ويدعم عملنا من خلال التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية مجلس البحوث. ونود أن نشكر الأستاذ تاموتسو Yoshimori لتوريد تتكرم علينا مع البلازميد للتعبير عن CFP-LC3.

1. إعداد الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور منخفضة عدد مرور الخلايا HEK-293T معربا عن ستابلي GFP-DFCP1 في 22 coverslips على جولة مم؛ خلايا الثقافة بين عشية وضحاها في متوسطة Dulbecco التعديل النسور في (DMEM)، إلى confluency من 30-40٪ (الهدف لconfluency من 80٪ بعد 2 أيام - يوم من التصوير الخلية الحية). </li></ol> 2. ترنسفكأيشن الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مزيج ترنسفكأيشن المعقدة لكل لوحة، والتي تحتوي على 100 ميكرولتر OptiMEM أنا خفضت المتوسطة المصل، 3 ميكرولتر X-tremeGENE 9 الحمض النووي الكاشف ترنسفكأيشن، و 0.5 ميكروغرام من pECFP-LC3 DNA البلازميد. المزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا واحتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. [ملاحظة: لقد وجدنا مرارا وتكرارا أن الكواشف ترنسفكأيشن أخرى، مثل Lipofectamine عام 2000، لديهم الكثير من سمية، وبالإضافة إلى ذلك، فإنها تنتج جزيئات الفلورسنت من تلقاء نفسها التي تتداخل مع العديد من تقنيات الفحص المجهري.] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة من لوحات وإضافة جديدة DMEM قبل تحسنت عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ترانsfection المعقدة للخلايا قبل pipetting؛ الخلايا احتضان لمدة 24 ساعة. </li></ol> 3. الحضانة الخلية مع ماركر العضيم (اختياري) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة mitotracker / lysotracker إلى DMEM في تركيز النهائي من 75 نانومتر، والحفاظ على الجليد، في أنبوب فالكون مغطاة رقائق الألومنيوم، وعلى طول يوم كامل التجريبية، لتجنب التعرض للضوء وتجميد متكررة ودورات الذوبان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قسامة من 2 مل من mitotracker / lysotracker المحتوية المتوسطة والاحماء عند 37 درجة مئوية؛ نضح المتوسطة من الخلايا transfected واستبدالها مع mitotracker / lysotracker التي تحتوي على الخلايا المتوسطة واحتضان لمدة 30 - 60 دقيقة. </li></ol> 4. إعداد غرفة الحضانة ليعيش التصوير خلية (الشكل 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظيفة المعدن والبلاستيك O-حلقات مع 75٪ من الإيثانول وتطبيق الشحوم السيليكون على حافة من المعدن يا الدائري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط إزالة ساترة من لوحة وتجفيف الفائض من المتوسط ​​من الجانب السفلي من ساترة،لتجنب الخلط كثيرا المتوسطة مع الشحوم، حيث سيؤدي ذلك إلى زيادة احتمال تسرب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك ساترة للراحة على الحافة من البلاستيك يا الدائري وتناسب المعدن O-حلقة على الجزء العلوي من البلاستيك يا الدائري، مع ساترة تقع في بين، من أجل إنشاء غرفة مغلقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أعلى حتى مع غرفة متوسطة من لوحة، من هذه النقطة، وعلى، وتجنب الحضانة لفترات طويلة من الخلايا في DMEM المتوسطة دون وكيل التخزين المؤقت، لمنع التغييرات في الرقم الهيدروجيني إلى أن يحدث، حيث ان النظام العازلة بيكربونات DMEM يتطلب الاصطناعي تركيز CO 2 من 5-10٪ وتركيز CO 2 من الهواء المحيط هو أقل من ذلك بكثير. </li></ol> 5. تجويع الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غرفة الحضانة على المسرح المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة كاملة ويغسل مع 2 مل من المتوسط ​​المجاعة 3 مرات، لضمان عدم وجود الأحماض الأمينية ظلت من DMEM، والتي سوف تمنع في نهاية المطاف استجابة الالتهام الذاتي؛ تعيينتوقيت ON. </li></ol> 6. المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف تكون هناك حاجة إلى نظام التصوير المناسبة لتكوين الخلية الحية واسعة المجال برنامج التحصين الموسع ومضان. هذا وسوف تتألف عادة من الدرجة البحوث إطار مجهر مقلوب، مكثفة واسعة الطيف مصدر الضوء، والمرايا والفلاتر محددة لبروتين فلوري (ق) / صبغ (ق) من الفائدة، عدسة الهدف جودة عالية، وCCD الحساسة / sCMOS كاميرا وغرفة الحضانة. جميع الشركات المصنعة الكبرى المجهر نقدم أنظمة واسعة المجال الكامل المناسبة لتصوير الخلايا الحية، ولكن من الممكن أيضا أن المنزل بناء نظام باستخدام مكونات من مجموعة متنوعة من الشركات المصنعة والسيطرة عليه باستخدام البرمجيات مفتوحة المصدر مثل الصغرى، مدير ( <a href="http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/" target="_blank">HTTP: / / valelab.ucsf.edu / ~ MM / MMwiki /</a> ). الجانب الأكثر أهمية في رأينا هو استخدام نظام من حساسية عالية جدا، بحيث يمكن أن تظل مستويات التعبير للصحفيين الفلورسنت إلى أدنى حد ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SELecting الخلايا المناسبة لصورة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الخلايا الكبيرة والمسطحة التي تسمح الأحداث تشكيل أكثر جسيم بلعمي ذاتي ليتم القبض. أيضا، اختيار الخلايا التي قد بدأت بالفعل إنتاج عدد أكبر من omegasomes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تسجيل الفيديو بعد 30 دقيقة أو جيدا في الاستجابة الالتهام الذاتي، من أجل الاستيلاء على نسبة أكبر من الأحداث تشكيل جسيم بلعمي ذاتي في الفيديو. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام عدسة التكبير عالية (100X 1.4 NA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط كثافة الضوء الإثارة إلى 10-20٪ من الحد الأقصى لمنع الصور تبيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الكاميرا (هاماماتسو ORCA ER، حجم بكسل 6.45 ميكرون) إلى 100-500 ميللي ثانية التعرض، binning 2X2 و 100 مكسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين معدل الحصول على الصور ل1 الإطار كل 10 ثانية. </li></ol></li></ol> 7. خلق التنسيقات من الأحداث تشكيل جسيم بلعمي ذاتي مع يماغيج ويمكن أن يتم [هذا بطريقة غير منهجية ببساطة عن طريق مسح الفيديو المدمجة للبريدالمخارج من الفائدة، ولكنه يمكن أيضا أن يكون المقنن كما هو مبين أدناه.] <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مداخن صورة مفتوحة لل3 (أو 2) القبض على القنوات في ImageJ / فيجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق طرفية الأخضر والأحمر والأزرق (جداول البحث) إلى القناة المقابلة؛ دمج 3 ألوان وانقاذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من علامة التبويب تحليل، حدد أدوات&gt; ROI مدير ... &gt; تحديد، ثم حدد منطقة عشوائية من حجم محدد في الصورة الأولى من المكدس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من علامة التبويب صورة، حدد تكرار، بما يضاعف من المساحة المحددة من المكدس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من علامة التبويب صورة، حدد الأكوام&gt; جعل المونتاج ... لإنشاء المونتاج مؤقتة تحتوي على القبض على جميع الإطارات. مسح جميع الأطر في المونتاج لاستكمال تشكيل حدث جسيم بلعمي ذاتي؛ حفاظ على الملاحظات من الإطار الأول والأخير من الحدث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من علامة التبويب تحليل، حدد أدوات&gt; ROI مدير ... حدد نفس المنطقة في الصورة الأولى من المكدس لأخرى 2 الألوان وكذلك للألوان الصورة المدمجة وتكرارا المداخن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من tانه علامة التبويب ملف، اختر جديد&gt; صورة، وتعيين لعرض وفقا لعدد من وحدات البكسل اختيارها في البداية باستخدام مدير ROI، تعيين لارتفاع 4 أضعاف ارتفاع تعيينها في إدارة العائد على الاستثمار بالإضافة إلى 3 بكسل للفضاء في فترة ما بين 3 ألوان ولل اندمجت، وتعيين شرائح وعدد الإطارات في كل ستاك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من علامة التبويب صورة، حدد الأكوام&gt; أدوات&gt; إدراج ...، ثم تضاف كل واحد شبه كومة على رأس آخر، وترك مساحة من 1 بكسل في بين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من علامة التبويب صورة، حدد الأكوام&gt; جعل المونتاج ... لإنشاء المونتاج البدء والانتهاء مع الإطار الأول والأخير من الحدث تشكيل جسيم بلعمي ذاتي القبض عليه. </li></ol>

<ol>
	<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+process+and+function.">Autophagy: process and function.</a> Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Atg+proteins+in+autophagosome+formation.">The role of Atg proteins in autophagosome formation.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+from+phenomenology+to+molecular+understanding+in+less+than+a+decade.">Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+revisited:+a+conversation+with+Christian+de+Duve.">Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve.</a> Autophagy. 4, 740-743 (2008).</li><li>Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tomography+reveals+connections+between+the+phagophore+and+endoplasmic+reticulum.">3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum.</a> Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).</li><li>Hayashi-Nishino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subdomain+of+the+endoplasmic+reticulum+forms+a+cradle+for+autophagosome+formation.">A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+autophagosome+formation+using+Apg5-deficient+mouse+embryonic+stem+cells.">Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells.</a> The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).</li><li>Itakura, E., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+autophagosome+formation+site+by+a+hierarchical+analysis+of+mammalian+Atg+proteins.">Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins.</a> Autophagy. 6, 764-776 (2010).</li><li>Axe, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome+formation+from+membrane+compartments+enriched+in+phosphatidylinositol+3-phosphate+and+dynamically+connected+to+the+endoplasmic+reticulum.">Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).</li><li>Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+autophagosomes:+localized+synthesis+of+phosphatidylinositol+3-phosphate+holds+the+clue.">Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue.</a> Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول يسمح التصور من توطين بروتين خلال تشكيل جسيم بلعمي ذاتي. لقد حاولت وسائل مختلفة من تصور وصف الأحداث بما في ذلك نقطة مسح متحد البؤر، الغزل القرص مبائر وتوتال الإسفار التأمل الداخلي (TIRF) المجهري. لقد وجدنا أن لأغراض عامة القياسية واسعة...

الالتهام الذاتي هو عملية ديناميكية للغاية، الأمر الذي يتطلب التنسيق لعدد كبير من البروتينات لالنتيجة النهائية لتشكيل جسيم بلعمي ذاتي 1-3. المجهري هو على الارجح تقنية تطبيقها الأكثر شيوعا لدراسة الالتهام الذاتي 4. توطين معظم البروتينات الالتهام الذاتي وقد درس على نطاق واسع في الخلايا الثابتة، سواء من جانب المناعية تلطيخ البروتينات الذاتية والتعبير عن الموسومة fluorescently البروتين الخارجية. وبالإضافة إلى ذلك، وقد وصفت المجهر الإلكتروني (EM)، وحده، وبالاشتراك مع وضع العلامات المناعية الذهب، التفاصيل الدقيقة لهذه الهياكل 5،6. على الرغم من حقيقة أن وضعت هذه التقنيات فهمنا لتشكيل جسيم بلعمي ذاتي في الأبعاد 3 من الفضاء، إلا أنهم فشلوا في توفير كمية كافية من المعلومات حول البعد ال 4 - الوقت. تصوير الخلايا الحية يتغلب على هذا الحاجز كما أنه يسمح في أعقاب تشكيل جسيم بلعمي ذاتي أقرب ما possiبلي لفي الوقت الحقيقي 7. كان يعمل هذا الأسلوب الأول لدراسة الالتهام الذاتي من قبل Yoshimori وزملاؤه 8، واستخدمت على نحو متزايد من الآن فصاعدا. الوقت الفاصل بين المجهري يلتقط توطين POI في الخلايا الحية وعلى مدى فترة من الزمن. من خلال مقارنة هذه المعلومات مع الالتهام الذاتي جيدا اتسم و / أو علامة عضية، يمكن تحليل التصوير الخلية الحية وضع POI في سياق المكاني والزماني أكبر من تشكيل جسيم بلعمي ذاتي. ويستند تحليل التصوير الخلية الحية على اسر المتكررة من توطين POI على طول جميع الخطوات من تشكيل جسيم بلعمي ذاتي، في حين يستند التصوير من الخلايا الثابتة على التقاط واحدة. لذلك، يمكن تصوير الخلايا الحية تثبت مساهمة POI في خطوات محددة من تشكيل جسيم بلعمي ذاتي، في حين التصوير من الخلايا الثابتة إلا أن نفترض دور POI، على أساس متوسط ​​التوطين في العديد من autophagosomes القبض في وقت واحد في مراحل مختلفة من lifecy بهمكلي. على الرغم من أن التصوير الخلية الحية هي طريقة لقوة تحليلية عالية، لديها بعض القيود المتأصلة، التي ينبغي أن تؤخذ بعين الاعتبار. بادئ ذي بدء، تصوير الخلايا الحية يتطلب التعبير عن واحد أو أكثر من البروتينات الخارجية fluorescently المسمى. به نيون تميل إلى أن تكون كبيرة في حجمها وأنها يمكن أن يغير في بعض الأحيان سلوك من البروتين وذلك لأسباب الفراغية. ويتفاقم هذا الوضع بالنسبة للبروتينات الغشاء، لأنها تحتاج لتعمل في مساحة محدودة من أبعاد 2 من الأغشية. من المذكرة، autophagosomes هي هياكل غشائي، وفقا لتكوينها يتطلب عددا كبيرا من البروتينات المرتبطة الغشاء. يتم توصيل مجموعة أخرى من المشاكل إلى مستويات التعبير من POI. من حيث المبدأ، ينبغي التعبير عن بروتين الخارجية عند مستويات مماثلة لبروتين الذاتية. وهذا يضمن أن المنظمين هامة للتوطين في شبه الخلوية لن تكون مشبعة، وعشرةوتحليل ه تكون ذات صلة من الناحية البيولوجية. وعلاوة على ذلك، ينبغي تجنب overexpression من البروتينات الالتهام الذاتي، كما هو الحال عندما يتم التعبير عنها فوق المستويات المحلية، فإنها تميل إلى تثبيط استجابة الالتهام الذاتي 9. وعلى العكس، منذ مستويات التعبير عن POI ينبغي أن تكون عالية بما يكفي للسماح بعد الأقلمة الذي تضطلع به لفترة جيدة من الوقت بدون صورة تبيض، حلا وسطا لابد من التوصل إليها. تحقيق مستويات التعبير الأمثل من البروتين في الخلايا الخارجية mammalians يتطلب الكثير من ضبط، ولكن كان من الممكن من خلال إنشاء وفحص خطوط الخلايا معربا عن ستابلي مستويات مختلفة من POI. القرار المكانية التي لا يمكن أن يتحقق مع المجهري مضان هو معيار عامل آخر يحد. قد يكون القرار محدودة لعدد من الأسباب، ولكن في أحسن الأحوال، سوف يكون القرار الجانبي حوالي 250 نانومتر. وهذا يعني أن أي أجسام مفصولة مسافة أصغر من هذا سوف تظهر متصلة (أو كوحدة واحدةكائن) وكائنات أصغر من 250 نانومتر سوف تكون ممثلة في الصورة أكبر مما هي عليه في الواقع. ولذلك ينبغي دائما أن تفسر الصور مع هذا في الاعتبار، وسوف تكون هناك حاجة تقنيات تكميلية مثل EM لحل التفاصيل فائقة الهيكلية غرامة. وأخيرا، تصوير الخلايا الحية يتطلب بطبيعته تعريض الخلايا للضوء، ويحتمل أن تكون لفترة طويلة من الزمن. وهذا قد يغير من الاستجابات الفسيولوجية للخلية، وهي ظاهرة تعرف باسم صورة سمية. لقد استخدمت بنجاح التصوير الخلية الحية من البروتين PI3P ملزم DFCP1 لوصف للمرة الأولى التي تنشأ من autophagosomes الغنية PI3P مثل خاتم الهياكل omegasomes يطلق عليه، والتي هي في ارتباط وثيق مع فروع ER 10،11. لقد أظهرنا بوضوح أن هياكل إيجابية LC3 بدء تشكيل في ارتباط وثيق مع omegasomes. نقترح هنا أن توظيف خط خلية معربا عن GFP ثابت-DFCP1 للخلية الحيةالتصوير من البروتين من الفائدة، ويضع الإطار المكاني والزماني قوي لتوصيف دورها في تشكيل جسيم بلعمي ذاتي.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OptiMEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MitoTracker Red FM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M22425</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-7528</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>22 mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0159</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Fisher NUNC</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>RS Components Ltd. </td>
			<td>RS 494-124</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>O-rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-7816</td>
			<td>Suggested alternative to custom-made O-rings</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 100XO</td>
			<td>N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-R2 C10600 10B</td>
			<td>Progressive scan interline CCD</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>TILL Photonics</td>
			<td>Polychrome V</td>
			<td>Ultrafast monochromator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubation chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>Cell^R IX81</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SIS xcellence</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond

الالتهام الذاتي هو استجابة الخلوية الناجمة عن نقص المواد الغذائية، وخاصة لعدم وجود الأحماض الأمينية. يتم تعريف الالتهام الذاتي من قبل تشكيل هياكل غشاء مزدوج، ودعا autophagosomes، أن تنحية السيتوبلازم والبروتينات طويلة الأمد والمجاميع البروتين، العضيات معيب، وحتى الفيروسات أو البكتيريا. Autophagosomes تلتحم في نهاية المطاف مع الجسيمات الحالة مما يؤدي إلى تدهور الجزء الأكبر من محتواها، مع المواد الغذائية المنتجة التي يجري إعادة تدويرها مرة أخرى إلى السيتوبلازم. ولذلك، الالتهام الذاتي هو أمر حاسم لتوازن الخلية، والتقلبات من الالتهام الذاتي يمكن أن يؤدي إلى المرض، وأبرزها تنكس عصبي والشيخوخة والسرطان. تشكيل جسيم بلعمي ذاتي هو عملية معقدة جدا، لالخلايا التي خصصت مجموعة معينة من البروتينات، ودعا الآلية الأساسية الالتهام الذاتي. الآلية الأساسية الالتهام الذاتي ويكمل وظيفيا من البروتينات إضافية تشارك في العمليات الخلوية المتنوعة، على سبيل المثال في MEMBRANالاتجار ه، في علم الأحياء الميتوكوندريا والليزوزومية. التنسيق بين هذه البروتينات لتشكيل وتدهور autophagosomes يشكل استجابة ديناميكية للغاية ومتطورة من الالتهام الذاتي. تصوير الخلايا الحية يسمح احد لمتابعة مساهمة الجزيئي للبروتين كل المتصلة الالتهام الذاتي وصولا الى مستوى حدثا تشكيل جسيم بلعمي ذاتي واحد وفي الوقت الحقيقي، وبالتالي هذه التقنية توفر دقة الزمانية والمكانية العالية. هنا نستخدم خط خلية معربا عن GFP-DFCP1 ثابت، لتأسيس السياق المكاني والزماني لتحليلنا. DFCP1 علامات omegasomes، التي هي هياكل السلائف تؤدي إلى تشكيل autophagosomes. يمكن أن تكون علامة A البروتين من الفائدة (POI) مع إما أحمر أو أزرق سماوي علامة فلوري. العضيات المختلفة، مثل ER، الميتوكوندريا والجسيمات الحالة، وتشارك في جميع الخطوات المختلفة من تشكيل جسيم بلعمي ذاتي، ويمكن أن تكون علامة باستخدام صبغة تعقب محددة. الوقت الفاصل بين المجهري من AUTOPهاجي في هذه المجموعة التجريبية أعلى، يسمح للمعلومات ليكون استخراجه عن البعد الرابع، أي وقت. ومن هنا يمكننا أن اتباع مساهمة POI إلى الالتهام الذاتي في المكان والزمان.

في وصف البروتوكول، ونحن قد استخدمت الوقت الفاصل بين المجهري لمتابعة توطين CFP الموسومة LC3 في خط خلية معربا عن ستابلي GFP الموسومة DFCP1، في ظل ظروف حمل الالتهام الذاتي. نتائج هذه التجربة هو القبض على 2 سلسلة أو رزمة من الصور، واحدة من الأخضر واحد من القناة الزرقاء، الموافق G...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond at JoVE.com

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

الوقت الفاصل بين المجهري من علامات الالتهام الذاتي fluorescently المسمى يسمح رصد استجابة الالتهام الذاتي ديناميكية مع القرار الزماني عالية. باستخدام الالتهام الذاتي محددة وعلامات عضية في مزيج من 3 ألوان مختلفة، ونحن يمكن أن يتبع مساهمة بروتين لتشكيل جسيم بلعمي ذاتي في سياق المكاني والزماني قوية.

يعيش التصوير خلية من الأحداث الالتهام الذاتي المبكر: Omegasomes وما بعدها

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

live-cell-imaging-of-early-autophagy-events-omegasomes-and-beyond

Research

JoVE Journal

Biology

18.4K Views.  The Babraham Institute. الوقت الفاصل بين المجهري من علامات الالتهام الذاتي fluorescently المسمى يسمح رصد استجابة الالتهام الذاتي ديناميكية مع القرار الزماني عالية. باستخدام الالتهام الذاتي محددة وعلامات عضية في مزيج من 3 ألوان مختلفة، ونحن يمكن أن يتبع مساهمة بروتين لتشكيل جسيم بلعمي ذاتي ?...

Video: Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

الحنق المجهر لمراقبة الوقت الحقيقي من أحداث في اشارة الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D التصوير التجميع البروتين في الخلايا الحية

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Autophagy activation is beneficial in the prevention of a number of diseases. One of the physiological approaches to induce autophagy in vivo is physical exercise. Here we show how to activate autophagy by aerobic exercise and measure autophagy levels in mice.

تفعيل الالتهام الذاتي من قبل بممارسة الهوائية في الفئران

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

توصيف تكلس الأحداث عن طريق لايف البصرية والمجهر الإلكتروني تقنيات في Tubeworm البحرية

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the formation of thrombi that occlude the vasculature and injure organs, with life-threatening consequences. This motivates scientific research on platelet function and the development of methods to track cell-biological processes as they occur under flow conditions.
A variety of flow models are available for the study of platelet adhesion and aggregation, two key phenomena in platelet biology. This work describes a method to study real-time platelet degranulation under flow during activation. The method makes use of a flow chamber coupled to a syringe-pump setup that is placed under a wide-field, inverted, LED-based fluorescence microscope. The setup described here allows for the simultaneous excitation of multiple fluorophores that are delivered by fluorescently labeled antibodies or fluorescent dyes. After live-cell imaging experiments, the cover glasses can be further processed and analyzed using static microscopy (i.e., confocal microscopy or scanning electron microscopy).

This work describes a fluorescence microscopy-based method for the study of platelet adhesion, spreading, and secretion under flow. This versatile platform enables the investigation of platelet function for mechanistic research on thrombosis and hemostasis.

تصوير الخلايا الحية من تحبيب الصفائح الدموية والإفراز تحت التدفق

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

فائقة الدقة تصوير الخلايا الحية من الهياكل دون الخلوية

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment failure is mainly due to the invasiveness of GBM cells, which speaks for the need for a better understanding of GBM motile properties. To investigate the molecular mechanism supporting GBM invasion, new physiological models enabling in-depth characterization of protein dynamics during invasion are required. These observations would pave the way to the discovery of novel targets to block tumor infiltration and improve patient outcomes. This paper reports how an orthotopic xenograft of GBM cells in the zebrafish brain permits subcellular intravital live imaging. Focusing on microtubules (MTs), we describe a procedure for MT labeling in GBM cells, microinjecting GBM cells in the transparent brain of 3 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, intravital imaging of MTs in the disseminating xenografts, altering MT dynamics to assess their role during GBM invasion, and analyzing the acquired data.

We report a technique permitting live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma (GBM) cells invading a vertebrate brain tissue. Coupling the orthotopic injection of fluorescently tagged GBM cells into a transparent zebrafish brain with high-resolution intravital imaging allows the measurement of cytoskeleton dynamics during in situ cancer invasion.

التصوير الحي لديناميات الأنابيب الدقيقة في خلايا الورم الأرومي الدبقي التي تغزو دماغ الزرد

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...

القياس الكمي لإمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, various mitochondrial quality control mechanisms cooperate to maintain a healthy mitochondrial network. One such pathway is mitophagy, where PTEN-induced kinase 1 (PINK1) and Parkin phospho-ubiquitination of damaged mitochondria facilitate autophagosome sequestration and subsequent removal from the cell via lysosome fusion. Mitophagy is important for cellular homeostasis, and mutations in Parkin are linked to Parkinson's disease (PD). Due to these findings, there has been a significant emphasis on investigating mitochondrial damage and turnover to understand the molecular mechanisms and dynamics of mitochondrial quality control. Here, live-cell imaging was used to visualize the mitochondrial network of HeLa cells, to quantify the mitochondrial membrane potential and superoxide levels following treatment with carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), a mitochondrial uncoupling agent. In addition, a PD-linked mutation of Parkin (ParkinT240R) that inhibits Parkin-dependent mitophagy was expressed to determine how mutant expression impacts the mitochondrial network compared to cells expressing wild-type Parkin. The protocol outlined here describes a simple workflow using fluorescence-based approaches to quantify mitochondrial membrane potential and superoxide levels effectively.

تسليط الضوء على المؤلف: القياس الكمي القائم على التألق لإمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق باستخدام التصوير المباشر في خلايا هيلا  

This technique describes an effective workflow to visualize and quantitatively measure mitochondrial membrane potential and superoxide levels within HeLa cells using fluorescence-based live imaging.

القياس الكمي القائم على التألق لإمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق باستخدام التصوير المباشر في خلايا هيلا

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, ...