אנו מודים בני הזוג. סטיב הר Xiaoning ז&#39;אנג עבור 35S:: GFP pGlowbug לבנות את האחווה Hokensen דוקטורט כדי CH מחקר במעבדה צ&#39;s L&#39;נתמכת על ידי המוסד האמריקני למדע (IOB0616096 ו MCB0744752). ZL נתמך בחלקו על ידי האוניברסיטה של ​​מרילנד תחנת ניסוי חקלאי.

I. הכנה פלסמיד ה-DNA פלסמיד המשמש הפגזה חייב להיות של טוהר גבוהה בריכוז של 500ng/μl או יותר. עבור BiFC הכולל שתי בונה פלסמיד, 25 מיקרוגרם של כל פלסמיד הוא זקוק. במילים אחרות, 1:01 יחס טוחנת של שני פלסמידים צריך להיות מעורב כדי להצמיח DNA 50 מיקרוגרם סך פלסמיד להכנת מחסניות. שימו לב כי הוספת ה-DNA יותר מ 50 מיקרוגרם עלול לגרום הצטברות של חלקיקי זהב יש להימנע. זמין מסחרית פלסמיד דנ&quot;א ערכות חילוץ מומלץ לבודד DNAs פלסמיד. וקטורי פלסמיד צריך להיות קטן יחסית בגודל כגון pUC19. אנו משובטים שאו ו LUH cDNA לתוך pUC19-SPYNE ו-pUC19 SPYCE, בהתאמה 3. וקטורים בינאריים לשינוי Agrobacterium בתיווך הם גדולים מדי ובלתי הולם עבור ההפצצה. השנייה. דיו הכנה הכנת דיו כרוך ציפוי זהב חלקיקים עם DNA פלסמיד והעמיסו אותם לתוך צינורות הפלסטיק נחתך לאחר מכן לתוך חצי חתיכות ארוכות אינץ&#39;, אשר ניתן להטעין את האקדח בעלי הגן מחסנית. הכנה מחסנית מתואר בפרטים גדול במאמר נפרד יופיטר 4 ועל כן לא המתוארת כאן. עבור הפגזה של תאים בצל, מומלץ לערבב 50 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד עם 12.5 מ&quot;ג של חלקיקי זהב בכל הכנות, אשר מניב כ - עד 50 מחסניות ב 1 מיקרוגרם DNA/0.25 מ&quot;ג זהב / מחסנית. מחסנית עבור כל ירייה אחת. חלקיקי זהב יכול להיות 0.6 מיקרומטר או 1.0 מיקרומטר קוטר (# חתול 1652262 או חתול # 1652263; Biorad). כמו כן, אנו ממליצים להשתמש 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​PVP פתרון להכנת מחסנית. עבור BiFC, לשלב בין שתי DNAs פלסמיד של כל אחד מבני הזוג אינטראקציה המשוערת בהכנת מחסנית אותו. לאחר הכנה מחסנית, חשוב לבחון את מחסניות באמצעות ירי מכלי עשה לאחרונה בלחץ הליום בין 150-200 psi Parafilm לתוך ריבוע כי הוא כרוך סביב בצלחת פטרי. זה יהיה המבחן אם חלקיקי זהב יכול להיות מונעת ביעילות מחסניות, אתה אמור לראות את חלקיקי זהב קלוש על Parafilm. זה נותן לך מושג בתחום כי כל ירייה יכסה. ניתן להבחין כמויות שונות של חלקיקי זהב מונעת על Parafilm בלחצים הליום שונים (בטווח 150-200 psi). אם אין הבדל משמעותי, לבחור את הלחץ נמוך יותר הפגזה. ג. בצל רקמות הכנת ביום הירי, לקלף את העור החיצונית של בצל צהוב גדול. באמצעות סכין גילוח נקי וחד, לחתוך 4-5 שכבות עמוקות שטח מלבני של כ - 2 X 8 ס&quot;מ. קח את רקמת בצל מלבני, לבטל את שתי השכבות החיצוניות, לחתוך את שכבות הבצל הנותר לתוך כ 2X1.5 ס&quot;מ חתיכות. מניחים את חתיכות הבצל בצלחת פטרי המכילות נייר פילטר (נייר Whatman 3mm וחותכים עיגולים) טבולה במים סטריליים. מכסים את צלחת פטרי והם מוכנים ללכת. IV. הפצצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המחסניות לתוך מחזיקי לבן מיכל עגול. מחסניות בונה פלסמיד המכיל שונים יש לטעון לתוך מחזיקי מחסנית שונים. כל בעל מחסנית יכול להכיל עד 12 מחסניות 12 יריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הסוללה ואת אניה חבית טרי לתוך Gun הליוס ג&#39;ין. ודא כי הן את אניה חבית את האקדח יש בהתאמה O-טבעות המצורפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להוסיף בעל מחסנית אקדח ריק לתוך הגן, עם סימן # 12 על בעל מחסנית מול החלק העליון של האקדח. מחסנית בעל Advance פעם או פעמיים כדי לוודא שהוא מוכנס כהלכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף אקדח למיכל הליום ולהתאים את הלחץ בין 150-200 psi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבשי הגנה האוזן אקדח אש כמה פעמים עם בעל מחסנית ריקה לנקות את החדר של האקדח ואת לוודא כי הלחץ הוא יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בעל מחסנית ריקה להוסיף בעל מחסנית טעונה. מתקדם בעל מחסנית כך מחסנית אתה רוצה אש ממוקם בתחתית (06:00) של בעל מחסנית. קליעה חתיכת בצל כאן מספק סוג של שליטה שלילי הקרינה רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חתיכות בצל באמצע צלחת פטרי ריקות עם השכבה הפנימית ביותר של בצל פונה כלפי מעלה. מנוחה אניה קנה האקדח של הגן על צלחת פטרי ואש את האקדח על ידי לחיצה רצופה על כפתור בצד בזמן על ההדק. מעבירים את הבצל מופצצים כדי בצלחת פטרי לחות המכיל מסנן נייר 3mm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מראש על המחסנית הבא ואש חתיכת בצל שונים. חזור על שלב זה עד 4-5 פיסות של בצל נורים. כל תכשיט בצל הוא ירה פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה לבעל מחסנית שונה עמוסה מחסניות המכילות שילוב שונה פלסמיד פלסמיד או אחרת. זכור לשנות את אניה לחביתזה גם על מנת למנוע זיהום. תירה 4-5 חתיכות בצל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההפצצה, להחזיר את כל הבצל עד מנות perti. מכסים את צלחות פטרי עם מכסים. לעטוף אותם עם Parafilm כדי למנוע התייבשות. דגירה חתיכות בצל בטמפרטורת החדר בחושך במשך 16-48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את לחץ הגז ולשחרר את האקדח לפני ניתוק גן מהטנק הליום. פרקו את אניה לחבית, ולהסיר את בעל מחסנית של מחסניות בשימוש (או משומש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקוי מחסנית בעלי ספינות חבית על ידי השריית אותם בכוס עם מים וסבון. מניחים את כוס ב sonicator אמבטיה sonicate במשך 20 דקות. לאחר מכן, לשטוף אותם במים כדי להסיר את כל שאריות הסבון. משרים אותם אתנול 70% למשך שעה ולאחר מכן לייבש אותם על מגבות נייר. </li></ol> V. תצפית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דוגרים חתיכות בצל מופגז במשך 16-20 שעות בטמפרטורת החדר, אנו יכולים לצפות GFP או YFP הקרינה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כגון Axio Zeiss Observer.z1 השתמשו במחקר זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מלקחיים עם קצוות שטוחים לאט לקלף שכבה תא בודד את האפידרמיס הפנימית של הבצל (השכבה ישירות הפנים את האקדח במהלך ההפצצות). מניחים את קליפות על טיפת מים בשקופית. הוסף coverslip אבל להיזהר כדי למזער את הבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת שדה בהיר של המיקרוסקופ, בדוק תחילה להזרמת cytoplasmic על מנת להבטיח כי התאים הם בחיים. כדי לעשות זאת, לחשוף את השקופית האור בשדה בהיר במשך כמה דקות כדי לחמם את רקמות בצל ואז לחפש plastids נעים. הזרמת cytoplasmic לא תמיד קל לראות, אז אל תתייאש אם אתה לא רואה שום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגילוי פלואורסצנטי, השתמש עירור מתאים ומסננים גילוי ה-GFP או YFP. חשוב לכלול בקרות שליליות כגון חתיכות בצל עם זריקה שאינה פלורסנט פלסמיד. אותות צהוב קלוש להופיע מתאי פצועים, בועות אוויר, או פסולת. חשוב גם לכלול שולטת חיובית. כתב פלסמיד המכיל הביעו פלורסנט constitutively כגון 35S:: ה-GFP הוא פקד חיובי מעולה. אותות ה-GFP Visible מתאי אפידרמיס הבצל (איור 1 א, ד) ציינו כי מחסניות, הרקמות בצל, ירי אקדח גנים מוכנים כהלכה והוצאו להורג. בהמשך, צפינו אינטראקציות בין שאו-pSPYNE ו-LUH pSPYCE לחתיכות בצל מופגזים מחסניות המכילות תערובת של 35S:: שאו pSPYNE ו-35S:: LUH-pSPYCE DNAs. קלוש הקרינה YFP נצפתה גרעין בלבד (איור 1 B, E), המציין את האינטראקציה פיזי ישיר בין שאו ו LUH שהביא את שברי YFP לפצל יחד בגרעין. שים לב כי האות YFP מ BiFC הוא חלש יותר באופן משמעותי האות ה-GFP מן 35S:: ה-GFP. </li></ol> נציג תוצאות במחקר שלנו דיווחו כאן, 35S:: שליטה GFP חיובי פלסמיד פולט הקרינה חזקה הממלא את התא כולו, כולל בגרעין והן בציטופלסמה (איור 1 א, ד). חלבון ה-GFP הוא קטן מספיק כדי לנטרל לתוך הגרעין ללא לאות לוקליזציה גרעיני. לעומת זאת, שאו ו LUH שני גורמים תעתיק ארבידופסיס הראו בעבר לתקשר בשמרים שני היברידית assay 2. שאו-pSPYNE (שאו התמזגו שבר N-הטרמינל של YFP) ו-LUH pSPYCE (שאו התמזגו שבר N-הטרמינל של YFP), הן גדולות מדי מפוזר לתוך הגרעין, מכילים אותות לוקליזציה גרעיני 2,5. אות ניאון YFP זוהה בגרעין התא בצל (איור 1 B, E) עולה כי שאו-pSPYNE ו-LUH pSPYCE יכולים לקיים אינטראקציה בגרעין בצל. אות לא פלורסנט מזוהה בצל מופגזים תערובת של pSPYNE וקטור פלסמיד פלסמיד המכיל את שבר N-מסוף של YFP ו-LUH pSPYCE (תרשים 1C, F). הקרינה BiFC בתיווך YFP משמעותית חלש יותר הקרינה GFP בתיווך מן 35S:: GFP פלסמיד. במחקר שלנו, הם גם הראו לוקליזציה subcellular שונים (איור 1A להשוות עם B). בנוסף, את מספר התאים פלורסנט נמוך באופן משמעותי עבור BiFC, כמו BiFC פועל רק כאשר שני פלסמידים שותף בהצלחה להיכנס באים לידי ביטוי בתאי הבצל זהה. <img src="/files/ftp_upload/1963/1963fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. מופגז פלורסנט (A, B, C) ​​שדה בהיר (D, E, F) תמונות של תאים בצל עם בונה פלסמיד שונה. (א) ו - (ד), תאים בצל מופגזים 35S:: ה-GFP. GFP מפזרת ברחבי הציטופלסמה לבין הגרעין. (ב) ו - (ה), תאים בצל מופגזים מתערבב טוחנת שווה 35S:: שאו-pSPYNE (שאו התמזגו שבר N-הטרמינל של YFP) ו 35S:: LUH-pSPYCE (LUH התמזגו שבר בטרמינל C- ) פלסמיד דנ&quot;א. האינטראקציה בין שאו-pSPYNE ו-LUH pSPYCE מוצג על ידי גרעין ניאון. (ג) ו - (F), פקד שלילי מראה תאים בצל מופגזים תערובות של וקטור pUC19-SPYNE ו-LUH pSPYCE plasmiDS. אות לא פלורסנט מזוהה.

<ol>
	<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).</li><li>Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LEUNIG_HOMOLOG+and+LEUNIG+perform+partially+redundant+functions+during+Arabidopsis+embryo+and+floral+development.">LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development.</a> Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).</li><li>Walter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).</li><li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture.">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEUSS+and+AINTEGUMENTA+mediate+patterning+and+ovule+initiation+during+gynoecium+medial+domain+development.">SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development.</a> Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).</li><li>Zhang, X. N., Mount, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+alternatively+spliced+isoforms+of+the+Arabidopsis+SR45+protein+have+distinct+roles+during+normal+plant+development.">Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור משתמשים בפעם הראשונה, מומלץ לתרגל את ההליך כולו, מתוך הכנה מחסנית אל תצפית, עם כתבת אחת מכוננת פלסמיד כגון 35S:: GFP או 35S:: גאס. השתמשנו 35S:: GFP פלסמיד המתקבל בני הזוג. סטיב הר Xiaoning אנג 6 (איור 1 א, ד). ירו גן לשלוט מחסניות נמכר RioRad (חתול 165-2244) אינם מתאימים ?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Yellow onion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any supermarket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios Gene Gun</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss, Nikon, Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bimolecular fluorescence complementation (bifc) assay for protein-protein interaction in onion cells using the helios gene gun

חקירת פונקציה הגן באורגניזמים שונים מסתמך על הידע של איך את המוצרים גן לתקשר אחד עם השני בסביבה הסלולר הרגיל שלהם. את הקרינה bimolecular השלמה (BiFC) Assay<sup&gt; 1</sup&gt; מאפשר לחוקרים לחזות חלבונים אינטראקציות בתאים חיים הפך לכלי מחקר חיוני. Assay זו מבוססת על הקשר בהנחייתם של שני שברים של חלבון פלואורסצנטי (GFP), כי הם התמזגו כל שותף פוטנציאלי אינטראקציה חלבון. האינטראקציה של שני השותפים חלבון יקל את הקשר של N-מסוף בטרמינל C-שבר של ה-GFP, המוביל פלואורסצנטי. עבור החוקרים צמח, התאים בצל אפידרמיס מהווים מערכת ניסיונית אידיאלי לביצוע assay BiFC בגלל הקלות בקבלת והכנת רקמות הבצל ואת להדמיה ישירה של הקרינה עם הקרינה רקע מינימלי. האקדח הליוס ג&#39;ין (BioRad) משמש בדרך כלל מפציצים פלסמיד דנ&quot;א לתאי הבצל. אנו מדגימים את השימוש הליוס Gun ג&#39;ין להציג בונה פלסמיד לאינטראקציה two<em&gt; ארבידופסיס thaliana</em&gt; גורמי שעתוק, סוס (שאו) ו homolog LEUNIG (LUH)<sup&gt; 2</sup&gt; ואת להדמיה של האינטראקציות ביניהם בתיווך BiFC בתאי אפידרמיס בצל.

Watch this Scientific Journal Video about Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun at JoVE.com

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

מאמר זה מדגים כיצד להשתמש נכון BioRad הליוס Gun ג&#39;ין להציג פלסמיד דנ&quot;א לתוך תאים אפידרמיס בצל ואיך לבדוק אינטראקציות בין חלבונים בתאים בצל מבוססת על העיקרון של השלמה Fluorescence bimolecular (BiFC)

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

bimolecular-fluorescence-complementation-bifc-assay-for-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

19.5K Views.  University of Maryland. מאמר זה מדגים כיצד להשתמש נכון BioRad הליוס Gun ג'ין להציג פלסמיד דנ"א לתוך תאים אפידרמיס בצל ואיך לבדוק אינטראקציות בין חלבונים בתאים בצל מבוססת על העיקרון של השלמה Fluorescence bimolecular (BiFC)

Video: Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

ג&#39;ין ירייה transfection של נוירונים בהיפוקמפוס

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed protocol for biolistic transfection of rat hippocampal slices, from the initial preparation of DNA coated bullets to the final shooting of the organotypic slice cultures using a gene gun. Gene gun transfection is an efficient and easy means of transfecting neurons and is especially useful for fluorescently labeling a small subset of cells in tissue slice. In this video, we first outline the steps required to coat gold particles with DNA. We next demonstrate how to line the inside of plastic tubing with the gold/DNA bullets, and how to cut this tubing to obtain the plastic cartridges for loading into the gene gun. Finally, we perform biolistic transfection of rat hippocampal slice cultures, demonstrating handling of the Bio-Rad Helios gene gun, and offering trouble shooting advice to obtain healthy and optimally transfected tissue slices.  

We describe a method for preparing DNA coated gold bullets and demonstrate the use of such bullets to biolistically transfect neurons in cultured hippocampal slices.

הכנת כדורי אקדח ין transfection Biolistic של נוירונים תרבות Slice

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

השלמה Fluorescence bimolecular

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחת ננומטר (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...