كاي جونسون ايفان كوريا أندرياس بريشت كاترين Müentener كريس نورين أحد لوه مينج شو تيودور ديفيز سالفاتوري Russello أيهوا تشانغ الإنكا غوش اليسا Maunus نيكولاس ابارث جيمس ماكفارلاند جون Buswell بريندا ديزموند جيمس Ellard دون مشط

الطلاء CHO - K1 خلايا : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 100μl من خلايا K1 CHO التي تم trypsinized وفقا لبروتوكولات موحدة ل6ml من اكتمال F - 12K. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج تعليق خلية pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات ، ثم قسامة 300 ميكرولتر من التعليق على كل خلية trypsinized جيدا معقمة 8 غرفة مختبر تيك ساترة يحتل هيئة تشريعية الثانية مع 1.5 # البورسليكات ساترة غرف (Nalgene نونك الباحث ؛ المنتج # 155409 ؛ الكثير : 100808-8-0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 بين عشية وضحاها. </li></ol> عابر ترنسفكأيشن من CHO - K1 مع خلايا pSNAP - ADRB2 وpSNAP H2B - : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من خلية ثقافة غرف المصنفة في اليوم السابق للبحث عن كثافة الخلايا والصحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية العدد المناسب من الأنابيب microfuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في التدفق الصفحي هود ، إعداد الخلائط ترنسفكأيشن المعقدة وفقا للرسم البياني عينة التالية ، وذلك باستخدام إما 0.3 ميكروغرام pSNAP ADBR2 - DNA البلازميد أو التحكم 0.3 ميكروغرام من الحمض النووي للمراقبة pSNAP - H2B البلازميد ، 1 ميكرولتر من TransPass D2 و 1 ميكرولتر الخامس TransPass في رد الفعل. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> البلازميد </td><td> عدد من ردود الفعل </td><td> ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة </td><td> ميكرولتر من D2 TransPass </td><td> ميكرولتر الخامس TransPass </td><td> ميكرولتر من DNA البلازميد </td><td> ميكرولتر من D2/reaction TransPass </td><td> ميكرولتر الخامس TransPass / رد فعل </td><td> نانوغرام من الحمض النووي / رد فعل </td><td> اضرب الحمض النووي. (نانوغرام / ميكرولتر) </td><td> ميكرولتر من DNA البلازميد / رد فعل </td></tr><tr><td> SNAP - ADRb2 </td><td> 5 </td><td> 236.5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3.5 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 472.34 </td><td> 0.7 </td></tr><tr><td> H2B - SNAP </td><td> 5 </td><td> 237 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 515.89 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> همية </td><td> 5 </td><td> 240 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Untransfected </td><td> 5 </td><td> 250 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا ، مزيج الحرة المصل F - 12K مع الحمض النووي للبلازميد المناسبة ، ثم إضافة الكاشف TransPass ترنسفكأيشن D2 ، ثم إضافة ترنسفكأيشن الخامس TransPass الكاشف. مزج المكونات جيدا pipetting بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات بعد إضافة كل كاشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان تفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء الحضانة ، وغسل خلايا مرة واحدة مع 600 ميكرولتر من DMEM كاملة وإضافة 450 ميكرولتر من DMEM الكامل إلى كل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكروليتر من خليط معقد ترنسفكأيشن لكل عينة ، ببطء وبطريقة حكيمة المنسدلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان نماذج ليلا 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2. </li></ol> SNAP الخلوي TMR صفها نجمة خلايا - K1 CHO Transfected عابر مع pSNAP - ADRB2 وpSNAP H2B - : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية وسائل الإعلام ترنسفكأيشن تعقيدا من كل عينة عن طريق الشفط فراغ. غسل الخلايا مرتين مع 600 ميكرولتر من اكتمال F - 12K واستبدال وسائل الإعلام في كل بئر مع 600 ميكرولتر من اكتمال F - 12K. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج سائل الإعلام وسم الصبغة بإضافة 995 ميكروليتر من اكتمال 12K - F و 51 ميكرولتر 0.6 مم SNAP سيل الركيزة TMR ستار. وينبغي تركيز النهائي من SNAP سيل ستار TMR يكون 3mM. ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط بعد إضافة الركيزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية وسائط النمو من عينات وإضافة 200 ميكرولتر من وسائل الاعلام الوسم صبغ كل جانب. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما تحتضن العينات ، وإعداد هويشت 33342 حل لتلطيخ النووي لعينات عن طريق خلط 1 ميكرولتر من هويشت 33342 ، trihydrochloride ، هيدرات (10 ملغ / مل حل في الماء و 16.2 ملي حل ؛ مجسات Invitrogen الجزيئية) في 10 مل من اكتمال 12K - F . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام من جميع العينات وإضافة 600 ميكرولتر من محلول مخفف لهويشت كل عينة. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينات ثلاث مرات مع 600 ميكرولتر من اكتمال F - 12K. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة إضافية للسماح لنشر fluorophore الفردية خارج الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 30 دقيقة ، وتغير وسائل الإعلام على عينات SNAP سيل للمرة الأخيرة ، والشروع في التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة الخلايا باستخدام مجهر زايس Apotome 200M Axiovert الفلورسنت. </li></ol> ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. هنابعض النتائج ممثل الفلورسنت التصوير باستخدام المجهر الفلورسنت القياسية من الخلايا COS - 7 العيش التي هي تعبير عن SNAP - علامة اندماج. هذه الصورة الأولى يظهر يعيش COS - 7 - pSNAP معربا عن الخلايا H2B (النووية هيستون) المسمى مع الخلوي SNAP TMR ستار. ولدت في بناء pSNAP - H2B باستخدام العلامة pSNAP - (م) النواقل. وصفت الخلايا مع SNAP سيل ستار TMR لمدة 30 دقيقة مع وcounterstained هويشت 33342 (أزرق) للنوى. ومضان الوردي يوضح التراكب من مضان أحمر حيث بروتين موجود في هيستون بالإضافة إلى مضان زرقاء تشير إلى النواة. ومن الواضح أن وسهولة التعرف على التعبير عن بروتين H2B. <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكلين 2 و 3 ، وهذه الصور تظهر المقبلتين يعيش COS - 7 خلايا transfected عابر مع pSNAP - ADRβ2. وصفت الخلايا مع الخلوي SNAP TMR ستار (الحمراء) ، وcounterstained مع هويشت 33342 (الأزرق). ولدت في بناء pSNAP - ADRβ2 باستخدام العلامة pSNAP - (م) النواقل. وصفت الخلايا مع SNAP سيل ستار TMR لمدة 30 دقيقة مع وcounterstained هويشت 33342 (أزرق) للنوى. ومضان أحمر يدل على وجود بروتين سطح الخلية ADRB2 مستقبلات اللون الأزرق بينما يحدد مضان النواة.

<ol>
	<li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+biochemical+activities+in+living+cells.">Visualizing biochemical activities in living cells.</a> Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).</li><li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP-tag+Technologies:+Novel+Tools+to+Study+Protein+Function.">SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function.</a> NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).</li></ol>

ويعمل المؤلفون من خلال نيو إنجلاند Biolabs التي تنتج الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

هناك العديد من المتغيرات التي تؤثر على النتائج لوحظ كثافة مثل تركيز الليزر ، وقدرات المعدات والعدسة المستخدمة ، إلخ صمود للضوء لfluorophore يحدد مدى السرعة التي يجب أن يتم القبض مضان قبل أن يتلاشى. هذه الطريقة لوضع العلامات البروتين هي متعددة ومناسبة للعديد من التطبيقات. SNAP - CLIP العلامة والعلامة التكنولوجيات لوضع العلامات المحددة للبروتينات اندماج مع تحقيقات الاصطناعية تمكين مختلف جوانب وظيفة البروتين ، بما في ذلك مجموعة متنوعة من العمليات الحيوية في الخلايا الحية وlysates في الخلية. SNAP ، CLIP ، وMCP ACP - العلامة تكنولوجيات توفير البساطة وبراعة غير عادية في التصوير من البروتينات في الخلايا الحية والثابتة ولدراسة البروتينات في المختبر. إنشاء بناء جين واحد ينتج بروتين قادر على الانصهار الموسومة تشكيل الروابط التساهمية لمجموعة متنوعة من الفئات الوظيفية ، بما في ذلك fluorophores ، البيوتين ، أو الخرز. يجب أن تكون مستنسخة من البروتين وأعربت عن الفائدة مرة واحدة فقط ومن ثم يمكن استخدامها في الانصهار مع مجموعة متنوعة من ركائز الفلورسنت لتطبيقات عديدة مثل المصب الوسم في وقت واحد من البروتين داخل الخلايا الحية ، والترجمة البروتين إزفاء ، نبض مطاردة التجارب والدراسات استيعاب مستقبلات وانتقائية العلامات سطح الخلية والبروتين هدم المقايسات ، كشف عن البروتين في SDS - PAGE ، التدفق الخلوي ، وارتفاع إنتاجية المقايسات ملزمة في لوحات microtiter ، والتجارب تفاعل جهاز الاستشعار البيولوجي ، والحنق على أساس المقايسات ملزمة.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CHO-K1 Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>CCL-61</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Serum free F-12K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene Nunc Int.</td>
<td>155409</td>
<td>Lot: 100808-8-0</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Molecular Probes</td>
<td>H3570</td>
<td>470519</td>
</tr>
<tr>
<td>Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transpass V</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M2561S</td>
<td>0030709</td>
</tr>
<tr>
<td>Transpass D2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M2554S</td>
<td>0060802</td>
</tr>
<tr>
<td>SNAP-Cell TMR Star</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>S9105S</td>
<td>0010811</td>
</tr>
<tr>
<td>pSNAP-ADBR2 Control Plasmid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N9178S</td>
<td>0010811</td>
</tr>
<tr>
<td>pSNAP-H2B Control Plasmid </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N9179S</td>
<td>0010811</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

fluorescent labeling of cos-7 expressing snap-tag fusion proteins for live cell imaging

SNAP - CLIP العلامة والعلامة ، نظم التوسيم البروتين تمكين محددة ، المرفق من الجزيئات التساهمية ، بما في ذلك الأصباغ الفلورية ، وبروتين من الاهتمام في الخلايا الحية. هذه النظم نقدم مجموعة واسعة من ركائز الفلورسنت الأمثل لمجموعة من الأجهزة التصوير. وأعرب عن مرة واحدة مستنسخة ، ويمكن استخدام هذا البروتين المفتاحية مع مجموعة متنوعة من ركائز لتطبيقات عديدة المصب دون الحاجة إلى استنساخ مرة أخرى. هناك نوعان من الخطوات لاستخدام هذا النظام : الاستنساخ والتعبير عن بروتين من الفائدة انصهار SNAP - العلامة ، والوسم من الانصهار مع الركيزة SNAP - علامة الاختيار. الأداة الإضافية العلامة هو بروتين صغير استنادا O الإنسان<sup&gt; 6</sup&gt; - alkylguanine - DNA - alkyltransferase (hAGT) ، وهو بروتين إصلاح الحمض النووي. SNAP - العلامة التسميات الأصباغ مترافق لجوانين أو ترك مجموعات chloropyrimidine عبر رابط البنزيل. في رد فعل العلامات ، يتم إرفاق تساهمي المجموعة استبداله بنزيل من الركيزة إلى العلامة - SNAP. CLIP - البطاقة هي نسخة معدلة من العلامة - SNAP وهندستها لتتفاعل مع benzylcytosine بدلا من المشتقات benzylguanine. عندما تستخدم بالاقتران مع البطاقات ، SNAP ، CLIP - العلامة يمكن وسم متعامد والتكميلية في وقت واحد من اثنين من البروتينات في الخلايا نفسها.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging at JoVE.com

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP - CLIP العلامة والعلامة ، نظم التوسيم البروتين تمكين محددة ، المرفق من الجزيئات التساهمية ، بما في ذلك الأصباغ الفلورية ، وبروتين من الاهتمام في الخلايا الحية. وأعرب عن مرة واحدة مستنسخة ، ويمكن استخدام هذا البروتين المفتاحية مع مجموعة متنوعة من ركائز لتطبيقات عديدة المصب دون الحاجة إلى استنساخ مرة أخرى.

الفلورسنت وصفها من COS - 7 تعرب عن البروتينات الانصهار SNAP - شعارا لتصوير الخلايا الحية

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

fluorescent-labeling-cos-7-expressing-snap-tag-fusion-proteins-for

Research

JoVE Journal

Biology

22.9K Views.  New England Biolabs. SNAP - CLIP العلامة والعلامة ، نظم التوسيم البروتين تمكين محددة ، المرفق من الجزيئات التساهمية ، بما في ذلك الأصباغ الفلورية ، وبروتين من الاهتمام في الخلايا الحية. وأعرب عن مرة واحدة مستنسخة ، ويمكن استخدام هذا البروتين المفتاحية مع مجموعة متنوعة من ركائز لتطبيقات ...

Video: Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

وسم الخلايا الجذعية مع الأصباغ نيون للمنظمات غير الغازية مع الكشف عن التصوير الضوئي

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

يعيش التصوير خلية من طراز F - أكتين حيوية عن طريق الميكروسكوب الرقطة نيون (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

بطاقات المواد الفلورية ذبابة الفاكهة</emهياكل القلب>

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

زرع GFP - معربا عن Blastomeres للتصوير لايف التنمية الشبكية والدماغ في الجنين اسماك الزرد همي

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of fluorescence can be changed by exposure to light of a specific wavelength. Optical highlighting allows noninvasive marking of a subpopulation of fluorescent molecules, and is therefore ideal for tracking single cells or organelles.
Critical parameters for efficient photoconversion are the intensity and the exposure time of the photoconversion light. If the intensity is too low, photoconversion will be slow or not occur at all. On the other hand, too much intensity or too long exposure can photobleach the protein and thereby reduce the efficiency of photoconversion.
This protocol describes a general approach how to set up a confocal laser scanning microscope for pc-FP photoconversion applications. First, we describe a procedure for preparing purified protein droplet samples. This sample format is very convenient for studying the photophysical behavior of fluorescent proteins under the microscope. Second, we will use the protein droplet sample to show how to configure the microscope for photoconversion. And finally, we will show how to perform optical highlighting in live cells, including dual-probe optical highlighting with mOrange2 and Dronpa.

This protocol describes a general approach to perform photoconversion of fluorescent proteins on a confocal laser scanning microscope. We describe procedures for the photoconversion of puried protein samples, as well as for dual-probe optical highlighting in live cells with mOrange2 and Dronpa.

Photoconversion منقى من البروتينات ونيون المزدوجة التحقيق تسليط الضوء البصري في الخلايا الحية

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

عامين والتصوير الثلاثي الابعاد لايف خلية من البروتينات DNA الاستجابة الأضرار

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

يعيش التصوير من البروتينات التي تحمل علامات GFP في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; البويضات

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

تعبير البروتينات الفلورية الانصهار في مورين الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم والضامة

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...