המחברים רוצים להכיר ג&#39;ון Woolford על בסיס ראשוני של שיטה זו, TGK נתמך על ידי NIH GM057483 ו AI076245 ו PRC נתמך על ידי GM77073.

1. הכנת הדרגתיים סוכרוז 7-47% <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הדרגתיים סוכרוז יום אחד לפני השימוש כדי לאפשר הדרגתיים להיות רציפה. בצע סטרילי 7% ופתרונות סוכרוז 47% המכיל 50mm NH 4 Cl, 7.0-50mm טריס pH Acetate ו 12mm MgCl 2 ולאחסן ב 4 ° C 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך 6 הדרגתיים לערבב את 7% ו -47% מניות פתרונות סוכרוז לעשות 48 מ&quot;ל של כל אחד ריכוזי סוכרוז הבאה. הוסף DTT (1M המלאי) לפתרון כל סוכרוז לריכוז סופי של 1 מ&quot;מ. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> הריכוז הסופי </td><td> 7% סוכרוז </td><td> 47% סוכרוז </td></tr><tr><td> 7% </td><td> 48 מ&quot;ל </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 17% </td><td> 36 מ&quot;ל </td><td> 12 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 27% </td><td> 24 מ&quot;ל </td><td> 24 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 37% </td><td> 12 מ&quot;ל </td><td> 36 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 47% </td><td> 0 </td><td> 48 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לשפוך את הדרגתיים, לצרף פיפטה פסטר כדי מזרק 20 מ&quot;ל ידי הבטחת ואיטום עם Parafilm או להשתמש מחט ארוכה. הוסף 7 מ&quot;ל של סוכרוז 7% אל החלק התחתון של 1 x 3.5 צינור &quot;ultracentrifuge polyallomer. הבא להוסיף 7 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז 17% תחת הפתרון של 7% על ידי הנחת קצה פיפטה פסטר קרוב לתחתית של צינור pipetting לא יותר מהר מאשר 0.3 mL / sec. חזור עם 7 מ&quot;ל כל אחד 27%, 37% ו 47% סוכרוז פתרונות. אתה צריך לשמור קווים ברורים בין השכבות, המציין כי ערבוב מינימלי התרחשה. Store הדרגתיים ב 4 ° C למשך הלילה יחד עם הרוטורים, בקבוקים צינורות אשר ישמשו לקצור דגימות. </li></ol> 2. הכנת תמצית שמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול 125 מ&quot;ל של התרבות השמרים כדי OD של 600 0.8-1.0. הוסף cycloheximide לתרבות לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ולהמשיך רועד ב 30 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, להכין מאגר תמוגה המכיל 80 מיקרוגרם / מ&quot;ל cycloheximide, 200 מיקרוגרם / מ&quot;ל הפרין, DEPC 0.2%, ו 10 mM טריס-HCl pH 7.5, 0.1M NaCl, 30mm MgCl 2. שמור הכל על קרח מנקודה זו ואילך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התרבות לתוך בקבוק 250 מ&quot;ל צנטריפוגות ולמלא עם קרח. צנטריפוגה XG ב 8000 (7,250 סל&quot;ד ב הרוטור SLA-1500) עבור 5 דקות ב 4 ° C. שטפו את הכדור פעם אחת עם 10 מ&quot;ל של חיץ קרים תמוגה ולהעביר צינורות פוליפרופילן 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה XG ב 5900 (~ 6000 סל&quot;ד הרוטור ב-SLA 600TC א) 3 דקות ב 4 ° C. Resuspend את הכדור בתוך 0.5 מ&quot;ל של העברת חיץ, תמוגה אל צינור 1.5mL ומוסיפים 0.5 מ&quot;ל של צונן, חומצה שטף חרוזי זכוכית אפוי. וורטקס התאים ארבע במרווחים 30 שניות, קירור הצינור על קרח למשך 30 שניות בין כל מרווח. הוסף 0.5 מ&quot;ל של חיץ תמוגה לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל. צנטריפוגה במהירות המרבית microcentrifuge (14,000 סל&quot;ד ב microcentrifuge Eppendorf 5417R) במשך 10 דקות ב 4 ° C. העברת supernatant על צינור חדש microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. הסר 10 μl לצינור נפרד כדי לקבוע את 260 / OD OD 280 יחס (ראה שלב 3.1 להלן). חנות תמציות ב -80 ° C. </li></ol> 3. הכנת תמצית בתאי יונקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תאים חסיד, לגדול צלחת 100 מ&quot;מ עד מפגש ~ 70%. אתה צריך אחד צלחת 100 מ&quot;מ לכל שיפוע מ&quot;ל 11 (תשואה הטיפוסי הוא ~ 20 OD 260 יחידות). סולם סכום ליניארי עבור גדלים שיפוע גדול או קטן. עבור לא חסיד תאים, כ 1 x 10 7 תאים יש צורך לכל צבע 11 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תמוגה, להוסיף cycloheximide עד 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. העברת צלחות קרח ולשטוף תאים פעמיים קרים PBS. כל צעדים בעתיד חייב להתבצע בבית 0-4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל עקבות של PBS על ידי שאיפה (שלא צלחות ניקוז על המיטה בזווית של קרח) ולהוסיף 1 מ&quot;ל תמוגה חיץ, לגרד ולהעביר צינור 1.5 מראש צונן מ&quot;ל. חיץ רכיבים תמוגה יהיה צריך להיות מותאם לסוג תא ותנאי הגידול. חיץ התחלה טובה תהיה 20 מ&quot;מ HEPES-KOH, pH 7.4, 15 מ&quot;מ MgCl 2, 200 מ&quot;מ KCl, 1% טריטון X-100 (v / v), 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל cycloheximide, 2 מ&quot;מ DTT, ו 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל הפרין. המשתנים העיקריים הם הריכוזים של מגנזיום אשלגן כלורי וכן הכללת או הרחקה של דטרגנטים יוניים אי - כדי לשפר את מיצוי של polysomes מחויב cytoskeletal או קרום. Lyse תאים על ידי עובר דרך מחט מזרק 27 מד פעמיים או שבץ 5-10 של homogenization dounce באמצעות סוג B העלי. מזרק או homogenizer צריך להיות מקורר מראש לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין על XG 14,000 עבור 5 דקות בתוך microcentrifuge בקירור. העברת lysate טריים השיפוע סוכרוז (עבור בתאי יונקים זה מורכב במאגר תמוגה חסר טריטון X-100 ו - הפרין אבל חוץ מזה כמתואר 1.2 ו -1.3) או הקפאה בחנקן נוזלי פלאש לשימוש מאוחר יותר. </li></ol&gt; 4. צנטריפוגה של הדרגתיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי lysates polyribosome על הקרח. קבע את הריכוז של חומצות גרעין ב lysate על ידי הוספת המדגם 10 μL שמורות ל 1 מ&quot;ל מים לקרוא את 260 / OD OD 280 יחס עם ספקטרופוטומטר. תשואה אופיינית מתרבות שמרים גדל כמתואר היא 50 יחידות OD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה עם קצה להציב על הקיר של הצינור סמוך לפני השטח של השיפוע, בעדינות שכבה 25 OD 260 יחידות של lysate על גבי השיפוע. במשך 35 מ&quot;ל 500 μl שיפוע של lysate נטען בדרך כלל. חיץ תמוגה ניתן להשתמש כדי להבטיח את כל הדרגתיים נטענים עם נפח שווה. כמויות נמוכות של החומר להניב החלטה טובה יותר. בעזרת מלקחיים, בזהירות להוריד את הדרגתיים לסלים של הרוטור דלי מתנדנד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הדרגתיים ב XG 100,000 (23,000 סל&quot;ד ב רוטור Surespin 630) עבור 4 שעות ב 4 ° C. פרוטוקול זה יכול להיות מותאמים עבור הדרגתיים נפח קטן יותר. </li></ol> 5. אוסף של נתונים שברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 30 דקות לפני השלמת הסיבוב 4 שעות לצרף את המחט על מדקר צינור דגם 184. צרף את העט דגם Isco באינטרנט UA-5 ספיגת / Monitor פלואורסצנטי. כוח על ספיגת לפקח לאפשר בסיס יציב כדי להגיע לפני ניתוח דגימות. רכישת אלקטרונית של הפרופיל polysome יכול בקלות להיות מתקבל על ידי הצמדת DI-148U נתונים יחידה הרכישה (DATAQ מכשירים) כדי מקליט את התרשים. פרופילים אז יכול להיות בזמן אמת שנאספו ונשמרו במשך ביאור מאוחר יותר באמצעות תוכנת WinDaq הנלווים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את משאבת מזרק עם 50 מ&quot;ל של Fluorinert באמצעות זרימה הפוכה, הגדרה מהירה. ודא שאין בועות אוויר הנוכחי. חבר את הצינור מזרק כדי דוקרת את הצינור בקצרה להפעיל זרימת Fluorinert ב 3 מ&quot;ל / דקה לכיוון קדימה כדי לנקות את הצינור של כל בועות האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כוס פסולת או סדרה של צינורות אם איסוף שברים תחת הצינור בסוף התא זרימה לאסוף מדגם לברוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את צנטריפוגה polyallomer צינורות המכילים את שיפוע סוכרוז מן הרוטור צנטריפוגות ומניחים אותם על הקרח (טרום בצורת בארות הקרח עם שפופרת ריק, כדי למנוע הדרגתיים מטריד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח תמציות התא, במקום צינור מפל על מדקר את הצינורית. חבר את החלק העליון של הצינור לשקע ומאובטח. הרם את השלב התחתון הצינור צנטריפוגות כך המחט חודרת את החלק התחתון של הצינור. לאחר המחט יש שבלט דרך התחתון של הצינור צנטריפוגות, להתחיל את זרימת Fluorinert בכיוון קדימה 6mL/min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר Fluorinert החלה לזרום לתוך הצינור, לנטר את התנועה של המחט על צג ספיגת באינטרנט. פעם מחט מתחיל לנוע, להפעיל את תנועת תרשים להגדרה מהירות 60. הצג יתעד את OD 254 החל החומר ואחריו חינם לגילוי ה -40 למקטע ריבוזומלי והמשך דרך מתחמי polyribosome. אם אתה איסוף שברים של רנ&quot;א או ניתוח חלבון, בדרך כלל 0.2 שברים דקות נלקחים (1 מ&quot;ל). לניתוח RNA, שברים יש לאסוף ישירות לתוך צינורות המכיל Trizol (Invitrogen), פנול או SDS / proteinase K, בהתאם לשיטה המועדפת של מיצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר בסופו של הפרופיל polyribosome הושג, לכבות את זרימת Fluorinert אל הצינור צנטריפוגות ולעצור את התנועה תרשים של ספיגת / לפקח פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסגת Fluorinert מהצינור צנטריפוגות לתוך המזרק עד תחילת הזרימה בכיוון ההפוך בקצב מהיר לוודא שלא למשוך סוכרוז מהצינור לתוך המזרק. פרקו את הצינור מתוך צנטריפוגה דוקרת את הצינור, להנמיך את המחט, ולהסיר את הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5.5 עד 5.8 עבור כל שיפוע סוכרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל הדרגתיים סוכרוז כבר ניתחו, לסגת Fluorinert מצינור חזרה לתוך המזרק. הסר כל חלק fractionator (מקב הצינורית של התא זרימה) כולל צינור הפסולת הממוקם בראש ולשטוף היטב עם מים. </li></ol> 6. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/1948/1948fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. עקבות נציג של לחלץ הריבוזום שהוכן זן שמרים BY4741 (מחצלת his3 Δ Δ leu2 1 0 0 ura3 met15 Δ Δ 0) בנוכחות cycloheximide. תמצית ריבוזומלי היה לפרק ניצול שיפוע 7 סוכרוז 47% ונותחו באמצעות מזרק משאבה מתקן המחובר גלאי UV. פיקס המכיל polyribosomes וה -80, ה -60 וה -40 ריבוזומים מסומנים.

<ol>
	<li>Baim, S. B., Pietras, D. F., Eustice, D. C., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+allowing+an+mRNA+secondary+structure+diminishes+translation+of+Saccharomyces+cerevisiae+iso-1-cytochrome+C.">A mutation allowing an mRNA secondary structure diminishes translation of Saccharomyces cerevisiae iso-1-cytochrome C.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 1839-1846 (1985).</li><li>Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRS1+to+DRS7,+novel+genes+required+for+ribosome+assembly+and+function+in+Saccharomyces+cerevisiae.">DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Cell. Biol. 13, 7901-7912 (1993).</li><li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+(eEF)+1A+and+eEF3.">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> J Biol Chem. 278, 6985-6991 (2003).</li><li>Serikawa, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Proteomics. 2, 191-204 (2003).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li><li>Valasek, L., Szamecz, B., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+stabilization+of+preinitiation+complexes+by+formaldehyde+cross-linking.">In vivo stabilization of preinitiation complexes by formaldehyde cross-linking.</a> Methods Enzymol. 429, 163-183 (2007).</li><li>Fletcher, J. E., Copeland, P. R., Driscoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+distribution+of+phospholipid+hydroperoxide+glutathione+peroxidase+mRNA:+evidence+for+a+block+in+elongation+at+the+UGA/selenocysteine+codon.">Polysome distribution of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase mRNA: evidence for a block in elongation at the UGA/selenocysteine codon.</a> Rna. 6, 1573-1584 (2000).</li><li>Ruan, H. J., Brown, C. Y., Morris, D. R., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Analysis of mRNA formation and function. , 305-321 (1997).</li><li>Martin, G. W., Berry, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selenocysteine+codons+decrease+polysome+association+on+endogenous+selenoprotein+mRNAs.">Selenocysteine codons decrease polysome association on endogenous selenoprotein mRNAs.</a> Genes Cells. 6, 121-129 (2001).</li><li>Lee, Y. Y., Cevallos, R. C., Jan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+upstream+open+reading+frame+regulates+translation+of+GADD34+during+cellular+stresses+that+induce+eIF2alpha+phosphorylation.">An upstream open reading frame regulates translation of GADD34 during cellular stresses that induce eIF2alpha phosphorylation.</a> J Biol Chem. 284, 6661-6673 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

המידע המתקבל הפרופיל polyribosome יכול לספק תובנה חשובה למעמד translational של התא. בנוסף, מעמדם של הרכבה של יחידות משנה ריבוזומלי עצמם ניתן לקבוע 2. למשל נוכחות של halfmers או ה -80 ואת פסגות גדול עם כתף קלה ימינה על הפרופיל מציין -40 מחויב למקטע ממתין -60 למקטע להצטרף. ביצוע הניסוי בהעדר cycloheximide כל הוספה או מעכב אחרים של התארכות מאפשר ניתוח של שיעור לברוח, אשר מציין האם התארכות משתנה 3. שברים עצמם הם מקור עשיר של חומרים כימיים לקביעת הבאים של העמותה של mRNA חלבון מסוים או עם subpopulations ריבוזומלי ידי סופג צפון מערביות או שברים. הבריכה כוללת של mRNAs הקשורים הריבוזומים פעיל ניתן לקבוע באמצעות microarray קשור 4 או ניתוח רצפי עמוק 5. עמותות החלבון יכול להיות גם התייצב על ידי תוספת מתאימה של צלב קישור מגיב 6. ניתוח Polyribosome מ בתאי יונקים הוא גם ראוי להזכיר כפרוטוקול ברורה מבחינת הקשיים לכאורה להקים את התנאים הנדרשים כדי להשיג polysomes יציב. מערכות חיץ דיווח בספרות משתנה נרחב 70-10, ובכך ייתכן שיש דרישה אופטימיזציה התא סוג מסוים של למאגר תמוגה, או סביר באותה מידה כי מערכת חיץ אינו חשוב כמו תשומת לב נלהבת לעבוד עם lysates טריים כל הזמן בטמפרטורות נמוכות. למיטב ידיעתנו הערכה שיטתית של הפרמטרים המשפיעים על היווצרות polysome יונקים לא דווחה.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>polyallomer ultracentrifuge tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>326823</td>
<td>1 x 3.5 in. (25x89mm)</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorinert</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F9755</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cycloheximde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C-7698</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H3393</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BY4741</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Open Biosystems</td>
<td>YSC1048</td>
<td>Other strains work equally well</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

eukaryotic polyribosome profile analysis

סינתזת החלבון הוא תהליך מורכב הסלולר מוסדר ברמות שונות. לדוגמה, תרגום העולמי יכול להיות מעוכבת בשלב החניכה או את השלב התארכות על ידי מגוון של מדגיש הסלולר כגון רעב חומצת אמינו או גורם לנסיגה בצמיחה. לחלופין, התרגום של mRNAs הפרט יכול להיות מוסדר על ידי לוקליזציה mRNA או נוכחות של רנ&quot;א מאותו מקור. מחקרים של סינתזת חלבון לעתים קרובות לנצל ניתוח polyribosome לשפוך אור על מנגנוני ויסות התרגום או פגמים סינתזת החלבון. ב assay זה, ה-mRNA / הריבוזום מתחמי מבודדים התאים האיקריוטים. שיפוע צפיפות סוכרוז מפריד mRNAs חייב הריבוזומים מרובים המכונה polyribosomes מ mRNAs חייב הריבוזום monosome יחיד או. חלוקה של הדרגתיים מאפשר בידוד וכימות של אוכלוסיות שונות ריבוזומלי mRNAs הקשורים בהם או חלבונים. הבדלים ביחס של polyribosomes כדי monosomes בתנאים מוגדרים ניתן להצביע על פגמים בייזום או תרגום או התארכות / סיום. בחינת mRNAs נוכח שברים polyribosome יכולה לגלות אם המחזור של mRNAs בודדים מתורגמים שינויים עם תנאי הניסוי. בנוסף, הרכבה הריבוזום יכול להיות פיקוח על ידי ניתוח של פסגות קטנות וגדולות למקטע ריבוזומלי אשר מופרדים גם השיפוע. בסרטון הזה, אנו מציגים שיטה להכנת תמציות ריבוזומלי גולמי מתאי השמרים, הפרדת לחלץ את ידי שיפוע סוכרוז ופרשנות של התוצאות. הליך זה ניתנת להתאמה בקלות בתאי יונקים.

Watch this Scientific Journal Video about Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis at JoVE.com

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקת תרגום הריבוזומים של התאים האיקריוטים. לאחר שחולצו, ריבוזומים מופרדים monosomes ו polyribosomes על ידי חלוקה סוכרוז הדרגתי כדי לאפשר לאוכלוסיות שונות ריבוזומלי להיות מנותח. ככזה, שיטה זו היא תקן הזהב לבחינת הרגולציה של התרגום.

האיקריוטים פרופיל Polyribosome ניתוח

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Research

JoVE Journal

Biology

52.4K Views.  University of Medicine and Dentistry of New Jersey, Robert Wood Johnson Medical School. מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקת תרגום הריבוזומים של התאים האיקריוטים. לאחר שחולצו, ריבוזומים מופרדים monosomes ו polyribosomes על ידי חלוקה סוכרוז הדרגתי כדי לאפשר לאוכלוסיות שונות ריבוזומלי להיות מנותח. ככזה, שיטה זו היא תקן הזהב לבחינת הרגולציה של התרגום.

Video: Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

The ability to measure cellular metabolism and understand mitochondrial dysfunction, has enabled scientists worldwide to advance their research in understanding the role of mitochondrial function in obesity, diabetes, aging, cancer, cardiovascular function and safety toxicity.
Cellular metabolism is the process of substrate uptake, such as oxygen, glucose, fatty acids, and glutamine, and subsequent energy conversion through a series of enzymatically controlled oxidation and reduction reactions. These intracellular biochemical reactions result in the production of ATP, the release of heat and chemical byproducts, such as lactate and CO2 into the extracellular environment.
Valuable insight into the physiological state of cells, and the alteration of the state of those cells, can be gained through measuring the rate of oxygen consumed by the cells, an indicator of mitochondrial respiration - the Oxygen Consumption Rate - or OCR. Cells also generate ATP through glycolysis, i.e.: the conversion of glucose to lactate, independent of oxygen. In cultured wells, lactate is the primary source of protons. Measuring the lactic acid produced indirectly via protons released into the extracellular medium surrounding the cells, which causes acidification of the medium provides the Extra-Cellular Acidification Rate - or ECAR.
In this experiment, C2C12 myoblast cells are seeded at a given density in Seahorse cell culture plates. The basal oxygen consumption (OCR) and extracellular acidification (ECAR) rates are measured to establish baseline rates. The cells are then metabolically perturbed by three additions of different compounds (in succession) that shift the bioenergetic profile of the cell.
This assay is derived from a classic experiment to assess mitochondria and serves as a framework with which to build more complex experiments aimed at understanding both physiologic and pathophysiologic function of mitochondria and to predict the ability of cells to respond to stress and/or insults.

A description of a method for profiling mitochondrial function in cells is provided. The mitochondrial profile generated provides four parameters of mitochondrial function that can be measured in one experiment: basal respiration rate, ATP-linked respiration, proton leak, and reserve capacity.

פרופיל ניסוי Bioenergetic באמצעות C2C12 תאים Myoblast

The ability to measure cellular metabolism and understand mitochondrial dysfunction, has enabled scientists worldwide to advance their research in ...

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity necessary for proper cellular function. Understanding how the enzymes, proteins, and cytoskeletal components govern and maintain this biochemical segregation is therefore of paramount importance. The use of fluorescently tagged molecules to localize to and/or perturb subcellular compartments has yielded a wealth of knowledge and advanced our understanding of cellular regulation. Imaging techniques such as fluorescent and confocal microscopy make ascertaining the position of a fluorescently tagged small molecule relatively straightforward, however the resolution of very small structures is limited 1.
On the other hand, electron microscopy has revealed details of subcellular morphology at very high resolution, but its static nature makes it difficult to measure highly dynamic processes with precision 2,3. Thus, the combination of light microscopy with electron microscopy of the same sample, termed Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) 4,5, affords the dual advantages of ultrafast fluorescent imaging with the high-resolution of electron microscopy 6. This powerful technique has been implemented to study many aspects of cell biology 5,7. Since its inception, this procedure has increased our ability to distinguish subcellular architectures and morphologies at high resolution. 
Here, we present a streamlined method for performing rapid microinjection followed by CLEM (Fig. 1). The microinjection CLEM procedure can be used to introduce specific quantities of small molecules and/or proteins directly into the eukaryotic cell cytoplasm and study the effects from millimeter to multi-nanometer resolution (Fig. 2). The technique is based on microinjecting cells grown on laser etched glass gridded coverslips affixed to the bottom of live cell dishes and imaging with both confocal fluorescent and electron microscopy. Localization of the cell(s) of interest is facilitated by the grid pattern, which is easily transferred, along with the cells of interest, to the Epon resin used for immobilization of samples and sectioning prior to electron microscopy analysis (Fig. 3). Overlay of fluorescent and EM images allows the user to determine the subcellular localization as well as any morphological and/or ultrastructural changes induced by the microinjected molecule of interest (Fig. 4). This technique is amenable to time points ranging from &le;5 s up to several hours, depending on the nature of the microinjected sample.

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The CLEM technique has been adapted to analyze ultrastructural morphology of membranes, organelles, and subcellular structures affected by microinjected molecules. This method combines the powerful techniques of micromanipulation/microinjection, confocal fluorescent microscopy, and electron microscopy to allow millimeter to multi-nanometer resolution. This technique is amenable to a wide variety of applications.

אור גומל ומיקרוסקופי אלקטרונים (קלם) ככלי למדמיינים מולקולות Microinjected והיעדים האיקריוטים תת סלולריים


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a chemically stratified water column and unlike other inland bodies of water, largely prevents external input of carbon and nutrients from streams. Biota are exposed to numerous environmental stresses, including year-round severe nutrient deficiency, low temperatures, extreme shade, hypersalinity, and 24-hour darkness during the winter 1. These extreme environmental conditions limit the biota in Lake Bonney almost exclusively to microorganisms 2.
Single-celled microbial eukaryotes (called "protists") are important players in global biogeochemical cycling 3 and play important ecological roles in the cycling of carbon in the dry valley lakes, occupying both primary and tertiary roles in the aquatic food web. In the dry valley aquatic food web, protists that fix inorganic carbon (autotrophy) are the major producers of organic carbon for organotrophic organisms 4, 2. Phagotrophic or heterotrophic protists capable of ingesting bacteria and smaller protists act as the top predators in the food web 5. Last, an unknown proportion of the protist population is capable of combined mixotrophic metabolism 6, 7. Mixotrophy in protists involves the ability to combine photosynthetic capability with phagotrophic ingestion of prey microorganisms. This form of mixotrophy differs from mixotrophic metabolism in bacterial species, which generally involves uptake dissolved carbon molecules. There are currently very few protist isolates from permanently ice-capped polar lakes, and studies of protist diversity and ecology in this extreme environment have been limited 8, 4, 9, 10, 5. A better understanding of protist metabolic versatility in the simple dry valley lake food web will aid in the development of models for the role of protists in the global carbon cycle.
We employed an enrichment culture approach to isolate potentially phototrophic and mixotrophic protists from Lake Bonney. Sampling depths in the water column were chosen based on the location of primary production maxima and protist phylogenetic diversity 4, 11, as well as variability in major abiotic factors affecting protist trophic modes: shallow sampling depths are limited for major nutrients, while deeper sampling depths are limited by light availability. In addition, lake water samples were supplemented with multiple types of growth media to promote the growth of a variety of phototrophic organisms.
RubisCO catalyzes the rate limiting step in the Calvin Benson Bassham (CBB) cycle, the major pathway by which autotrophic organisms fix inorganic carbon and provide organic carbon for higher trophic levels in aquatic and terrestrial food webs 12. In this study, we applied a radioisotope assay modified for filtered samples 13 to monitor maximum carboxylase activity as a proxy for carbon fixation potential and metabolic versatility in the Lake Bonney enrichment cultures.

Microbial eukaryotes are both a source of photosynthetically-derived carbon and top predatory species in permanently ice-covered Antarctic lakes. This report describes an enrichment culture approach to isolate metabolically versatile microbial eukaryotes from the Antarctic lake, Lake Bonney, and assesses inorganic carbon fixation potential using a radioisotope assay for Ribulose-1,5-bisphophate carboxylase oxygenase (RubisCO) activity.

הקמת מיקרוביאלית תרבויות העשרה האיקריוטים מ שכבתית כימית אנטארקטיקה אגם והערכת פוטנציאל קיבוע פחמן

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

ניתוח פרופיל המטבולי של עוברי דג זברה

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and composed of mature enterocytes, goblet cells and enteroendocrine cells; and crypts, residing proximal to the submucosa and the muscularis, harboring adult stem and progenitor cells and mature Paneth cells, as well as stromal and immune cells of the crypt microenvironment. Until the last few years, in vitro studies of small intestine was limited to cell lines derived from either benign or malignant tumors, and did not represent the physiology of normal intestinal epithelia and the influence of the microenvironment in which they reside. Here, we demonstrate a method adapted from Sato et al. (2009) for culturing primary mouse intestinal crypt organoids derived from C57BL/6 mice. In addition, we present the use of crypt organoid cultures to assay the crypt metabolic profile in real time by measurement of basal oxygen consumption, glycolytic rate, ATP production and respiratory capacity. Organoids maintain properties defined by their source and retain aspects of their metabolic adaptation reflected by oxygen consumption and extracellular acidification rates. Real time metabolic studies in this crypt organoid culture system are a powerful tool to study crypt organoid energy metabolism, and how it can be modulated by nutritional and pharmacological factors.

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Small intestinal crypt organoids cultured ex vivo provide a tissue culture system that recapitulates growth of crypts dependent on stem cells and their niche. We established a method to assay the metabolic profile in real time in primary mouse crypt organoids. We found organoids maintain physiological properties defined by their source.

אמיתי ניתוח זמן של פרופיל המטבולי ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות עכבר המעיים קריפטה Organoid

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs contribute to genetic variation among somatic cells in multicellular organisms and to evolution of unicellular eukaryotes. Sensitive methods for detecting eccDNA are needed to clarify how these elements affect genome stability and how environmental and biological factors&#160;induce their formation in eukaryotic cells. This video presents a sensitive eccDNA-purification method called Circle-Seq. The method encompasses column purification of circular DNA, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification of eccDNA, deep sequencing, and mapping. Extensive exonuclease treatment&#160;was&#160;required for sufficient linear chromosomal DNA degradation. The rolling-circle amplification step by &#966;29 polymerase enriched for circular DNA over linear DNA. Validation of the Circle-Seq method on three S. cerevisiae CEN.PK populations of 1010 cells detected hundreds of eccDNA profiles in sizes larger than 1 kilobase. Repeated findings of ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30,&#160;HXT6, HXT7 genes on circular DNA in both S288c and CEN.PK suggests that DNA circularization is conserved between strains at these loci. In sum, the Circle-Seq method has broad applicability for genome-scale screening for eccDNA in eukaryotes as well as for detecting specific eccDNA types.

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

טיהור הגנום כולו של DNA המעגל extrachromosomal מתאי איקריוטיים

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

פרוטוקול המעבדה הגנטית ניתוחים תוכן הבטן של הימית Macroinvertebrates באמצעות קבוצה ספציפית rDNA תחל

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to cells, tissues, organelles, and even whole organisms. This protocol focuses on two chemical drying methods, hexamethyldisilazane (HMDS) and t-butyl alcohol (TBA), and their application to imaging of both prokaryotic and eukaryotic organisms using SEM. In this article, we describe how to fix, wash, dehydrate, dry, mount, sputter coat, and image three types of organisms: cyanobacteria (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., and an unknown sp.), two euglenoids from the genus Monomorphina (M. aenigmatica and M. pseudopyrum), and the fruit fly (Drosophila melanogaster). The purpose of this protocol is to describe a fast, inexpensive, and simple method to obtain detailed information about the structure, size, and surface characteristics of specimens that can be broadly applied to a large range of organisms for morphological assessment. Successful completion of this protocol will allow others to use SEM to visualize samples by applying these techniques to their system.

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

SEM analysis is an effective method to aid in species identification or phenotypic discrimination. This protocol describes the methods for examining specific morphological details of three representative types of organisms and would be broadly applicable to examining features of many organismal and tissue types.

הכנה של אורגניזמים Prokaryotic ו האיקריוטים באמצעות ייבוש כימיים עבור ניתוח מורפולוגי סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Image Rendering Techniques in Postmortem Computed Tomography: Evaluation of Biological Health and Profile in Stranded Cetaceans

With 6 years of experience in implementing virtopsy routinely into the Hong Kong cetacean stranding response program, standardized virtopsy procedures, postmortem computed tomography (PMCT) acquisition, postprocessing, and evaluation were successfully established. In this pioneer cetacean virtopsy stranding response program, PMCT was performed on 193 stranded cetaceans, providing postmortem findings to aid necropsy and shed light on the biological health and profile of the animals. This study aimed to assess 8 image rendering techniques in PMCT, including multiplanar reconstruction, curved planar reformation, maximum intensity projection, minimum intensity projection, direct volume rendering, segmentation, transfer function, and perspective volume rendering. Illustrated with practical examples, these techniques were able to identify most of the PM findings in stranded cetaceans and served as a tool to investigate their biological health and profile. This study could guide radiologists, clinicians and veterinarians through the often difficult and complicated realm of PMCT image rendering and reviewing.

The Hong Kong cetacean stranding response program has incorporated postmortem computed tomography, which provides valuable information on the biological health and profile of the deceased animals. This study describes 8 image rendering techniques that are essential for the identification and visualization of postmortem findings in stranded cetaceans, which will help clinicians, veterinarians and stranding response personnel worldwide to fully utilize the radiological modality.

טכניקות עיבוד תמונה בטומוגרפיה ממוחשבת לאחר המוות: הערכה של בריאות ביולוגית ופרופיל בCeceans תקועים

With 6 years of experience in implementing virtopsy routinely into the Hong Kong cetacean stranding response program, standardized virtopsy procedures, ...