نشكر الدكاترة. ستيف وتشانغ شياو نينغ جبل ل35S : معتمد GFP pGlowbug بناء والزمالة لأبحاث الدكتوراه Hokensen CH في مختبر Z. L&#39; ق من قبل مؤسسة العلوم الوطنية الأميركية (وIOB0616096 MCB0744752). معتمد جزئيا ZL من جامعة ميريلاند محطة التجربة الزراعية.

أولا إعداد البلازميد يجب أن الحمض النووي بلازميد تستخدم لقصف تكون ذات درجة نقاوة عالية وبتركيز 500ng/μl أو أكبر. BiFC لتشمل اثنين يبني البلازميد ، هناك حاجة 25 ميكروغرام لكل البلازميد. وبعبارة أخرى ، ينبغي أن تكون مختلطة نسبة 1:1 المولي من سنتين إلى البلازميدات تؤدي إلى 50 ميكروغرام DNA البلازميد الإجمالية لإعداد الخراطيش. أن تضع في اعتبارها أن إضافة مزيد من الحمض النووي من 50 ميكروغرام قد يسبب تجمع من جزيئات الذهب ويجب تجنبها. ينصح المتاحة تجاريا استخراج الحمض النووي البلازميد مجموعات لعزل السلطات الوطنية المعينة بلازميد. وينبغي أن تكون ناقلات البلازميد صغيرة الحجم نسبيا مثل pUC19. نحن المستنسخة SEU وLUH [كدنا] في SPYNE - pUC19 وpUC19 SPYCE ، على التوالي 3. ناقلات ثنائية لالأجرعية بوساطة تحول كبيرة جدا وغير مناسب للقصف. II. خرطوشة إعداد خرطوشة إعداد ينطوي على جزيئات الذهب طلاء مع DNA البلازميد وتحميلها في الأنابيب البلاستيكية التي يتم خفض لاحقا الى قطع نصف المدة بوصة ، والتي يمكن تحميلها في حاملي الجين خرطوشة بندقية. يوصف خرطوشة إعداد كبيرة في التفاصيل في مقالة منفصلة إن الرب (4) وبالتالي ليس وصفها هنا. للقصف من خلايا البصل ، نوصي خلط 50 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد مع 12.5 ملغ من جزيئات الذهب في التحضير ، والتي ينتج عن ما يصل الى 50 ميكروغرام في 1 خراطيش DNA/0.25 ملغم الذهب / خرطوشة. كل خرطوشة لطلقة واحدة. يمكن للجزيئات الذهب إما 0.6 أو 1.0 ميكرومتر ميكرومتر في القطر (القط # # 1652262 1652263 أو القط ؛ Biorad). نحن أيضا ننصح باستخدام 0.5 ملغ / مل حل PVP لإعداد خرطوشة. لBiFC ، والجمع بين السلطات الوطنية المعينة بلازميد two كل شريك التفاعل المفترضة في إعداد خرطوشة واحدة. بعد إعداد خرطوشة ، فمن المهم لاختبار خراطيش خراطيش رميا أدلى حديثا عند ضغط الهليوم بين 150-200 رطل في المربع الذي Parafilm ملفوفة حول طبق بيتري. وهذا الاختبار ما إذا كان يمكن الدفع للجزيئات الذهب بكفاءة من خراطيش ؛ سترى جزيئات الذهب خافت على Parafilm. هذا يعطيك فكرة عن المنطقة التي سوف تغطي كل طلقة. قد تلاحظ كميات مختلفة من جزيئات الذهب في صاروخية على Parafilm عند ضغوط مختلفة الهليوم (في نطاق 150-200 رطل). إذا لم يكن هناك اختلاف كبير ، واختيار لخفض ضغط القصف. III. إعداد البصل الأنسجة في يوم من اطلاق النار ، تقشر الجلد الخارجي من البصل الأصفر واسع. باستخدام شفرة حلاقة نظيفة وحادة ، وقطع 4-5 الطبقات العميقة مساحة مستطيلة من حوالي 2 سم 8 X. إخراج نسيج البصل مستطيلة ، تجاهل الخارجي طبقتين ، وقطع ما تبقى من طبقات البصل إلى قطع الطول حوالي 2X1.5. مكان مبلل قطع البصل في طبق بتري تحتوي على ورق الترشيح (ورقة Whatman 3MM مقطعة إلى دوائر) مع الماء المعقم. تغطية صحن بيتري وانهم مستعدون للذهاب. رابعا. قصف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل خراطيش في الجولة أصحاب خرطوشة أبيض. يجب أن يتم تحميل الخراطيش تحتوي على تركيبات مختلفة في البلازميد أصحاب خرطوشة مختلفة. يمكن لكل حامل خرطوشة تعقد ما يصل إلى 12 لمدة 12 خراطيش الطلقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج البطارية وبطانة برميل جديدة في غون جين هيليوس. تأكد من أن كلا من بطانة برميل والبندقية ومنها طوقية المرفقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا ، إدراج حامل خرطوشة فارغة في البندقية الجينات ، مع علامة # 12 على حامل خرطوشة تواجه أعلى من البندقية. تقدم حامل خرطوشة مرة أو مرتين للتأكد من إدخاله بشكل صحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق مدفع الدبابة إلى الهيليوم وضبط الضغط بين 150-200 رطل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ارتداء حماية الأذن وبندقية النار عدة مرات مع حامل خرطوشة فارغة لتنظيف الغرفة من البندقية ، والتأكد من أن ضغط مستقرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حامل خرطوشة فارغة وادخال وحامل خرطوشة تحميلها. دفع حامل خرطوشة بحيث يتم وضع خرطوشة تريد النار على القاع (6:00) من حامل خرطوشة. اطلاق النار على قطعة من البصل هنا يوفر شكلا من أشكال السيطرة السلبية لمضان الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان قطع البصل في وسط طبق بيتري an فارغة مع طبقة داخلية أكثر من البصل مواجهة. بقية بطانة البندقية الجين برميل في طبق بتري ونيران البندقية عن طريق الضغط باستمرار على زر الجانب بينما تضغط على الزناد. نقل قصفت البصل إلى طبق بتري تحتوي على ورقة رطبة تصفية 3MM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقدم إلى خرطوشة المقبل والبصل النار قطعة مختلفة. كرر هذه الخطوة حتى يتم اسقاط أربع إلى خمس قطع من البصل. يتم اطلاق النار على كل قطعة البصل مرة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير على حامل خرطوشة مختلفة محملة الخراطيش تحتوي على مزيج مختلف البلازميد البلازميد أو مختلفة. تذكر لتغيير بطانة برميلق جيدا لمنع التلوث. تبادل لاطلاق النار قطع البصل 4-5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد القصف ، وعودة جميع البصل إلى أطباق perti. تغطية أطباق بتري مع الأغطية. التفاف لهم Parafilm لمنع جفاف. احتضان قطع البصل في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 16-48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف إطلاق الغاز والضغط قبل فصل الجينات البندقية من خزان الهيليوم. فك بطانة للبرميل ، وإزالة حامل خرطوشة والخراطيش المستخدمة (أو غير مستخدمة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أصحاب تنظيف خرطوشة وبطانات برميل بحلول غمر لهم في كوب من الماء والصابون. ضع الدورق في حمام sonicator ويصوتن لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، وشطف لهم بالماء لإزالة جميع مخلفات الصابون. نقع في الايثانول 70 ٪ لمدة ساعة ثم تجفيفها على مناشف ورقية. </li></ol> خامسا المراقبة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفرخ بعد قطع البصل لقصف 16-20 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، ويمكن أن نلاحظ GFP أو مضان YFP باستخدام مجهر مضان مثل Observer.z1 محوري زايس المستخدمة في هذه الدراسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط مع نهايات مسطح ببطء قشر طبقة خلية واحدة قبالة البشرة الداخلية من البصل (الطبقة التي تواجه مباشرة البندقية أثناء القصف). ضع قشر على قطرة ماء على شريحة. إضافة ساترة ولكن يجب الحرص على الحد من الفقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت حقل مشرق من المجهر ، أولا التحقق من تدفق هيولي للتأكد من أن الخلايا على قيد الحياة. للقيام بذلك ، تعرض الشريحة لضوء ساطع الميدان لبضع دقائق لتسخين الأنسجة والبصل ثم ابحث عن البلاستيدات تتحرك. تدفق هيولي ليس من السهل دائما أن نرى ، لذلك لا يحصلون على تثبيط إذا كنت لا تستطيع رؤية أي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للكشف عن مضان ، واستخدام الإثارة والفلاتر المناسبة الكشف عن GFP أو YFP. من المهم أن تشمل الضوابط سلبية مثل قطع البصل النار مع البلازميد غير الفلورسنت. قد تظهر اشارات صفراء باهتة من خلايا الجرحى ، وفقاعات الهواء ، أو الحطام. من المهم أيضا لتشمل الضوابط الإيجابية. وتحتوي على البلازميد مراسل الفلورسنت أعرب constitutively مثل 35S : GFP هو عنصر تحكم ممتازة إيجابية. وأشار إشارات مرئية GFP من خلايا البشرة البصل (الشكل 1A ، D) والتي يتم إعدادها إعدادا سليما الخراطيش ، والأنسجة والبصل ، واطلاق مدفع الجينات وتنفيذها. بعد ذلك ، لاحظنا التفاعل بين SEU - pSPYNE وLUH pSPYCE في قطع البصل لوابل من خراطيش تحتوي على خليط من 35S : SEU - 35S وpSPYNE : LUH - pSPYCE السلطات الوطنية المعينة. ولوحظ خافت YFP مضان في نواة فقط (الشكل 1 B ، E) ، مما يدل على التفاعل المباشر بين المادية وSEU LUH التي جلبت شظايا YFP تقسيم معا في النواة. علما أن إشارة YFP من BiFC أضعف بكثير من إشارة GFP من 35S : GFP. </li></ol> ممثل النتائج وذكرت في دراستنا هنا ، 35S : GFP مراقبة إيجابية بلازميد يعطي قبالة مضان القوي الذي يملأ الخلية بأكملها ، بما في ذلك نواة كل والسيتوبلازم (الشكل 1A ، D). GFP بروتين صغير بما يكفي لنزع فتيل في نواة دون إشارة توطين النووية. في المقابل ، وSEU LUH عاملان الترانسكربتي Arabidopsis أظهرت في وقت سابق للتفاعل في الخميرة اثنين الهجين مقايسة 2. SEU - pSPYNE (SEU تنصهر لجزء من محطة N - YFP) وLUH - pSPYCE (SEU تنصهر لجزء من محطة N - YFP) ، وكلاهما كبير جدا لنشر في النواة ، وتحتوي على إشارات توطين 2،5 النووية. إشارة YFP الفلورسنت المكتشفة في البصل نواة الخلية (الشكل 1 B ، E) ، يشير إلى أن SEU pSPYNE وLUH pSPYCE ، يمكن أن تتفاعل في نوى البصل. يتم الكشف عن أي إشارة الفلورسنت في البصل قصفت مع مزيج من البلازميد pSPYNE ناقلات البلازميد التي تحتوي على جزء من المحطة N - YFP وLUH - pSPYCE (الشكل 1C ، F). ومضان YFP BiFC بوساطة أضعف بكثير من مضان GFP بوساطة من 35S : GFP البلازميد. في دراستنا ، فإنها أظهرت أيضا توطين التحت خلوية مختلفة (قارن مع الشكل 1A B). بالإضافة إلى ذلك ، فإن عدد الخلايا فلوري هو أقل من ذلك بكثير لBiFC ، كما BiFC يعمل فقط عند كل دخول شريك البلازميدات بنجاح ويتم التعبير عن البصل في الخلايا نفسها. <img src="/files/ftp_upload/1963/1963fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. قصفت نيون (A ، B ، C) والميدان مشرق (D ، E ، F) لوحات من الخلايا البصل مع البلازميد بنيات مختلفة. (أ) و (D) ، قصفت خلايا البصل مع 35S : GFP. GFP ينشر من خلال الخروج من السيتوبلازم والنواة. (ب) و (E) ، لوابل من خلايا البصل يمزج المولي على قدم المساواة 35S : SEU - pSPYNE (SEU تنصهر لجزء من محطة N - YFP) و35S : LUH - pSPYCE (LUH تنصهر لتفتيت محطة C - ) DNA البلازميد. ويظهر التفاعل بين SEU - pSPYNE وLUH pSPYCE تلو نواة الفلورسنت. (C) و (F) ، قصفت والسيطرة السلبية تظهر الخلايا مع البصل يمزج من ناقلات SPYNE - pUC19 وplasmi LUH - pSPYCEس. يتم الكشف عن أي إشارة الفلورسنت.

<ol>
	<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).</li><li>Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LEUNIG_HOMOLOG+and+LEUNIG+perform+partially+redundant+functions+during+Arabidopsis+embryo+and+floral+development.">LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development.</a> Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).</li><li>Walter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).</li><li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture.">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEUSS+and+AINTEGUMENTA+mediate+patterning+and+ovule+initiation+during+gynoecium+medial+domain+development.">SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development.</a> Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).</li><li>Zhang, X. N., Mount, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+alternatively+spliced+isoforms+of+the+Arabidopsis+SR45+protein+have+distinct+roles+during+normal+plant+development.">Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأول مرة للمستخدمين ، نوصي ممارسة الإجراء بأكمله ، من إعداد خرطوشة للمراقبة ، مع مراسل واحد التأسيسية البلازميد مثل 35S : GFP أو 35S : : المكتب المركزي للاحصاءات. استخدمنا 35S : GFP البلازميد تم الحصول عليها من الدكاترة. ستيف وجبل تشانغ شياو نينغ 6 (الشكل 1A ، D)...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Yellow onion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any supermarket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios Gene Gun</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss, Nikon, Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bimolecular fluorescence complementation (bifc) assay for protein-protein interaction in onion cells using the helios gene gun

التحقيق في وظائف الجينات في الكائنات المتنوعة تعتمد على معرفة كيف يمكن للمنتجات الجينات تتفاعل مع بعضها البعض في بيئتها الطبيعية الخلوية. والتكملة الإسفار ثنائي الجزيء (BiFC) الفحص<sup&gt; 1</sup&gt; يسمح للباحثين لتصور التفاعلات البروتين البروتين في الخلايا الحية ، وأصبح أداة بحث أساسية. ويستند هذا الاختبار على اثنين من الجمعيات سهلت شظايا من بروتين فلوري (GFP) التي تنصهر فيها كل شريك إلى التفاعل البروتين المحتملة. فإن التفاعل بين الشركاء البروتين two تسهيل رابطة N - C - محطة ومحطة جزء من GFP ، مما أدى إلى مضان. مصنع للباحثين ، وخلايا البشرة البصل نظام مثالي التجريبية لإجراء فحص BiFC بسبب سهولة في الحصول على أنسجة وإعداد البصل ورؤية مباشرة من التألق مع مضان الخلفية ضئيلة. ويشيع استخدام المسدس جين هيليوس (BioRad) لقصف DNA البلازميد الى خلايا البصل. نحن لشرح استخدام هيليوس غون جين لإدخال البلازميد يبني لمدة التفاعل<em&gt; thaliana Arabidopsis</emعوامل النسخ&gt; ، سوس (SEU) وHOMOLOG LEUNIG (LUH)<sup&gt; 2</sup&gt; التصور وتفاعلاتها بوساطة BiFC في خلايا البشرة البصل.

Watch this Scientific Journal Video about Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun at JoVE.com

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

هذه المقالة يوضح كيفية استخدام صحيح BioRad هيليوس غون جين لإدخال الحمض النووي في الخلايا البلازميد البصل البشرة وكيفية اختبار للبروتين تفاعلات البروتين في الخلايا البصل على أساس مبدأ التكملة الإسفار ثنائي الجزيء (BiFC)

ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC) الفحص عن البروتين البروتين في خلايا البصل التفاعل باستخدام مدفع الجينات هيليوس

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

bimolecular-fluorescence-complementation-bifc-assay-for-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

19.5K Views.  University of Maryland. هذه المقالة يوضح كيفية استخدام صحيح BioRad هيليوس غون جين لإدخال الحمض النووي في الخلايا البلازميد البصل البشرة وكيفية اختبار للبروتين تفاعلات البروتين في الخلايا البصل على أساس مبدأ التكملة الإسفار ثنائي الجزيء (BiFC)

Video: Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

مدفع الجينات ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية قرن آمون

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed protocol for biolistic transfection of rat hippocampal slices, from the initial preparation of DNA coated bullets to the final shooting of the organotypic slice cultures using a gene gun. Gene gun transfection is an efficient and easy means of transfecting neurons and is especially useful for fluorescently labeling a small subset of cells in tissue slice. In this video, we first outline the steps required to coat gold particles with DNA. We next demonstrate how to line the inside of plastic tubing with the gold/DNA bullets, and how to cut this tubing to obtain the plastic cartridges for loading into the gene gun. Finally, we perform biolistic transfection of rat hippocampal slice cultures, demonstrating handling of the Bio-Rad Helios gene gun, and offering trouble shooting advice to obtain healthy and optimally transfected tissue slices.  

We describe a method for preparing DNA coated gold bullets and demonstrate the use of such bullets to biolistically transfect neurons in cultured hippocampal slices.

إعداد نقطي غون جين وترنسفكأيشن Biolistic من الخلايا العصبية في الثقافة شريحة

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

الإسفار التكملة ثنائي الجزيء

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

الكشف عن تفاعلات البروتين في النبات باستخدام عبارة الإسفار ثنائي الجزيء المتوافقة التكملة (BiFC) نظام

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

تقارب المرحلة السائلة الفحص التقاطها باستخدام الخرز المغناطيسي لدراسة البروتين البروتين التفاعل: المثال فيروس شلل الأطفال، Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

باستخدام SecM تسلسل توقيف كأداة لعزل البروتينية منضم ريبوسوم

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

تدفق تحليل Cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء: عالية الإنتاجية الأسلوب الكمي لدراسة التفاعل البروتين البروتين

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

التحقيق البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

التصوير مضان مع نانومتر دقة واحدة (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...