مئوية في كافة مراحل التجربة ، وانفجر بشكل مستمر مع 95 ٪ O 2 / 5 ٪ CO 2. ويتم إعداد دورق منفصل من دون رينغر في الجلوكوز لدعم ضخ حقنة. يتم تسليم الحل الجرس على النسيج باستخدام 307 مضخة HPLC (جيلسون) بمعدل 3 مل / دقيقة. في تجربة نموذجية ساعة 5-6 ، 1 لتر من محلول كل رينغر كافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في كافة مراحل التجربة ، هو نسيج superfused باستمرار مع حل درجة مئوية رينغر 37. يتم وضع مسبار سخان مباشرة فوق الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تسليم المحفزات السائلة باستخدام معالج 215 جيلسون ذراع روبوتية. يتم تخزين المحفزات في قوارير زجاجية المطاط المغطاة ، وتحت سيطرة البرمجيات جيلسون ، الذراع الروبوتية يسلم المحفزات إلى خط نضح في حين يتم الاحتفاظ معدل التدفق المستمر والضغط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمثل حالة صمام HPLC (حلقة تعمل / لا تعمل) عن طريق الجهد الكهربائي ، والتي يتم تسجيلها من قبل الكمبيوتر اقتناء كقناة إضافية لضمان تزامن مع نشاط الخلايا العصبية. </li></ol> الجزء 3. إعداد شركة طيران الشرق الأوسط والتحفيز الأجهزة التسليم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل أداء التشريح ، وملء MEA جيدا مع جيش صرب البوسنة في dH2O ما لا يقل عن 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف MEA باستخدام الدافئة فقاعات رينغر الحل ووضع شركة طيران الشرق الأوسط على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رئيس معالج السائلة وHPLC مضخة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li></ol> الجزء 4. VNO تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل أداء التشريح ، وملء 2 60x15 ملم أطباق بتري مع الحل رينغر فقاعات ومكان على الجليد. شغل أيضا 2 Sylgard المغلفة أطباق بتري من نفس الحجم مع الحل رينغر ومكان على الجليد. البرد an 50mL إضافية الدافئة انفجر في رينغر للاستخدام أثناء تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضحى الماوس عبر الخنق CO 2 تليها خلع عنق الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شقوق الثنائية من جانب الفم ، وبالتوازي مع خط الفك السفلي ، والجزء الخلفي من الرأس. الانضمام إلى خفض 2 على طول الظهر والعنق وإزالة الجزء الظهري للرأس ، وترك الفك السفلي تعلق على الماوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غرامة باستخدام مقص ، وقطع الأنسجة وبين جانبي عظم الفك العلوي لفصل الأنسجة من العظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> # 3 باستخدام الملقط ، تقشر الأنسجة الحنك لفضح تجويف الأنف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص أو مشرط صغير ، وبين قطع على جانبي الأسنان الأمامية العلوية 2 لتحرير الميكعي كبسولة من العظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> # 3 باستخدام الملقط ، التقط كبسولة الميكعي من العظام المسطحة وضعها في طبق بتري على الجليد. يجب أن يتم تنفيذ الخطوات حتى من خلال الانغماس في اقل من 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع صحن تحت stereomicroscope ، مضاءة مع الضوء المنعكس. إزالة الكبسولة العظمي من VNO في وقت واحد باستخدام الملقط # 3. استخدم يدا واحدة لتحقيق الاستقرار في الكبسولة التي تجتاح عظمي من نهاية الذيل واليد الأخرى لقشر العظم بعيدا عن VNO ، مع الحرص على عدم الإضرار VNO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تتم إزالة العظام ، ونقل إلى VNO طبق بيتري Sylgard المغلفة. استخدام طبق المتبقية لVNO الأخرى. تبديل الإضاءة الخفيفة لإرسالها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص أو الجزئي ملقط # 5 ، فصل VNO من الاوعية الدموية عن طريق خفض طول حافة VNO. عند هذه النقطة سوفلقد ورقة منفصلة تماما عن العصبية والأوعية الدموية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع VNO مع الجانب الداخلي حتى (شجيري). # 3 باستخدام الملقط ، ومرساة VNO إلى Sylgard في زاوية من الأنسجة. قشر ظهارة عصبية من الصفيحة القاعدية باستخدام قطعة صغيرة من شفرة حلاقة تفلون المغلفة التي عقدت مع المشبك. عقد شفرة بزاوية ضحلة (&lt;30 درجة من سطح الطبق) هو أفضل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة الزجاج ، ونقل قطعة من الظهارة العصبية من الطبق إلى الشرق الأوسط وأفريقيا. موقف VNO على رأس الحقل الكهربائي مع الجانب شجيري يصل. الحل إزالة الزائدة مع رينغر ماصة. مكان صاحب شبكة نسيج في البئر للصفيف لعقد VNO في مكان ، وملء مع الحل رينغر مبردة ل. </li></ol> الجزء 5. تسجيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شركة طيران الشرق الأوسط في شركة طيران الشرق الأوسط 1060 مكبر للصوت وموقف لجنة التحقيق سخان مباشرة فوق الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموضع الصحيح لتأكيد التحقيق جهاز التدفئة ، مع تحفيز حل رينغر البوتاسيوم يحتوي على 50 ملم (الاستعاضة عن الصوديوم متساوي المولية) لمدة 2 ثانية. ضبط تحديد المواقع للحد من الكمون للاستجابة العصبية في حل البوتاسيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Superfuse النسيج بمحلول رينغر ساخنة لمدة 45 دقيقة الى 1 ساعة قبل تسجيل للسماح للأنسجة حتى يتأقلم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم حفظ الإشارات الكهربائية إلى القرص باستخدام برامج مخصصة التسجيل. </li></ol> الجزء 6. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أن يتم حاليا تحليل البيانات باستخدام التسجيلات القطب الخام. على سبيل المثال ، فإننا قياس التغيرات معدل إطلاق الخلايا المسجلة في استجابة ليغاندس معينة. مجموعات البيانات الناتجة تكون كبيرة ، ويمكن استخدامها لمعالجة مسائل مختلفة كثيرة ، مطلوب الألفة مع لغة البرمجة أو التحليل (C ، ماتلاب ، R ، بيثون ، أو ما شابه ذلك). </li></ol> الجزء 7. ممثل النتائج هذا التحضير هو عادة مستقرة بما يكفي لتسجيل من أجل 6 ساعات ، مما يعني أن كمية كبيرة من البيانات (6 ساعات من التسجيل من أقطاب 60). <img src="/files/ftp_upload/1845/1845fig1tmb.jpg" alt="الشكل 1" border="0" /> الشكل 1. تظهر لقطة من النشاط في وقت واحد عبر واحد من نصف الصفيف. نافذة الوقت يمتد 400 مللي ثانية. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1845/1845fig1.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1. <img src="/files/ftp_upload/1845/1845fig2tmb.jpg" alt="الشكل 2" border="0" /> الشكل 2 في تجربة نموذجية ، ونحن حفز مع مركبات معينة من الفائدة لمدة 10 ثانية. تتبع هذا هو مثال للاستجابة الى 100 أضعاف البول المخفف فئران. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1845/1845fig2.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الشكل 2.

<ol>
	<li>Dulac, C., Torelo, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+pheromone+signals+in+mammals:+from+genes+to+behaviour.">Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour.</a> Nat Rev Neurosci. 4, 551-562 (2003).</li><li>Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+Vomeronasal+neurons+to+natural+stimuli.">Responses of Vomeronasal neurons to natural stimuli.</a> Science. 289, 1569-1572 (2000).</li><li>Nodari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulfated+steroids+as+natural+ligands+of+mouse+pheromone-sensing+neurons.">Sulfated steroids as natural ligands of mouse pheromone-sensing neurons.</a> J Neurosci. 28, 6407-6418 (2008).</li></ol>

تسجيلات الصفيف Multielectrode تسمح لنا القدرة على رصد النشاط المتزامن لعدد كبير من الخلايا العصبية. هذا هو أداة مفيدة لبحث خصائص النظام الحسي ، وتحديدا VNO. على عكس النظام الشمية الرئيسية ، ويكشف VNO المحفزات في المرحلة السائلة. إضافة إلى ذلك ، VNO هو نسيج غير متجانس. هناك ما يقر?...

multielectrode array recordings of the vomeronasal epithelium

فهم الدارات العصبية يتطلب أساليب لتسجيل العديد من الخلايا العصبية في وقت واحد. إلى<em&gt; في المختبر</em&gt; دراسات ، واحدة التكنولوجيا المتاحة حاليا هو مستو multielectrode صفيف (MEA) التسجيل. نحن هنا توثيق استخدام هذه الاتفاقات لدراسة الجهاز الماوس الميكعي (VNO) ، الذي يلعب دورا أساسيا في الكشف عن الفيرومونات والعظة الاجتماعية عبر مجموعة متنوعة من السكان من الخلايا العصبية الحسية معربا عن المئات من أنواع المستقبلات. الجمع بين الشرق الأوسط وأفريقيا مع معالج تسجيل سائل الروبوتية لتقديم المحفزات الكيميائية ، يمكن تسجيل ردود الفعل الحسية من السكان كبيرة ومتنوعة من الخلايا العصبية. إعداد يسمح لنا بإزالة الظهارة العصبية سليمة من VNO من الماوس وحفز مع بطارية من المواد الكيميائية أو يغاندس المحتملة مع رصد النشاط الكهربائي للخلايا العصبية لعدة ساعات. لذلك ، هذه التقنية هي بمثابة وسيلة مفيدة لتقييم النشاط يجند فضلا عن استكشاف خصائص الخلايا العصبية المستقبلة. نقدم التقنيات اللازمة لإعداد الميكعي ظهارة ، وتسجيل شركة طيران الشرق الأوسط ، والتحفيز الكيميائي.

Watch this Scientific Journal Video about Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium at JoVE.com

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Multielectrode صفيف (MEA) التسجيلات توفر طريقة لدراسة النشاط الكهربائي لأعداد كبيرة من الخلايا العصبية. هنا ، فإننا نقدم تفاصيل التحضير لتسجيل شركة طيران الشرق الأوسط من ظهارة الميكعي الماوس في وقت واحد بينما تحفيز الأنسجة.

تسجيلات صفيف Multielectrode من الطلائية الميكعي

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

multielectrode-array-recordings-of-the-vomeronasal-epithelium

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.1K Views.  Washington University School of Medicine. Multielectrode صفيف (MEA) التسجيلات توفر طريقة لدراسة النشاط الكهربائي لأعداد كبيرة من الخلايا العصبية. هنا ، فإننا نقدم تفاصيل التحضير لتسجيل شركة طيران الشرق الأوسط من ظهارة الميكعي الماوس في وقت واحد بينما تحفيز الأنسجة.

Video: Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic nerve. In vivo recordings of ganglion cell spike trains in several animal models have revealed much of what is known about how the early visual system processes and encodes visual information. However, such recordings have been rare in one of the most common animal models, the rat, possibly owing to difficulty in detecting spikes fired by small diameter axons. The many retinal disease models involving rats motivate a need for characterizing the functional properties of ganglion cells without disturbing the eye, as with intraocular or in vitro recordings. Here, we demonstrate a method for recording ganglion cell spike trains from the optic chiasm of the anesthetized rat. We first show how to fabricate tungsten-in-glass electrodes that can pick up electrical activity from single ganglion cell axons in rat. The electrodes outperform all commercial ones that we have tried. We then illustrate our custom-designed stereotaxic system for in vivo visual neurophysiology experiments and our procedures for animal preparation and reliable and stable electrode placement in the optic chiasm.

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Retinal ganglion cells transmit visual information from the eye to the brain with sequences of action potentials. Here, we demonstrate how to record the action potentials of single ganglion cells in vivo from anesthetized rats.

وحدة واحدة في الجسم الحي تسجيلات من chiasm البصرية من الجرذ

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic ...

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" (or "startle") response during the adult stage is mediated by the multi-component neuronal circuit called the Giant Fiber System (GFS). The comparative large size of the neurons, their distinctive morphology and simple connectivity make the GFS an attractive model system for studying neuronal circuitry. The GFS pathway is composed of two bilaterally symmetrical Giant Fiber (GF) interneurons whose axons descend from the brain along the midline into the thoracic ganglion via the cervical connective. In the mesothoracic neuromere (T2) of the ventral ganglia the GFs form electro-chemical synapses with 1) the large medial dendrite of the ipsilateral motorneuron (TTMn) which drives the tergotrochanteral muscle (TTM), the main extensor for the mesothoracic femur/leg, and 2) the contralateral peripherally synapsing interneuron (PSI) which in turn forms chemical (cholinergic) synapses with the motorneurons (DLMns) of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), the wing depressors. The neuronal pathway(s) to the dorsovental muscles (DVMs), the wing elevators, has not yet been worked out (the DLMs and DVMs are known jointly as indirect flight muscles - they are not attached directly to the wings, but rather move the wings indirectly by distorting the nearby thoracic cuticle) (King and Wyman, 1980; Allen et al., 2006). The di-synaptic activation of the DLMs (via PSI) causes a small but important delay in the timing of the contraction of these muscles relative to the monosynaptic activation of TTM (~0.5 ms) allowing the TTMs to first extend the femur and propel the fly off the ground. The TTMs simultaneously stretch-activate the DLMs which in turn mutually stretch-activate the DVMs for the duration of the flight. The GF pathway can be activated either indirectly by applying a sensory (e.g."air-puff" or "lights-off") stimulus, or directly by a supra-threshold electrical stimulus to the brain (described here). In both cases, an action potential reaches the TTMs and DLMs solely via the GFs, PSIs, and TTM/DLM motoneurons, although the TTMns and DLMns do have other, as yet unidentified, sensory inputs. Measuring "latency response" (the time between the stimulation and muscle depolarization) and the "following to high frequency stimulation" (the number of successful responses to a certain number of high frequency stimuli) provides a way to reproducibly and quantitatively assess the functional status of the GFS components, including both central synapses (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) and the chemical (glutamatergic) neuromuscular junctions (TTMn-TTM and DLMn-DLM). It has been used to identify genes involved in central synapse formation and to assess CNS function.

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

The Giant Fiber System is a simple neuronal circuit of adult Drosophila melanogaster containing the largest neurons in the fly. We describe the protocol for monitoring synaptic transmission through this pathway by recording post synaptic potentials in dorsal longitudinal (DLM) and tergotrochanteral (TTM) muscles following direct stimulation of the Giant Fiber interneurons.

تسجيلات الكهربية من الألياف المسار عملاق د. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

تشريح العين ماوس لجبل الجامعة للصبغات الظهارة الشبكية

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

تسجيلات صفيف متعدد القطب من الانهيارات الجليدية الخلايا العصبية في الثقافات عضوي النمط

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

التصوير فرمون الاستشعار في الميكعي ماوس الحادة الأنسجة إعداد شريحة

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

الردود تصوير الخلايا العصبية في الجهاز الاستعدادات لقطات للالميكعي تعرب عن جهاز استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

فيفو السابقين الاستعدادات للالميكعي الجهاز سليمة والإكسسوار الشم لمبة

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

في التحليل المتعمق الفسيولوجية لبالسكان خلية المعرفة في الحادة الأنسجة شرائح من الميكعي الجهاز ماوس

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

التحت خلوية تسجيلات التصحيح، المشبك من المجال Somatodendritic من سودائي الدوبامين العصبية

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

تسجيلات صفيف Multielectrode من الطلائية الميكعي

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video