تم اختراع أفضل مبدأ للتنظير الطيفي للارتباط الفلوري ، FCS ، في البداية في السبعينيات. في 1990s، تم إنشاء تحسينات هامة والعديد من لFCS من خلال الجمع مع المجهر جهاز confocal. ومنذ ذلك الحين، تم استخدام FCS للعديد من التطبيقات الكيميائية وعلاج الفيروسات، مثل التفاعلات الجزيئية وتحليل تجميع البروتين.
تجميع البروتين هو السمة المميزة للاضطرابات العصبية. سطوع الفلورية هي جزيئات واحدة في العمل من الأحجام الجزيئية التي تفسرها خصائص الانتشار. من المهم جدا في قياس تجمعات البروتين لأنه يمكن تحديد دورات الحياة المتوقعة من الجزيئات، ولكن أيضا التمييز بين البلمرة المثلية أو الغيرية.
هنا ، نقدم إجراء لقياس انتشار التصلب الجانبي الضموري المرتبط بروتين الشكل المجمع باستخدام FCS في lysates الخلية والخلايا الحية. إعداد 100 ملليمتر طبق من البلاستيك تنمو Neuro2a الخلية يجلس بشكل مريح في المتوسط النمو الطبيعي. تأكد من التقاء الخلية.
إزالة الوسيطة. إضافة 3.5 ملليلتر من الحل تريبسين-EDTA في طبق خرطوشة الثالث واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. إضافة 9.5 ملليلتر متوسط النمو الطبيعي في الطبق وتعليقها.
يتم خلط تعليق الخلية مع تريبان الأزرق لتلطيخ الخلايا الميتة. أضف التعليق إلى شريحة عد الخلايا. عد عدد الخلايا باستخدام عداد الخلية، أو يدويا.
تحقق من رقم الخلية الحية وقابليتها للاستمرار. تمييع الخلية في الوسط العد في 1.0 مرات 10 إلى قوة 5 لكل ملليلتر. إضافة اثنين من ملليلتر من تعليق الخلية في طبق من البلاستيك 35 ملليمتر لتحلل الخلية أو طبق مساحة النمو لقياس الخلايا الحية.
احتضان الطبق في 37 درجة مئوية ليوم واحد. في اليوم التالي، وإعداد خليط من الحمض النووي البلازميد وواشف العدوى. أضف خليط العدوى إلى الوسط الذي تم عده بالخلايا واحتضن الخلايا لمدة 24 ساعة.
بعد يوم واحد. تحقق من التعبير GFP باستخدام المجهر الروتيني. يمكنك أن ترى الجسم المكون TDP25 مشرق جدا في الخلايا.
وينبغي إجراء تحلل الخلية في مقاعد البدلاء البيوكيميائية. إزالة المتوسطة في الطبق. إضافة اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني في 25 درجة مئوية لغسل كوسيلة.
إزالة برنامج تلفزيوني. ضع الطبق على طبق من الألومنيوم على الجزء العلوي من الجليد المسحوق. على الفور، إضافة 200 ميكرولتر تحلل العازلة في الطبق.
كشط الطبق باستخدام مكشطة الخلية. استعادة lysate مع حطام الخلية غير الملولوب في أنبوب جديد 1.5 ملليمتر. الطرد المركزي lysate في أربع درجات مئوية.
بالنسبة لقياسات الخلايا الحية، استبدل الوسط بمقياس جديد قبل القياس. تحقق من مرفق الخلية باستخدام مجهر تباين المرحلة. تحقق أيضا من تعبير GFP باستخدام مجهر مضان.
استخدم نظام FCS المجمع بالمجهر البؤري. قم بتشغيل ليزر 488 نانومتر. استقرار النظام، على الأقل، لمدة 30 دقيقة.
إعداد المسار البصري. استخدم ليزر 488 نانومتر للضوء الفوري. استخدام مقسم شعاع المناسبة ومتر ديكهرويك.
وأيضا، صمامات الفلورسينس. عادة، سوف نستخدم غرف coverglass للمعايرة وقياسات الحل. بعناية، واتخاذ غرفة coverglass.
ضع السطح الزجاجي على ورق فحص العدسة. صب معايرة FCS. إضافة حل رودامين 6G في كذلك.
إضافة المياه فائقة الشراء على الهدف. لا تستخدم الزيت. تعيين الغرفة على خشبة المسرح المجهر.
نقل المرحلة إلى الموضع المناسب. قم بإنشاء تعديل الثقب وافتح معالج ضبط الثقب. مراقبة معدل العد فوتون كحركة الخشنة من الثقب لاتجاه س.
وقد تم تحديد ألمع موقف عن حق. بعد ذلك، راقب معدل عدد الفوتونات كحركة دقيقة. تم تحديد ألمع موقف بنجاح هذا هو موقف الثقب لx-الاتجاه.
وبنفس الطريقة، ابحث عن ألمع موضع للثقب بحثا عن اتجاه y. كما تم تحديد ألمع موقف لy-الاتجاه بنجاح. مركبة موقف س و ص من الثقب.
فمن الأفضل لضبط موقف الثقب قبل قياس كل يوم. عند تغيير المسار المباشر، يجب تعديل موضع الثقب مرة أخرى. إنشاء معدل العد ومراقبة معدل عدد الهاتف.
تغيير إلى وضع مراقبة CPM. عد حلقة تصحيح الكائن الذي قمت بتشغيله بحيث تكون قيمة CPM الأعلى. أغلق إطار معدل العد.
ابدأ بقياس حل رودامين 6G. بعد الانتهاء من القياس، انقر فوق الملاءمة لإجراء تحليل تركيب المنحنى. حدد نموذجا لتركيب وظيفة الارتباط القديمة.
بالنسبة لرودامين 6G، حدد النموذج لنشر مكون واحد ثلاثي الأبعاد مع حالة ثلاثية الأبعاد. تعيين وقت البدء المناسب عن طريق تحريك الخط الأحمر. انقر فوق احتواء الكل، لبدء الحساب المناسب.
تحقق من انحراف الملاءمة. تأكد من أن يتم نشر الجانبين والسلبية، حول الصفر. تحقق من القيم المجهزة.
تأكد من أن وقت الانتشار هو تقريبا في نطاق من 20-30 ميكروثانية. وعلاوة على ذلك، المعلمة الهيكلية من أربعة إلى ثمانية. افتح لوحة الملاءمة، وحدد نموذجا للقياس.
أدخل نفس قيمة المعلمة الهيكلية في نموذج العينة في لوحة الملاءمة. تأكد من تعيين النوع ك ثابت. قياس GFP-TDP25 في lysate الخلية.
ضع ال lysate في غرفة زجاج الغطاء. ضع الغطاء لتجنب جفاف الليزات. ضع غطاء المسرح للتظليل الخفيف.
في لوحة الاستحواذ، قم بتعيين قوة الليزر ووقت القياس وتكرارها. بدء عملية الاستحواذ. ولوحظ ارتفاع.
ولوحظ ارتفاع مرة أخرى. يشير الارتفاع إلى جزيئات ساطعة مرت عبر جسم الكشف. المسامير تشير إلى أوليغومرات قابلة للذوبان أو المجاميع.
قم بإنشاء نوبة لإجراء تحليل تركيب المنحنى. حدد النموذج لنشر مكونين وثلاثي الأبعاد مع الحالة الثلاثية. تعيين وقت البدء المناسب.
انقر فوق احتواء الكل. تحقق من القيم المجهزة. SOD1-G85R الموسومة مع قياس GFP في خلية حية.
على عكس قياس الحل ، أوصي باستخدام حاضنة مرحلة الحرارة. تعيين طبق زراعة الخلايا على خشبة المسرح المجهر. تأكد من التركيز والموضع باستخدام العين.
حدد خلية قياس. تكبير وضبط موضع الخلية باستخدام وضع المسح السريع. الحصول على لقطة من الخلايا باستخدام وضع سرعة المسح الضوئي بطيئة.
حدد موضع قياس FCS باستخدام أداة الموضع. يشير التقاطع إلى موضع القياس. بدء القياس.
يشير الانخفاض الطفيف في سجل معدل عدد فوتون إلى bleaching ضوئية ل GFP. تنفيذ منحنى المناسب. تظهر النتائج التمثيلية ل GFP-TDP25 في lysate الخلية.
الرسم البياني العلوي سجل معدل عدد فوتون. حيث هناك السهام هو ارتفاع، مما يشير إلى أوليغومرات قابلة للذوبان والمجاميع. يمثل الرسم البياني الأوسط دالة الارتباط القديمة.
يظهر الخط الرمادي دالة الارتباط القديمة المنخفضة. يظهر خط أرجواني الدالة المجهزة. تشير الخطوط المنقطة إلى أوقات البدء والنهاية للتركيب.
يعرض الجدول السفلي القيمة المجهزة. بعد ذلك، تظهر النتائج التمثيلية ل SOD1-G85R-GFP في خلية حية. يمثل الرسم البياني العلوي سجلا لمعدل عدد فوتوناتنا.
ولوحظ الانخفاض التدريجي في معدل العد المسجل للفوتوان، مما يشير إلى زيادة معدل GFP بالنسبة لقياسات مختلفة. وذلك بسبب سرعة الانتشار البطيء في الخلايا الحية. يمثل الرسم البياني الأوسط دالة الارتباط القديمة ل SOD1.
يظهر الخط الرمادي دالة الارتباط القديمة المنخفضة. يظهر خط أرجواني الدالة المجهزة. تشير الخطوط المنقطة إلى أوقات البداية والنهاية مع التركيب.
يعرض الجدول السفلي القيم المجهزة. هنا نعرض لكم هذا الإجراء لقياس الانتشار من كل خلية المرتبطة TDP-25 في lysate الخلية وكل شيء متحولة من SOD1 في الخلايا الحية باستخدام FCS. يمكن ملاحظة أوليغومرات القابلة للذوبان والتجميع في ليسات الخلية في كثير من الأحيان كما طفرات أو رشقات نارية.
من ناحية أخرى ، في الخلايا الحية ، نادرا ما يلاحظ مثل هذه المسامير ، باستثناء الهياكل الحية الواضحة. وهناك أنواع نشر ببطء من SOD1 متحولة إضافة يعني سطوع لجزيئات واحدة مثل SOD1 homopolymerization داخل بالنسبة لنا. الإجراء المبين هنا بسيط وجدير بالاهتمام.
FCS لا يحتوي على الإشعاع؛ حالة نائمة مباشرة. انها مجرد الخاص بك، ولدينا، التعاطف الخيال.
