Authors would like to thank Peter Mombaerts for the generous gift of OR-GFP mice; Anne Lefranc and the CSGA animal facility for excellent animal care. Funding was provided by CNRS through an ATIP and ATIP Plus grants, by Conseil R&#233;gional de Bourgogne (FABER and PARI grants), by Universit&#233; de Bourgogne (BQR program).

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من جامعة دي بورغون وتمت الموافقة من قبل لجنة الأخلاق جامعة دي بورغون. 1. الحيوانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الفئران المعدلة وراثيا OR-IRES-tauGFP المتاحة في مختبر جاكسون. وقد وضعت هذه الفئران في المختبر الدكتور بيتر Mombaerts &quot;من أجل تحليل استهداف أكسون وتطوير النظام الشمي 19. على سبيل المثال، خط MOR23-IRES-tauGFP، والأوراق المالية رقم 006643، يحمل اسم سلالة B6 الرسمي؛ 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ. وبالمثل، فإن خط SR1-IRES-tauGFP، والأوراق المالية رقم 6717 يحمل اسم B6 الرسمي؛ 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفيما يتعلق عمر الحيوانات: من أجل نتائج أفضل من البروتوكول، واستخدام الحيوانات بين 2 و 4 أسابيع من العمر. في هذه الفئة العمرية، وتشريح هو أسهل (العظام أكثر ليونة، أكثر حزما الظهارة الشمية) والمقابض شجيري هي ثنائيةgger مقارنة الحيوانات الأكبر سنا. </li></ol> 2. إعداد أقطاب وحلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لماصات محفزة: شراء prepulled تحفيز ماصات. خلاف ذلك، وإعداد عليها يدويا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام اللهب، ثني ستة الماصات الزجاج 1 مم في حوالي 1 سم من الحافة. إدراج هذه الماصات ستة زائد على التوالي ال 7 في 1.5 سم الحرارة يتقلص أنابيب تعزيز من قبل العيينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحرارة يتقلص أنابيب للحفاظ على برميل المرفقة معا. إرفاق إضافي أنابيب الحرارة يتقلص إلى أقصى الطرف الآخر من برميل. سحب هذا ماصة تحفيز مع مجتذب متعددة برميل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بعض الغراء السائل الأبيض حول العيينة لتعزيز نصائح محني. اسمحوا الجافة O / N. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 أو 2 لتر من محلول طبيعي رينغر خارج الخلية (في ملي: كلوريد الصوديوم 124، بوكل 3، 4 MgSO 1.3، CaCl 2 2، 3 NaHCO 26، ناه 2 PO 4 1.25، الجلوكوز 15؛ درجة الحموضة 7.6 و 305 الميلي أسمول). الحفاظ على 4 ° Cحتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون داخل الخلايا (مم): بوكل 70، KOH 53، حمض methanesulfonic 30، EGTA 5، HEPES 10، السكروز 70؛ الرقم الهيدروجيني 7.2 (KOH) و 310 الميلي أسمول. الحفاظ على 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. جيدة لعدة أسابيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل داخل الخلايا تسجيل مع النيستاتين بشكل إرتجالي (في آخر لحظة) قبل التجربة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن 3 ملغ من النيستاتين، إضافة 50 ميكرولتر من DMSO. دوامة 20 ثانية ثم يصوتن 2-3 دقائق حتى المخفف بالكامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من حل DMSO نيستاتين في 5 مل من محلول المخزون داخل الخلايا. دوامة و 20 ثانية، ثم يصوتن 3 دقائق. الحفاظ على هذا الحل في 4 درجات مئوية، وحماية من الضوء المباشر، نيستاتين غير حساسة للضوء. هذا الحل يمكن استخدامها لبضع ساعات. استبدال كل يوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة إعداد الظهارة الشمية تحت المجهر، واتخاذ بعض من هذا الحل في حقنة 1 مل مع طرف الأصفر ممدود اللهب لملء الأقطاب. بعيدا عن الضوء المباشر. مرة واحدة على RT، والحل نيستاتينغير مستقر. استبدال الحل في حقنة 1 مل كل ساعة أو الاحتفاظ بها في الجليد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب أقطاب تسجيل مع ساحبة للحصول على رقبة طويلة ورأس صغير (~ 2 ميكرون) مع المقاومة من 15-20 MΩ مع الحل نيستاتين الداخلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل الرائحة عند 0.5 M في DMSO تحت غطاء الدخان. قسامة والحفاظ على درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. تخفيف الرائحة في حل قارع الأجراس حتى التركيز المطلوب. ملء ماصة محفزة. </li></ol> 3. إعداد الظهارة الشمية ملاحظة: الفئران OR-IRES-tauGFP تعبر عن tauGFP تحت سيطرة أو المروج. في هذه الفئران، وصفت جميع الخلايا العصبية معربا عن OR في المصالح مع GFP. ويتم تكييف هذا البروتوكول لنسب الأرجحية التي أعرب عنها في جميع المناطق. ومع ذلك، تشريح والتسجيلات هي أسهل للنسب الأرجحية أعرب في المنطقة الظهرية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الحيوان عن طريق حقن مزيج من الكيتامين وزيلازين (150 ملغ / كغ و 10 ملغم / كغم بودالوزن ذ، على التوالي). قطع الرأس يمكن القيام بها مع مقص حاد للفئران شابة أو مع المقصلة القوارض وتصان بشكل مناسب لالفئران الأكبر سنا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص حلقة تشريح جعل شق وسطي طولية من خلال الجلد الظهرية. إزالة الجلد عن طريق سحب إربا. باستخدام مقص، وقطع أقل الفكين في مفصل الفك. إزالة الأسنان الأمامية العلوية التي كتبها خفض مواز الاكليلية للأسنان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اجراء خفض الاكليلية من الرأس خلف العينين وتبقي فقط على الجزء الأمامي من الرأس. تراجع في حل قارع الأجراس المثلج للتشريح ضمن نطاق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح تحت النطاق: في الجانب البطني، وجعل قطع طولية على طول الفك العلوي / الأسنان. قطع العظام الظهرية طوليا، في أعقاب الجانب ظهراني الجانبي للتجويف الأنف. إزالة معظم العظام والحنك. نقل الحاجز وظهارة المرتبطة به في الاوكسيجين قارع الأجراس في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتشريح النهائي: الحق قبل البدء في تسجيلالدورة، قشر بعيدا ظهارة من الحاجز الأساسي بالملقط. فصل ظهارة مع ملقط ومع اثنين من 4-5 ملم تخفيضات مقص (microvannas استخدام مقص) في الجزء الأمامي من الحاجز حيث التصاق أقوى. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية الجهاز الميكعي بقطع عليه على طول اتصال ظهري لظهارة الحاجز. نقل الظهارة إلى غرفة تسجيل مع طبقة المخاط مواجهة. يبقيه شقة في غرفة مع القيثارة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت غرفة تحت المجهر تستقيم مجهزة البصريات مضان وكاميرا حساسة. تصور إعداد على شاشة الكمبيوتر في تضخم عالية من خلال 40X الهدف الغمر بالمياه (الفتحة العددية 0.8) و2X أو 4X التكبير اضافية من خلال عدسة مكبرة تحقيقه. يروي باستمرار مع الاوكسيجين قارع الأجراس في RT (1-2 مل / دقيقة). </li></ol> 4. تسجيل الدورة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بحث عن الخلية الفلورسنت: تثير إعداد 480نانومتر لEGFP، التي تنبعث الضوء في نطاق 530-550 نانومتر. هدف واحد مقبض شجيري وهو أمر واضح بشكل صحيح في مضان وتحت حقل مشرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء القطب مع الحل الخلايا مع النيستاتين. إزالة الفقاعات من خلال استغلال بلطف على القطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج القطب على حامل الكهربائي، وتطبيق الضغط الايجابي في ماصة. يجب أن تكون المقاومة 15-20 MΩ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب الكهربائي بالقرب من الخلية؛ عند بلوغ المقاومة ~ 40 MΩ، والإفراج عن الضغط الإيجابي والضغط السلبي طفيف للوصول إلى gigaseal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حالما يتم التوصل إلى ختم، تعيين غشاء المحتملة بنحو -75 بالسيارات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم فتح الخلية، والمضي قدما مع بروتوكولات التحفيز، والعلاجات الدوائية. لقياس استجابة لتحفيز الرائحة واحد، سجل 200-500 ميللي ثانية من النشاط العفوي، وتحفيز لمدة 500 ميللي ثانية وقياس استجابة الخلايا لمدة تصل إلى 10 ثانية (13). لعلاجات الدوائية، يروي كلاء الدوائية فيالتركيز المطلوب 20. </li></ol> 5. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل التيارات التي تسببها التحفيز الرائحة على النحو التالي: الحد الأقصى للسعة، لمرة وارتفاع (الوقت اللازم لتصل إلى 90٪ من الحد الأقصى للسعة، في مللي ثانية)، ومجموع (منطقة تحت منحنى في PAS) الحالية، والوقت بنسبة 50٪ (الوقت بين بداية وإزاحة استجابة بنسبة 50٪ من الحد الأقصى للسعة، في مللي ثانية). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام التيارات ذروة تنبيغ (بلغت أقصى اتساع) بتركيزات مختلفة، ورسم وتناسب منحنى الاستجابة للجرعة باستخدام المعادلة هيل: I = ايماكس / (1 ​​+ (K 02/01 / C) ن)، حيث كنت يمثل الذروة الحالية ، IMAX أكبر عدد من الردود في تركيزات تشبع، K1 / 2 تركيز الذي تم التوصل نصف الحد الأقصى للاستجابة، C تركيز الرائحة ون معامل هيل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل تسجيلات لغشاء المحتملة في المشبك الحالي لتحقيق أقصى قدر من الاستقطاب، وTOTAل إمكانات أثارت (منطقة تحت منحنى في mVsec)؛ سجل النشاط العفوي ارتفاعه أكثر من 30 ثانية إلى 1 التسجيلات دقيقة. استثارة سجل عن طريق المسامير التي تسببها الحقن التيارات (5-10 باسكال). </li></ol>

<ol>
	<li>Lowe, G., Gold, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+amplification+by+calcium-dependent+chloride+channels+in+olfactory+receptor+cells.">Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells.</a> Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).</li><li>Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-induced+responses+recorded+from+olfactory+receptor+neurons+using+the+suction+pipette+technique.">Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique.</a> J Vis Exp. (62), e3862 (2012).</li><li>Moss, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+and+biochemical+responses+of+mouse+vomeronasal+receptor+cells+to+urine-derived+compounds:+possible+mechanism+of+action.">Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action.</a> Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).</li><li>Kaur, A., Dey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+calcium+imaging+of+dissociated+vomeronasal+neurons.">Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons.</a> Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).</li><li>Ma, M., Chen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+rat+and+mouse+olfactory+receptor+neurons+from+an+intact+epithelial+preparation.">Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation.</a> J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).</li><li>Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors:+a+molecular+basis+for+odor+recognition.">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65 (1), 175-187 (1991).</li><li>Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+receptor+expression+defines+functional+units+in+the+mouse+olfactory+system.">Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system.</a> J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).</li><li>Bozza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+class+I+and+class+II+odorant+receptors+to+glomerular+domains+by+two+distinct+types+of+olfactory+sensory+neurons+in+the+mouse.">Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse.</a> Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).</li><li>Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minigenes+impart+odorant+receptor-specific+axon+guidance+in+the+olfactory+bulb.">Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb.</a> Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).</li><li>Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+of+mouse+olfactory+sensory+neurons+by+odorant+receptors+and+the+beta2+adrenergic+receptor.">Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor.</a> Cell. 117 (6), 833-846 (2004).</li><li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+ligands+for+odorant,+vomeronasal+and+taste+receptors.">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).</li><li>Grosmaitre, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SR1,+a+mouse+odorant+receptor+with+an+unusually+broad+response+profile.">SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile.</a> J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).</li><li>Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+responses+of+olfactory+sensory+neurons+expressing+the+odorant+receptor+MOR23:+a+patch+clamp+analysis+in+gene-targeted+mice.">Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).</li><li>Lam, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+responsiveness+of+embryonic+mouse+olfactory+sensory+neurons+expressing+the+odorant+receptors+S1+or+MOR23.">Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23.</a> Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).</li><li>Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+stimulus+specificity+and+glomerular+position+in+the+mouse+olfactory+system.">Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system.</a> Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).</li><li>Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+detection+of+amines+by+a+trace+amine-associated+receptor.">Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor.</a> J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).</li><li>Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+odorant+receptors+and+response+properties+of+olfactory+sensory+neurons+in+aged+mice.">Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice.</a> Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).</li><li>Cadiou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+odorant+exposure+induces+peripheral+olfactory+plasticity+at+the+cellular+level.">Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level.</a> J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).</li><li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+wiring+in+the+mouse+olfactory+system.">Axonal wiring in the mouse olfactory system.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).</li><li>Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+functions+of+mammalian+olfactory+sensory+neurons+as+odor+detectors+and+mechanical+sensors.">Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors.</a> Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).</li><li>Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odor+response+properties+of+rat+olfactory+receptor+neurons.">Odor response properties of rat olfactory receptor neurons.</a> Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).</li><li>Heydel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-binding+proteins+and+xenobiotic+metabolizing+enzymes:+implications+in+olfactory+perireceptor+events.">Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events.</a> Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).</li><li>Pelosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perireceptor+events+in+olfaction).">Perireceptor events in olfaction).</a> J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).</li><li>Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-phosphoinositides+modulate+cyclic+nucleotide+signaling+in+olfactory+receptor+neurons.">3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons.</a> Neuron. 33, 731-739 (2002).</li><li>Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+adenylyl+cyclase+inhibits+olfactory+generator+currents+induced+by+'IP(3)-odors.">Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by 'IP(3)-odors.</a> J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).</li><li>Savigner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+spontaneous+and+odorant-evoked+activity+of+rat+olfactory+sensory+neurons+by+two+anorectic+peptides,+insulin+and+leptin.">Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin.</a> J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).</li><li>Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+3-kinase-dependent+antagonism+in+mammalian+olfactory+receptor+neurons.">Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons.</a> J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

قدرة هذا البروتوكول لرصد خصائص OSNs صحية بشكل صحيح تعتمد بشكل كبير على جودة إعداد. ولذلك، فإن الخطوات تشريح حاسمة. أولا من المهم جدا أن تولي اهتماما لنوعية (الرقم الهيدروجيني، الأسمولية)، الأوكسجين ودرجة الحرارة (المثلج ولكن ليس المجمدة) من المتوسط ​​تشريح. ثانيا، الت...

الخلايا العصبية الحسية الشمية (OSN) تمثل الخطوة الأولى للإدراك حاسة الشم. تقع في الظهارة الشمية بطانة التجويف الأنفي لدى القوارض، وتحويل المعلومات الكيميائية للعطر في إمكانات العمل التي يتم إرسالها عبر محور عصبي على الدماغ. لفهم أفضل للآليات الترميز حاسة الشم، فمن الضروري أن تميز تنبيغ وغشاء خصائص OSNs. حتى وقت قريب، نفذت معظم التقنيات المستخدمة لوصف خصائص OSNs الثدييات خارجا على فصل OSNs 1-4. تستخدم عملية التفكك المختلفة (أي الإنزيمات) العمليات الميكانيكية والكيميائية لتحرير OSNs من بيئتهم. هذه العمليات لحث على عدد منخفض من خلايا متاحة للتسجيلات. هذا العدد المنخفض يمكن أن يكون أكثر أهمية في حالة الخلايا GFP المسمى. التفكك أيضا إلى إزالة الخلية الى خلية التفاعلات المحلية بين OSNs وخلايا أخرى من الظهارة الشمية التي قد تعزز survivالقاعدة وتعديل خصائص OSNs. من أجل تجاوز الإجراء التفكك، تم وضع إعداد سليمة 5. كل OSN يعبر عن مستقبلات الشم واحدة (OR) مختارة من عائلة متعددة الجينات كبيرة 6. هناك ~ 1000 نسب الأرجحية التي أعرب عنها في الظهارة الشمية الرئيسية في الماوس. نظرا لوجود عدد كبير من الحيوانات أو في نوع البرية، وفرص لتسجيل OSNs التعبير عن نفسه أو منخفضة جدا. للتغلب على هذه القيود، هي الجينات المستهدفة الفئران المتاحة فيها جميع OSNs التعبير عن الهوية أو وصفت مع البروتين الفلوري 7-9. واستخدمت هذه OSNs المسمى للقيام تحليل وظيفي في الأعمال التحضيرية فصلها 7،10،11 مع العيوب المذكورة في وقت سابق. لذا لإعداد ظهارة سليمة 5 من الفئران وصفت وراثيا تلتف هذه القضايا. لأنها تتيح رصد نشاط OSNs معربا عن نسب الأرجحية محددة بدقة في بيئة أقرب إلى في السادسفو وقت ممكن. الى جانب ذلك، تسجيلات التصحيح المشبك من OSNs تسمح أيضا تحليل دقيق لخصائص الغشاء، تنبيغ مسار الصيدلة، يجند / أو التفاعلات. بالكاد يمكن تحليل كل هذه المواضيع باستخدام التسجيلات خارج الخلية. استخدمنا هذه التقنية لرصد ردود OSNs التعبير عن مستقبلات الرائحة SR1 وMOR23 12،13. تم تأكيد جدوى هذه التقنية من قبل مجموعات أخرى على MOR23 معربا عن OSNs 14 فضلا عن نسب الأرجحية الأخرى معربا عن الخلايا العصبية 15،16. رصد مجموعة محددة من OSNs يمكن أن يؤدي إلى تحليل خصائصها في العديد من السياقات المختلفة مثل التنمية 14، والشيخوخة 17، الرائحة التي يسببها اللدونة 18، ودور الاختلافات في تسلسل مستقبلات الرائحة في رائحة الترميز 15. وبالتالي يتيح هذا البروتوكول أداة قوية لرصد الخصائص الفنية للOSNs المعرفة على مستوى الغشاء.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">heavy equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibration table with Faraday cage</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-500 SERIES</td>
			<td>required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user&#39;s preference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFL40XW</td>
			<td>at least 2 objectives required: a 4x or 10x for coarse approach to the cell; and a 40x immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW/IR/0,8/WD:3.3 MM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnifier</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-TVCAC</td>
			<td>ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP72</td>
			<td>a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filters</td>
			<td>Olympus/Chroma</td>
			<td></td>
			<td>depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">recording electrodes /system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC10 USB</td>
			<td>monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>Patchmaster</td>
			<td>controls the amplifier during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP225</td>
			<td>precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/1Oth of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrode puller</td>
			<td>sutter</td>
			<td>P97</td>
			<td>with a FT345-B wide trough filament;&#160; to prepare recording pipets of about 2&#181;m diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass</td>
			<td>sutter</td>
			<td>BF120-69-10</td>
			<td>in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recording chamber</td>
			<td>warner instruments</td>
			<td>RC-26G</td>
			<td>a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multibarrel puller</td>
			<td>MDI</td>
			<td>PMP-107-Z</td>
			<td>by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>precision pressure injector&#160;</td>
			<td>Toohey Company</td>
			<td>P/N T25-1-900 Single Channel&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>this precision pressure injector&#160; controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V&#160; TTLs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>YOU-1</td>
			<td>a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubings</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">solutions/perfusion/chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>gardner denver</td>
			<td>300 series</td>
			<td>a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion system</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nystatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3503</td>
			<td>mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIMETHYL SULFOXIDE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td>intracellular/extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride di hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63140</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td>internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MethylSulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47,135-6</td>
			<td>intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes-Na</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006</td>
			<td>intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>intracellular solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perforated patch-clamp recording of mouse olfactory sensory neurons in intact neuroepithelium: functional analysis of neurons expressing an identified odorant receptor

تحليل الاستجابات الفسيولوجية للخلايا العصبية الحسية الشمية (OSN) عندما حفز مع بروابط معينة أمر بالغ الأهمية لفهم أساس السلوكيات مدفوعة حاسة الشم والتشكيل الخاصة بهم. هذه الخصائص الترميز تعتمد بشكل كبير على التفاعل الأولي بين جزيئات الرائحة ومستقبلات الشم (OR) أعربت في OSNs. هوية وخصوصية ويجند الطيف من التعبير عن أو حاسمة. أعرب احتمال العثور على يجند من OR في OSN اختيارها عشوائيا داخل الظهارة منخفضة جدا. لمواجهة هذا التحدي، هذا البروتوكول يستخدم وراثيا الفئران الموسومة معربا عن GFP بروتين فلوري تحت سيطرة المروج من نسب الأرجحية محددة. وتقع OSNs في ظهارة ضيقة وتنظيم المبطنة للتجويف الأنف، مع الخلايا المجاورة تؤثر النضج وظيفة. نحن هنا تصف طريقة لعزل والظهارة الشمية سليمة وتسجيل من خلال تسجيلات التصحيح المشبك خصائص OSNs هxpressing مستقبلات الرائحة محددة. بروتوكول يسمح احد لتوصيف خصائص الغشاء OSN مع الحفاظ على تأثير الأنسجة المجاورة. تحليل نتائج التصحيح، المشبك غلة الكمي الدقيق ليجند / أو التفاعلات، ومسارات نقل والصيدلة، والترميز خصائص OSNs &#39;والتشكيل على مستوى الغشاء.

نتائج هذا البروتوكول يعتمد على نوعية تشريح. يجب أن يكون هذا الخطوات تشريح قصيرة (أقل من 10 إلى 15 دقيقة) ودقيق (أي، لتجنب أضرار من ظهارة). يوضح الشكل 1 كيف يمكن إعداد مثالية يشبه في مستويات التكبير المختلفة. في تضخم منخفض تحت حقل مشرق أنواع مختلفة من الخلايا (...

Watch this Scientific Journal Video about Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

مثقب تسجيل التصحيح، المشبك من الماوس العصبونات الحسية الشمية في الظهارة العصبية السليمة: التحليل الوظيفي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها إبداء الرائحة مستقبلات

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

perforated-patch-clamp-recording-mouse-olfactory-sensory-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.6K Views.  Université de Bourgogne. Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Video: Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

تحليل الردود من الخلايا العصبية الحسية الشمية ماوس باستخدام تسجيل Electroolfactogram الهواء المرحلة

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

فلاش التحلل الضوئي للمركبات محبوس في سيليا من العصبونات الحسية الشمية

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

الرائحة التي يسببها الردود المسجلة من الخلايا العصبية مستقبلات الشم باستخدام تقنية شفط الماصة

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

الفلورسنت وصفها الوراء يسمح لخارج الخلية المستهدفة واحدة وحدة التسجيل من الخلايا العصبية التي تم تحديدها<em&gt; في الجسم الحي</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

تسجيل النشاط الكهربائي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها في الدماغ سليمة من الأسماك المعدلة وراثيا

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

عزل الخلايا العصبية الحسية من<em&gt; Aplysia californica</em&gt; للحصول على التسجيلات المشبك التصحيح من التيارات الجلوتاميرجي

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

تسجيل داخل الخلايا، الحسي الميداني رسم الخرائط، والخلايا العصبية التي تم تحديدها في المستنزف، العلقة الطبية</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

كله من جبل Immunolabeling الشم مستقبلات الخلايا العصبية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الهوائي

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

تسجيل الخفيفة أثار-الردود بعد المشبكي في الخلايا العصبية في الظلام تكييفها، الاستعدادات ماوس الشبكية شريحة عن طريق تقنيات المشبك التصحيح

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

الأعمال التحضيرية وبروتوكولات "كل خلية التصحيح المشبك تسجيل" ليفيس النمو تيكتال الخلايا العصبية

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...