وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق منح لDMH وTDM (NHMRC منح المشاريع). DMH زميل Grimwade ، بتمويل من صندوق Miegunyah.

1. إعداد الخلايا لوصفها مع ReAsH / فلاش <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام معيار طرق زراعة الخلايا للخط الخلوي من الفائدة ، وتعد الثقافة من الخلايا الملتصقة مباشرة في شريحة التصوير الخلية الحية على استعداد لترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect الخاص البلازميد التي تحتوي على الجين TC - الموسومة الفائدة وفقا لطريقة ترنسفكأيشن التي تختارها. </li></ol> علما أنه من المهم استخدام الضوابط الإيجابية والسلبية لتقييم مدى ملزمة محددة لعلامات TC وتقييم لbleedthrough من مضان بين القنوات عند جمع micrographs مبائر. وبالتالي ، لونين (مثل فلاش / الكرز أو ReAsH / CFP أو تركيبات ReAsH / GFP) ، وضمان استعداد عينات للألوان واحد (مثل البروتين نيون وحدها أو إذا كان ذلك ممكنا بروتين TC - الموسومة منضمة إلى فلاش / ReAsH ولكن مع عدم وجود الفلورسنت البروتين) <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واحد إلى يومين بعد ترنسفكأيشن ، شطف الخلايا برفق مع 300 ميكرولتر استعد مسبقا (عند 37 درجة مئوية) HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج الخلايا برفق مع فلاش ميكرومتر 1 (أو ReAsH) في 300 ميليلتر من HBSS prewarmed و 10 ميكرومتر 1،2 - ethanedithiol (بتوقيت شرق الولايات المتحدة). </li></ol> فمن المهم أن نضيف بتوقيت شرق الولايات المتحدة لأول مرة أمام مضيفا فلاش / ReAsH وجعل العازلة فقط قبل إضافته إلى الخلايا. احتضان لمدة 30 دقيقة بالضبط في 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة. في أوقات أطول تجربتنا الحضانة إلى زيادة كبيرة في مضان الخلفية. وينبغي أيضا أن يكون الأمثل بنيات جديدة لوصفها الوقت وفلاش / تركيز ReAsH (0،5-2 ميكرومتر). <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بلطف الوسم حل من الخلايا ومن ثم استبدال HBSS prewarmed 300 + 250 ميكرومتر ميكرولتر 2،3 - dimercaptopropanol (BAL) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة غسل حل عن طريق التطلع لطيف واستبدالها مع HBSS 300 prewarmed ميكرولتر. </li></ol> بعد ذلك يغسل ، قد تكون ثابتة في الخلايا مع بارافورمالدهيد (15 دقيقة بمحلول 3.2 ٪) ، على الرغم من أننا وجدنا أن هذه الزيادات غير محددة صبغ مضان biarsenical. وبالتالي فإننا عادة صورة الخلايا الحية في درجة حرارة الغرفة. (لاحظ أن التثبيت من قبل الخلايا يمنع وضع العلامات biarsenical صبغة ملزمة.) 2. تصوير الخلايا على المجهر مبائر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على المجهر مبائر ، إعداد المعلمات للتصوير fluorophores الفردية (أنظر الجدول 1) والتأكد من أن هناك bleedthrough ضئيلة بين القنوات. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق فحص fluorophores الفردية (في عينات مراقبة) ضد كل إعداد اقتناء الفلورسنت مختلفة لمضان. ويمكن تعديل نطاق الطول الموجي يساعد على تقليل الانبعاثات bleedthrough (رغم أن هذا يمكن أن تقلل أيضا الإشارة / الضجيج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أيضا ضبط إعدادات مضخم بحيث مضان الأقصى في العينة لا تشبع كاشف. (ويمكن الكشف عن هذا باستخدام الإعداد Q - طرفية على مبائر ايكا SP2). مرة واحدة يتم تحديد أفضل إعدادات التصوير ، لا تغير أي منها بين العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإعدادات الأخرى التي نستخدمها عادة (رغم أنه يمكن تحسين هذه) هي فحص معدل 200 هرتز ، وجمع المعدلات خط قطره 4 و 1 وحدة من الثقب إيري. ويمكن توسيع نطاق القطر الثقب إذا الإشارة / الضجيج هو المشكلة ، ولكن هذا قد يؤدي إلى فقدان بعض من التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الصور في شكل مبائر (أو أعلى) 12 بت إذا كان ذلك ممكنا. 12 بت تنسيق يلتقط أكبر مجموعة ديناميكية من القيم (0-4095) لكل بكسل كثافة من 8 بت (0-255). وهذا أمر مهم لضمان أن يتم تسجيل مجموعة أغنى البيانات ، الأمر الذي سيزيد من نوعية تحليل البيانات الكمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الصور للقناة بروتين فلوري (الكرز ، أو GFP CFP) ، وكذلك للقناة صبغ biarsenical (فلاش أو ReAsH) لجميع العينات. </li></ol> 3. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ImageJ تثبيت البرنامج على جهاز الكمبيوتر الخاص بك 8. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن إصدار ImageJ والإضافات التالية : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html</a> </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح ImageJ ، وإذا به نسخة أقدم من v1.32c ، انقر على الخيارات التالية للتمكن من فتح عدة صور في وقت واحد (والتي يمكن القيام به بواسطة الضغط باستمرار على زر التحكم في حين النقر على ملفات مختلفة) : <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step1.jpg" alt="الشكل 1" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الصور من الاهتمام في ImageJ. وسوف تحدد تلقائيا ImageJ شدة بكسل الحد الأقصى والحد الأدنى التي يتم عرضها على الشاشة لكل صورة على حدة. نظرا إلى أن صور مختلفة سيكون دكثافة بكسل ifferent ، وهذا يعني أن الصور المعروضة لا يمكن مقارنتها كما تراه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضمان فتح الصور كلها على نفس النطاق ، يمكنك تحديد فعليا العلوي والسفلي شدة بكسل ليتم عرضه (وهذا لن يتم تغيير محتوى البيانات الفعلية من الصور كما هو الحال في بعض البرامج الأخرى). يمكن تعيين هذه القيم ضمن القائمة التالية : <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step2.jpg" alt="الشكل 2" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نهج بديل يتمثل في العمل مع المداخن ، الأمر الذي يضع جميع الصور معا في ملف واحد ، وسوف النطاق تلقائيا (للعرض) جميع الصور في المكدس لنفس النطاق. أسهل طريقة للعمل مع البيانات لتحويل كل قناة إلى كومة. وبالتالي ، للقناة بروتين فلوري لتحويل جميع المكدس كما هو مبين. يمكنك بسهولة تحديد قناة واحدة عن طريق تكديس كل الصور التي تحتوي على الاسم الشائع (مثل &quot;ch00&quot;) في العنوان. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step3.jpg" alt="الشكل 3" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن تحويل جميع الصور مفتوحة ل8 بت لتحليلها. وهذا في الواقع إعادة مقياس مدى ينظر الى النطاق 0-255 (الذي يحدد 8 بت). هام : لا تحفظ على مدى 12 بت الأصلي (أو أعلى) أو تنسيق ستفقد محتوى المعلومات. علما أن بعض حزم البرمجيات يمكن عرض فقط 8 بت صور حتى هذا الشكل هو مفيد لجعل الأرقام الخ <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step4.jpg" alt="الشكل 4" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ نسخة في مجلد جديد يسمى &quot;8 بت تحويل&quot; باستخدام &quot;حفظ ك...&quot; الخيار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أسلوب واحد للنظر في مدى الربط صبغ biarsenical في صورة كله لإجراء ارتباط شدة بكسل المؤامرة. هذه المؤامرات قيمة كل بكسل في قناة واحدة بالنسبة لقيمة بكسل المناظرة في قناة الثانية. وبالتالي فإن موقف بكسل عالية في مضان CFP أيضا أن تكون عالية في مضان ReAsH إذا كان هناك ارتفاع ملزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بكسل لتحليل الترابط المشترك ، تأكد من ReAsH 8 بت والصور أزرق / GFP مفتوحة في ImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح &quot;خاسسرح صورة&quot; المساعد على النحو المبين أدناه. حدد &quot;Image1&quot; كما المكدس ReAsH أو فلاش و &quot;Image2&quot; كما المكدس بروتين فلوري. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step5.jpg" alt="الشكل 5" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد يؤدي مكدس لا يتم عرض أية معلومات مفصلة -- وهذا أمر طبيعي. حفظ مكدس في مجلد جديد يسمى &quot;Scatterplots&quot; واعطائها نفس اسم الملف كما أنه يشير إلى نموذج (على سبيل المثال &quot;مؤامرة ارتباط فلاش الكرز&quot;) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعرض البيانات ذات معنى يمكن أن تفعل واحد من خيارين. تحويل البيانات أولا بحيث يكون في شكل السجل. ثم إعادة مقياس البصر البيانات على النحو التالي : <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step6.jpg" alt="الشكل 6" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك ، يمكنك إعادة مقياس البيانات بصريا فقط لاظهار القيم المنخفضة (على سبيل المثال 1-255) ، وعرض البيانات باستخدام طرفية خاصة. أحد طرفية (بحث لأعلى الجدول) يمثل الجدول من الألوان التي تم تعيينها إلى كل قيمة بكسل في صورة يمكن ، يمكن استخدام هذا النظام لتحديد pseudocolor للصورة ومفيد لتحديد خصائص معينة في صورة ما. لإنشاء فوق طرفية مخصصة على &quot;تحرير طرفية&quot; ، وجعل واحدة جديدة مثل تلك التي تظهر (ويمكن حفظ هذه واستخدامها في وقت لاحق). <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step7.jpg" alt="الشكل 7" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين نطاق السطوع / النقيض من 0-255 (كما هو موضح في الخطوة 13 أعلاه). الى &quot;تأمين&quot; صورة من أجل أن تظهر على الشاشة ، ويمكن تحويل الصورة إلى تنسيق RGB الذي يحفظ قيمة 8 بت لكل لون الأحمر والأخضر والأزرق في كل بكسل. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step8.jpg" alt="الشكل 8" /> لنسخ ولصق الصور إلى برامج أخرى مفتوحة لأول مرة صور 8 بت أو 16 بت. كما هو موضح في الخطوة 14 أعلاه ، تعيين نظام الألوان طرفية للصورة. لCFP ، تعيين &quot;سماوي&quot; طرفية على النحو المبين أدناه... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step9.jpg" alt="الشكل 9" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الصورة ونسخه إلى الحافظة حدد... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step10.jpg" /></li></ol> 4. ممثل النتائج : نجاح الخلايا الوسم مع الأصباغ biarsenical يعتمد على معايير رئيسية قليلة. أولا ، توقيت وضع العلامات مع الأصباغ أمر بالغ الأهمية. لقد وجدنا أن تمديد فترات وضع العلامات (أكثر من 30 دقيقة) عن نتائج في مستوى عال من تلوين الخلفية غير محددة. الشكل 1 يبين نتيجة نموذجية لنموذج من النوع البري من جزء huntingtin (25Q) لتنصهر أزرق مشتق CFP تحتوي على علامة TC 7 كما هو موضح سابقا. وكان هذا النموذج الملون لمدة 30 دقيقة مع ReAsH وهناك الحد الأدنى من الخلفية في العينة التي تفتقر إلى سمة TC. لقد وجدنا أن الخلايا مع تحديد الخلفية إلى زيادة بارافورمالدهيد حين تحديد الميثانول مع ناسخ لمضان العلامة بروتين فلوري. وبالتالي أمكن لنا صورة الخلايا الحية. من المهم أن نلاحظ أيضا أن التثبيت قبللوضع العلامات مع الأصباغ biarsenical يمنع تجليدها ، ويفترض أن يعود إلى إدخال تعديلات على عزر TC. آخر عاملا حاسما لنتائج متسقة وكثافة الخلايا. لقد وجدنا أنه من الأهمية بمكان لخلايا صورة التي يتم توزيعها بشكل فضفاض ، وأيضا أن التثاقل واسعة يمكن أن تؤدي إلى تلطيخ متفاوتة من الأصباغ biarsenical في خلايا مختلفة. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. Tetracysteine ​​به وتلطيخ ReAsH في الخلايا الحية مع transfected huntingtin (exon1 - 25Q) - أزرق اندماج. وتقع العلامة TC عند تقاطع للانصهار huntingtin - أزرق (كما هو موضح في 7). العلاقة كثافة بكسل مؤامرة يمكن تقييم الاختلافات في ReAsH ملزم في جميع أنحاء الخلية ، ويمكن استخدامها لرسم خريطة التغييرات في ReAsH ملزمة بتكوين جزئي نتيجة لتغير أو تفاعلات يجند.

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells.">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-2672 (1998).</li><li>Uttamapinant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorophore+ligase+for+site-specific+protein+labeling+inside+living+cells.">A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).</li><li>Ignatova, Z., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+protein+stability+and+aggregation+in+vivo+by+real-time+fluorescent+labeling.">Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).</li><li>Coleman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+detection+of+prion+protein+with+biarsenical+labeling+and+FlAsH+fluorescence.">Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).</li><li>Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+polypeptide+and+protein+domain+conformation+and+association+with+FlASH+and+ReAsH.">Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).</li><li>Ramdzan, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+sensors+that+distinguish+monomeric+proteins+from+oligomers+in+live+cells.">Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells.</a> Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).</li><li>Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Hearps, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biarsenical+dye+Lumio+exhibits+a+reduced+ability+to+specifically+detect+tetracysteine-containing+proteins+within+live+cells.">The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells.</a> J. Fluor. 17, 593-597 (2007).</li><li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نهج التعريب البروتين التسمية مع بروتين فلوري وخصائص متعلق بتكوين مع صبغة second تقدم إمكانات كبيرة لرسم الخرائط حيث التشكل مختلفة من بروتينات تتراكم في الخلايا والأحداث التي تغير ديناميات التشكل البروتين. وقد استخدم لأول مرة ReAsH / فلاش وجهاز استشعار في الخلية للطي البر...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم الكاشف </th><th> شركة </th><th> رقم كتالوج </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> 8 - جيدا μ - الشرائح </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td> نجد هذه الشرائح الغرفة لتكون مفيدة بشكل خاص لزراعة الخلايا للتصوير. </td></tr><tr><td> TC - FLASH الثاني في الخلية Tetracysteine ​​كشف العلامات كيت * * * مضان أخضر للخلية الحية التصوير </td><td> Invitrogen </td><td> T34561 (فلاش) أو T34562 (ReAsH) </td><td></td></tr><tr><td> هانكس &quot;محلول الملح المتوازن </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-103 </td><td></td></tr><tr><td> 2،3 - Dimercapto - 1 - بروبانول </td><td> سيغما الدريخ </td><td> D1129 - 5ML </td><td></td></tr><tr><td> 1،2 - Ethanedithiol </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 02390 - 25ML </td><td></td></tr></tbody></table>

reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells

البروتينات الفلورية والأصباغ وأدوات أساسية لدراسة توطين البروتين والاتجار بها وظيفة في الخلايا. في حين تم البروتينات الفلورية مثل البروتين مضان أخضر (GFP) المستخدمة على نطاق واسع باعتبارهم شركاء الانصهار للبروتينات لتتبع خصائص بروتين المصالح 1 ، والتطورات الأخيرة مع أصغر به تمكين وظائف جديدة من البروتينات التي يتعين بحثها في الخلايا مثل تغيير متعلق بتكوين والبروتين وتكوين الجمعيات 2 ، 3. نظام واحد ينطوي على سمة صغيرة عزر tetracysteine ​​(CCXXCC) إدراج وراثيا في البروتين المستهدف ، والذي يربط biarsenical الأصباغ ، ReAsH (أحمر فلوري) وفلاش (الفلورية الخضراء) ، مع خصوصية عالية حتى في الخلايا الحية 2. نظام صبغ TC / biarsenical عروض قيود أقل بكثير الفراغية للبروتين المضيف من البروتينات الفلورية التي مكنت عدة مقاربات جديدة لقياس التغيير متعلق بتكوين والبروتين البروتين التفاعلات 4-7. نحن وضعت مؤخرا تطبيق الرواية من العلامات TC وأجهزة الاستشعار من oligomerization في الخلايا معربا عن huntingtin متحولة ، والتي عندما تحولت المجاميع في الخلايا العصبية في مرض هنتنغتون 7. وكان الموسومة Huntingtin مع اثنين من الأصباغ الفلورية ، واحدة بروتين فلوري لتتبع مكان البروتين ، والثاني علامة TC الوحيد الذي يربط الأصباغ biarsenical في مونومرات. وبالتالي ، تمكين تغييرات في colocalization بين البروتين والتفاعل صبغ biarsenical قليل وحدات غير مرئي بالمجهر المحتوى ليتم تعيينها مكانيا داخل الخلايا. هنا ، نحن تصف كيفية تسمية TC - الموسومة بروتينات تنصهر لبروتين فلوري (الكرز ، أو GFP CFP) مع فلاش أو ReAsH في خلايا الثدييات الحية وكيفية قياس مضان اللون اثنين (الكرز / فلاش ، CFP / فلاش أو GFP / تركيبات ReAsH).

Watch this Scientific Journal Video about ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells at JoVE.com

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

والأصباغ biarsenical الفلاش وReAsH خصيصا لربط الزخارف tetracysteine ​​في البروتينات ، ويمكن تسمية انتقائي البروتينات في الخلايا الحية. مؤخرا تم استخدام هذه الاستراتيجية لتطوير أجهزة الاستشعار التوسيم لبروتين مختلفة التشكل أو الدول oligomeric. وصفنا نهج وضع العلامات وطرق لتحليل كمي ملزمة.

ReAsH / فلاش الوسم وتحليل صورة البروتينات في خلايا الاستشعار Tetracysteine

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

reashflash-labeling-image-analysis-tetracysteine-sensor-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K Views.  Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute. والأصباغ biarsenical الفلاش وReAsH خصيصا لربط الزخارف tetracysteine ​​في البروتينات ، ويمكن تسمية انتقائي البروتينات في الخلايا الحية. مؤخرا تم استخدام هذه الاستراتيجية لتطوير أجهزة الاستشعار التوسيم لبروتين مختلفة التشكل أو الدول oligomeric. وصفنا نهج وضع العلامات وطرق لتحلي?...

Video: ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

الروبوتات والتحليل الديناميكي صورة للدراسات في التعبير الجيني في أنسجة النبات

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

دراسة ديناميكية بتكوين جزئي للبروتينات الغشاء في الموقع مع الموقع الموجه وصفها الإسفار

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

المظهري التحليل وعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم الفئران والأسلاف النسب، الملتزم

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

التحليل الآلي من ديناميك كا<sup&gt; 2 +</sup&gt; إشارات في تسلسلات الصور

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

وصفها تسلسل معين من الأحماض النووية والبروتينات مع ميثيل والعامل المساعد النظائر

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

البروتينات التحليل المناعي من الداخلية والخارجية السنترومير-الحيز الحركي

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

فحوصات لتدهور تتجمع البروتينات في الخلايا

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are highly efficient at virus transmission plays a key role in virus epidemics in fields. Studying virus-insect vector interactions can advance our understanding of virus transmission and epidemics with the aim of designing novel strategies to control plant viruses and their vector insects. Immunofluorescence labeling has been widely used to analyze interactions between pathogens and hosts and is used here in the white-backed planthopper (WBPH, Sogatella furcifera), which efficiently transmits the southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV, genus Fijivirus, family Reoviridae), to locate the virions and insect proteins in the midgut epithelial cells. Using laser scanning confocal microscopy, we studied the morphological characteristics of midgut epithelial cells, cellular localization of insect proteins, and the colocalization of virions and an insect protein. This protocol can be used to study virus activities in insects, functions of insect proteins, and interactions between virus and vector insect.

This protocol for immunofluorescent labeling of both plant virus proteins and vector insect proteins in excised insect guts can be used to study interactions among virus and vector insects, insect protein functions and molecular mechanisms underlying virus transmission.

وضع العلامات المناعية للفيروسات النباتية وبروتينات ناقلات الحشرات في الأمعاء النصفية

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...