وITSN ، PI3K C2β ، وناقلات التحكم المستخدمة في هذا البروتوكول متاحة من الكتاب بناء على طلبها ، لأغراض غير تجارية فقط. الكتاب نود أن ننوه الدكتور تشانغ دينغ هو جين تاو لتقديم المشورة وتتكرم الكواشف المستخدمة في إنشاء بروتوكول BiFC في المختبر O&#39;Bryan. وأيد كاو من خلال تمويل من مؤسسة جيروم لوجون. ويدعم العمل في المختبر O&#39;Bryan من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة وزارة الدفاع (HL090651) (PR080428) ، مؤسسة Baldrick سانت ، وجيروم لوجون المؤسسة.

ألف BiFC المعايرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار fluorophore هناك fluorophores متعددة ، مثل YFP والزهرة ، التي تعمل بشكل جيد كشركاء الانصهار BiFC (الجدول 1). تاريخ الأمينية وكربوكسي محطة - فينوس قادرون على تشكيل المجمع في 37 درجة مئوية ، في حين أن شظايا BiFC YFP تتطلب الحضانة في مرحلة ما قبل 30 درجة مئوية وذلك لتسهيل تشكيل fluorophore 2. قد يكون هذا الاحتضان في درجة حرارة منخفضة تغيير بعض العمليات الخلوية وينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند اختيار شظايا. نواقل التفجير فينوس إلى محطة كربوكسي البروتينات المتوفرة من Addgene ( <a href="http://www.addgene.org/pgvec1">http://www.addgene.org/pgvec1</a> ؛ seepBiFC - VN173 وpBiFC VC155) جنبا إلى جنب مع ثوابت إضافية لاستخدامها في الضوابط ، وعلى سبيل المثال ، <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC - bJunVN173</a> وpBiFC bFosVC155 - 2. ناقلات إضافية ، بما في ذلك ناقلات فينوس المطراف الأميني (VN173 وpFLAG - PHA VC155) ، متاحة على الموقع التالي : <a href="http://people.pnhs.purdue.edu/%7Ehu1/">http://people.pnhs.purdue.edu/ hu1 ~ /</a> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العلامة البروتين من الفائدة. وتنصهر وشظايا BiFC إلى أقاصي الأمينية أو كربوكسي المحطة ، من البروتينات مرشح. بعض البروتينات قد لا تسمح لوضع علامات على طرفي بسبب اضطراب في وظيفة البروتين. على سبيل المثال ، العديد من أعضاء الفصيلة من رأس GTPases يتم تعديل المادة الدهنية في المرفق كربوكسي محطة النافية بالتالي شظايا BiFC في تحقيق هذه الغاية. وهكذا ، فإنه من المهم أن يكون فكرة عن كيفية الحجز على شظايا BiFC قد تؤثر على وظيفة من البروتينات المثيرة للاهتمام. وينبغي إذا كان من غير الواضح كيف علامات البروتين سيؤثر يتم اختبار تركيبات وظيفتها متعددة. بالإضافة إلى جزء BiFC ، قد يتم تضمين رابط الببتيد لزيادة المرونة بين fluorophore مجزأة والبروتينات مرشح. في حين أن الاستنساخ مواقع متعددة (MCS) في ناقلات BiFC ترميز قصيرة تمتد من الأحماض الأمينية التي يمكن أن توفر قدرا كافيا من المرونة ، وRSIAT ، KQKVMNH وlinkers RPACKIPNDLKQKVMNH وقد استخدمت بنجاح في التجارب BiFC 3،9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد شروط ترنسفكأيشن قبل اختبار طفرات متعددة ، وينبغي إجراء تجارب مراقبة قليلة. الأولين تركيبات BiFC التي يجب أن يحاكم واثنين من البروتينات النوع البري التي هي معروفة للتفاعل ونوع واحد البرية والمسخ التي لا تتفاعل. تستخدم هذه المجموعات يتعين عليهما أن كميات مختلفة من اختبار الحمض النووي وتحديد أوقات ترنسفكأيشن الظروف المثلى للكشف عن إشارة BiFC للبروتينات مرشح. نقترح اختبار 0.25ug ، 0.5ug ، 1.0ug كل بناء BiFC لفترة واحدة جيدا 6 طبق بشكل جيد. بعد يوم من الخلايا بواسطة المجهر مراقبة ترنسفكأيشن مضان لتحديد الوقت الأمثل لتحقيق التنمية إشارة. و <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC - bJunVN173</a> وpBiFC - bFosVC155 يبني 2 هي الضوابط الإيجابية مفيدة للBiFC وتتوفر من Addgene (انظر أعلاه). بالإضافة ، يجب إجراء تحليل لطخة غربية لتأكيد المساواة في التعبير يبني. وينبغي اختيار الأوضاع ويلاحظ ان هذه هي الملاحظة إشارة الفلورية بين نوعين من البروتينات الطبيعية ولكن القليل لعدم وجود إشارة بين نوع من البروتينات البرية ومتحولة. أخيرا ، فمن الأفضل للحفاظ على التعبير البروتين عند أدنى مستوى ممكن لمنع أي التفاعلات غير محددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالإضافة إلى ذلك تحديد ما إذا كان من شظايا BiFC يغير التعريب من البروتينات التي تهم كل بناء BiFC يحتوي إما على سطحه أو العلامة حاتمة FLAG. transefected Immunostain الخلايا HA على حد سواء أو FLAG علامة حاتمة فضلا جيدا للبروتين الذاتية (إن أمكن) لتحديد ما إذا كانت العلامة BiFC يؤثر توطين البروتينات المثيرة للاهتمام. </li></ol> وباء التصفيحات ترنسفكأيشن من الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومطلي الخلايا COS (1.3x10 5) على كل كوب واحد أسفل لوحة ماتيك وبئرين لوحة 6 - جيدا لكل عينة. يسمح للخلايا لتسوية بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. ويمكن أيضا أنواع الخلايا التي هي بديل أكثر ملاءمة لمصلحة مرشح من بروتينات يمكن استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد السلطات الوطنية المعينة لترنسفكأيشن. نحن نستخدم عادة Lipofectamine (Invitrogen) لtransfections COS. ومع ذلك ، قد كواشف أخرى تكون أكثر ملائمة للخط الخلوي من الفائدة. منذ سيتم تقسيم الخليط ترنسفكأيشن بين كوب واحد الطبق السفلي وبئرين لوحة 6 - جيدا ، واستخدام كمية مناسبة من الحمض النووي لحساب هذا الانقسام. مخفف من الحمض النووي في 250uL DMEM المصل (SF) مجانا. إضافة CFP على مبلغ 1 / 5 من السلطات الوطنية المعينة BiFC مجموع كعنصر تحكم ترنسفكأيشن. لالكمي BiFC ، سيتم تحليل الخلايا فقط التي هي ايجابية للCFP عن وجود إشارة BiFC. علما بأن أطياف CFP سوف تتداخل مع بعض أزواج BiFC في الجدول رقم 1 ، وبالتالي عنصر تحكم ترنسفكأيشن البديلربما هناك حاجة. تمييع Lipofectamine في 250uL SF DMEM (10uL Lipofectamine/1ug من الحمض النووي). مزيج من الحمض النووي والتخفيفات Lipofectamine. يحضن في درجة حرارة الغرفة ل20min. ملاحظة : Lipofectamine : نسبة الحمض النووي يمكن أن تختلف تبعا لنوع من الخلايا. استخدام الأسلوب المناسب لترنسفكأيشن خط خلية من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الخلايا 2X مع DMEM SF الدافئة. إضافة 2mL من DMEM SF إلى كل لوحة من الزجاج أو أسفل جيدا طبق 6 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم كل خليط ترنسفكأيشن بالتساوي بين كوب واحد الطبق السفلي وبئرين من صحن 6 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا عند درجة 37 ل5hrs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة واستبدال وسائل الاعلام ترنسفكأيشن الكامل مع وسائل الاعلام (FBS DMEM +10 ٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. سوف طول ترنسفكأيشن التالية الحضانة تختلف تبعا لمستويات التعبير من البروتينات المثيرة للاهتمام. حضانة لفترات طويلة قد يؤدي إلى التفاعل غير محددة حتى هذه الخطوة سوف تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا. </li></ol> جيم إعداد خلايا للتصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم فحص الخلايا في البداية تحت المجهر epifluorescent لضمان السيطرة الإيجابية الفلورسنت. إذا لم يكن كذلك ، قد يكون من الضروري السماح للخلايا وقتا إضافيا عند 37 درجة مئوية حتى لاحظ إشارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الخلايا 3X مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4). إلى الخلايا في وعاء زجاجي القاع إضافة بارافورمالدهيد 2 ٪ (7.4 درجة الحموضة). إصلاح الخلايا 10min على الجليد. شطف الخلايا 3X مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4). تخزين الخلايا في 4 درجات مئوية مغطاة PBS 1mL (الرقم الهيدروجيني 7.4). الخلايا لا يجب أن تكون ثابتة للتصوير ، ولكن بمجرد شظايا BiFC بإصلاح fluorophore سليمة فإنه لا رجعة فيه تحليل وبالتالي منع التفاعلات الحيوية 3. أيضا ، أن نضع في الاعتبار أن الخلايا غير المثبتة سوف تستمر في تطوير الإشارة. ليز الخلايا في الطبق 6 - جيدا ، وأن يستعدوا للتحليل لطخة lysates الغربية. من المهم أن يتم إعداد كافة الخلايا في نفس الوقت بحيث الخلايا lysed تمثل الخلايا المصورة. </li></ol> دال خلايا التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسيتم احتساب كثافة مضان لكل خلية. تأكد من الخلايا صورة فردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدرج CFP كعنصر تحكم tranfection ويتم اختيار الخلايا CFP الإيجابية الوحيدة لتحليل الإشارات BiFC. يمكننا أن نجعل من افتراض أنه إذا transfected الخلية مع CFP ، هو transfected أيضا مع ثوابت BiFC. هذا النهج يضمن أن الخلايا التي تفتقر التقط اشارة BiFC سلبية نظرا لعدم وجود تفاعل بين البروتينات التي تهم وليس بسبب عدم وجود واحد أو كلا بنيات التعبير BiFC في تلك الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نستخدم LSM زايس مجهر 510 مبائر التصوير الخلية. عند استخدام هذا المجهر من المهم للحفاظ على التكبير ، والثقب ، واكتساب كاشف ، مكبر للصوت إزاحة ، حجم الإطار ، وسرعة المسح الضوئي ، ومتوسط ​​المسح الضوئي ، والليزر السلطة متناسقة. عند استخدام أي نظام التصوير من المهم للحفاظ على إعدادات ثابتة بحيث الاستشعاع للمقارنة بين العينات. أيضا ، عند قياس مضان من المهم أن لا يتم المشبعة بكسل. </li></ol> هاء تحديد مقدار الإسفار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد يكون كميا مضان باستخدام أي برنامج التصوير. نحن نستخدم ImageJ وهو متاح مجانا من المعاهد الوطنية للصحة (http://rsb.info.nih.gov/ij/). فتح ملفات الصور في ImageJ. انتقل إلى قياسات AnalyzeSet. خانات الاختيار للمنطقة ومتوسط ​​القيمة في مربع رمادي القياسات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام أداة &quot;الاختيار اليد الحرة ، ورسم الخطوط العريضة حول حافة الخلية بأكملها في القناة CFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك هذا المخطط في المكان ، والتحول إلى القناة YFP. انتقل إلى AnalyzeMeasure. رمادي متوسط ​​القيمة هو مجموع القيم الرمادية من كل بكسل في اختيار مقسوما على عدد من بكسل (أي متوسط ​​كثافة مضان في مجال الخلية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل صورة رسم دائرة في القناة YFP في المنطقة التي لا تحتوي على الخلية. أخذ القياس لهذه المنطقة الخلفية. طرح الخلفية من كل صورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متوسط ​​قيمة متوسط ​​رمادي ناقص الخلفية لكافة الخلايا المصورة في عينة واحدة. وسوف يكون هذا هو متوسط ​​كثافة مضان لسكان من الخلايا. نقترح أن يكون كميا حوالي 60 خلايا على مدى ثلاث تجارب. </li></ol> F. نتائج الممثل : مختبرنا يركز على البروتين السقالات متعددة المجال ، intersectin (ITSN) التي تتفاعل مع بروتينات عديدة لتنظيم متعددة المسارات البيوكيميائية ويشير 10،11،12،13،14. ITSN يحتوي على اثنين من تناظر Eps15 (EH) المجالات ، وهي منطقة ملفوف ، ملفوف ، وخمسة SRC تناظر 3 (SH3) المجالات. ويعد شكل الإسوي من ITSN يحتوي أيضا تناظر DBL (DH) وpleckstrin تناظر (PH) في المجالات التي تعمل كعامل الحفل تبادل النوكليوتيدات جوانين لCdc42 15. يعزز هذا الهيكل وحدات البروتين : بروتين تفاعلات ويجعل ITSN مرشحا مثاليا للتجارب BiFC. يمكن للتوطين التحت خلوية من ITSN تغيير شركائها ملزمة وبالتالي تغيير المسارات التي ينظمها ITSN (unpublisهد البيانات). مؤخرا ، أظهرت أن مختبرنا ITSN ينظم بقاء الخلايا العصبية من خلال تنظيم لPI3K رواية من الدرجة الثانية ، PI3K C2β - 11. الأمينية ، محطة برو الغنية مجال C2β - PI3K يحتوي على موقعين ملزمة للنطاقات SH3 ITSN ل. استخدام المشترك مع ITSN مناعي والمسوخ اقتطاع PI3K - C2β أثبتنا أن SH3A ITSN والتفاعل مع المجالات SH3C المنطقة الأميني من محطة C2β - PI3K. المقبل ، استخدمنا BiFC لتصور التعريب التحت خلوية من هذا المجمع. وتنصهر ITSN إلى محطة الأمينية فينوس (pFLAG - VN173) ، ويبني PI3K - C2β تنصهر في النهاية كربوكسي لكوكب الزهرة (PHA - VC155). كما تحكم آخر سلبي ، وتنصهر الببتيد غير محددة لPHA - VC155. شكلت VN - ITSN وVC - PI3K C2β - مجمع BiFC مع توزيع نقط (الشكل 2A ، لوحات العليا). انخفض الطفرات في المجال برو الغنية PI3K - C2β التي تعرقل التعاون ترسيب ITSN وPI3K C2β - إشارة BiFC (الشكل 2A ، وانخفاض لوحات) 11. وكان هذا الاختلاف في إشارة BiFC بين ITSN واثنين من البروتينات PI3K - C2β ليس بسبب الاختلافات في التعبير البروتين (الشكل 2B). <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> . الشكل 1 في BiFC ، يتم تقسيم fluorophore (في هذه الحالة فينوس) في الأمينية (VN) -- وكربوكسي (VC) ، تاريخ المحطة. وتنصهر هذه الغايات لاثنين من البروتينات المثيرة للاهتمام. عندما تتفاعل البروتينين ، وشظايا وVN VC إعادة المنتسبين مما أدى إلى إعادة تشكيل fluorophore ومضان في مواقع التفاعل. BiFC هو مثال محدد للتكامل فحص البروتين شظية (PCA) يستخدم لقياس البروتين : البروتين التفاعلات 5. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. ITSN وPI3K - C2β تشكيل BiFC المعقدة. ألف VN - الموسومة كان ITSN المشترك tranfected مع VC - الموسومة WT - PI3K C3β أو مجال البرولين الغنية متحولة (PI3K - C2β والسلطة الفلسطينية). وشكل ITSN WT - PI3K C2β مجمع (الخضراء). وقد استخدم CFP (الحمراء) كعنصر تحكم ترنسفكأيشن باء أجري لطخة غربية لإظهار التعبير المتساوي للبنيات. والموسومة HA الرأسمالي الموسومة يبني. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643table1.jpg" alt="الجدول 1" /> الجدول رقم 1 ، وهناك عدة ناقلات التي تتوافق مع BiFC. YN155 : 1 - 155aa من YFP ؛ YC155 : 155 238aa من YFP ؛ YN173 : 1 - 172aa من YFP ؛ YC173 ، 173 - 238aa من YFP ؛ VN155 : 1 - 154aa فينوس ؛ VC155 : فينوس 155-238 ؛ VN173 : 1 - 172aa فينوس ؛ VC173 : 173 238aa فينوس ؛ CN155 1 ​​- 154aa من CFP ؛ CC155 155 238aa من CFP ، GN173 : 1 - 172aa من GFP ، CitN155 : 1 - 155aa من سيترين ، CitC155 : 155 من 238aa السيترين ، CitN173 : 1 - 172aa من سيترين ، CitC173 : 173 238aa من سيترين ، CerN173 : 1 - 172aa للأزرق 2،3،9.

<ol>
	<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+molecular+interactions+by+fluorescence+complementation.">Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).</li><li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions.">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40, 61-66 (2006).</li><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Michnick, S. W., Remy, I., Campbell-Valois, F. X., Vallee-Belisle, A., Pelletier, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein-protein+interactions+by+protein+fragment+complementation+strategies.">Detection of protein-protein interactions by protein fragment complementation strategies.</a> Methods Enzymol. S328, 208-230 (2000).</li><li>Michnick, S. W., MacDonald, M. L., Westwick, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+strategies+to+delineate+MAP+kinase+signaling+pathways+using+protein-fragment+complementation+assays+(PCA).">Chemical genetic strategies to delineate MAP kinase signaling pathways using protein-fragment complementation assays (PCA).</a> Methods. 40, 287-293 (2006).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+methods+in+the+study+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).</li><li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nat Biotechnol. 21, 539-545 (2003).</li><li>Martin, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+regulates+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis,+ubiquitylation,+and+signaling.">Intersectin regulates epidermal growth factor receptor endocytosis, ubiquitylation, and signaling.</a> Mol Pharmacol. 70, 1643-1653 (2006).</li><li>Das, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuron+survival+through+an+intersectin-phosphoinositide+3'-kinase+C2beta-AKT+pathway.">Regulation of neuron survival through an intersectin-phosphoinositide 3'-kinase C2beta-AKT pathway.</a> Mol Cell Biol. 27, 7906-7917 (2007).</li><li>Mohney, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+activates+Ras+but+stimulates+transcription+through+an+independent+pathway+involving.">Intersectin activates Ras but stimulates transcription through an independent pathway involving.</a> JNK. J Biol Chem. 278, 47038-47045 (2003).</li><li>Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O'Bryan, J. P., McPherson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+can+regulate+the+Ras/MAP+kinase+pathway+independent+of+its+role+in+endocytosis.">Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis.</a> J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).</li><li>Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+an+adaptor+protein+involved+in+clathrin-mediated+endocytosis,+activates+mitogenic+signaling+pathways.">Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways.</a> J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).</li><li>O'Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogenesis+and+endocytosis:+What's+at+the+INTERSECTIoN?.">Mitogenesis and endocytosis: What's at the INTERSECTIoN?.</a> Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+AP-1+NF-kappaB+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET.">Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

BiFC هو وسيلة ممتازة لتصور البروتين : تفاعلات البروتين في الخلايا كلها وتحديد توطين التحت خلوية من هذه المجمعات. مزايا BiFC فقط هي التي تتفاعل البروتينات هي الفلورسنت ، واستقرت تفاعلات عابرة ، وبعد معالجة البيانات التصوير هو الحد الأدنى. اثنين من مساوئ هذه الطريقة هي الو...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-013</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>35-011-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Bottom Microwell dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Matek</td>
<td>P35G-1.5-14C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>35-3846</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18324020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>21-031-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>LSM510 META</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bimolecular fluorescence complementation

تحديد التوزيع التحت خلوية المجمعات إشارة لا بد من فهم أن الإخراج من التعقيد. الأساليب التقليدية مثل مناعي لا تقدم معلومات على توطين المكاني للمجمعات. في المقابل ، BiFC يراقب التفاعل والتقسيم التحت خلوية مجمعات البروتين. في هذه الطريقة ، يتم تقسيم البروتين fluororescent إلى أجزاء غير الفلورسنت الأمينية وكربوكسي المحطة ، التي تنصهر بعد ذلك إلى اثنين من البروتينات المثيرة للاهتمام. تفاعل البروتينات النتائج في إعادة تشكيل fluorophore (الشكل 1) 1،2. وجود قيود على BiFC أنه بمجرد تشكيل لfluorophore تجزئة معقدة لا رجعة فيه 3. هذا القيد هو مفيد في الكشف عن التفاعلات عابرة أو ضعيفة ، ولكن ما يحول دون إجراء تحليل للديناميات الحركية المعقدة. تحذيرا إضافيا هو أن flourophore يتطلب إعادة 30min حتى تنضج ويتألق ، النافية مرة أخرى مراقبة التفاعلات الوقت الحقيقي 4. BiFC هو مثال محدد للتكامل فحص البروتين شظية (PCA) الذي يعمل مراسلا من البروتينات مثل بروتين الفلورية الخضراء المتغيرات (BiFC) ، dihydrofolate مختزلة ، ب اكتاماز ، وluciferase لقياس البروتين : البروتين 5،6 التفاعلات. طرق بديلة لدراسة البروتين : تفاعلات البروتين في الخلايا وتشمل الطاقة مضان بالرنين شارك في توطين ونقل فورستر (الحنق) 7. لتوطين المشترك ، والموسومة فردي اثنين من البروتينات إما مباشرة مع fluorophore المناعي أو غير مباشر. ومع ذلك ، فإن هذا النهج يؤدي إلى خلفية عالية من البروتينات غير التفاعل مما يجعل من الصعب تفسير شارك في توطين البيانات. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا للحدود قرار المجهري متحد البؤر ، قد تظهر اثنين من البروتينات المشترك المترجمة دون التفاعل بالضرورة. مع BiFC ، يلاحظ فقط مضان عندما اثنين من البروتينات الفائدة تفاعل. الحنق آخر هو طريقة ممتازة لدراسة البروتين : البروتين التفاعلات ، ولكن يمكن أن يكون تحديا تقنيا. الحنق التجارب تتطلب المانحة ومتقبل لتكون مماثلة من السطوع ورياضيات الكيمياء في الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، لا بد من حساب واحد عن طريق التسييل من المانحين في القناة متقبل والعكس بالعكس. بخلاف الحنق ، BiFC ومضان الخلفية قليلا ، وبعد تجهيز البيانات القليل من الصور ، لا يتطلب overexpression عالية ، ويمكن الكشف عن التفاعلات الضعيفة أو عابرة. نقل الطاقة الرنين ضوء بارد (بريت) هي طريقة مشابهة لالحنق باستثناء الجهة المانحة هو انزيم (مثل luciferase) الذي يحفز لتصبح ركيزة bioluminescent مثيرة مما يتسبب المتقبلة. بريت يفتقر المشاكل التقنية عن طريق التسييل ومضان خلفية عالية لكنه يفتقر الى القدرة على توفير المعلومات المكانية نظرا لعدم وجود ركيزة لتوطين المقصورات الخاصة 8. عموما ، BiFC هو وسيلة ممتازة لتصور التعريب التحت خلوية مجمعات البروتين لاكتساب نظرة ثاقبة يشير مجزأة.

Watch this Scientific Journal Video about Bimolecular Fluorescence Complementation at JoVE.com

Bimolecular Fluorescence Complementation

توطين التحت خلوية من البروتينات مهم في تحديد لائحة المكانية والزمانية لمن إشارات الخلية. هنا ، نحن تصف تكامل مضان ثنائي الجزيء (BiFC) كوسيلة مباشرة لرصد التفاعلات المكانية من البروتينات في الخلية.

الإسفار التكملة ثنائي الجزيء

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Research

JoVE Journal

Biology

27.7K Views.  University of Illinois at Chicago. توطين التحت خلوية من البروتينات مهم في تحديد لائحة المكانية والزمانية لمن إشارات الخلية. هنا ، نحن تصف تكامل مضان ثنائي الجزيء (BiFC) كوسيلة مباشرة لرصد التفاعلات المكانية من البروتينات في الخلية.

Video: Bimolecular Fluorescence Complementation

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC) الفحص عن البروتين البروتين في خلايا البصل التفاعل باستخدام مدفع الجينات هيليوس

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

متصور الكهربائي زنزانة مع مضان المجهري

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

الكشف عن تفاعلات البروتين في النبات باستخدام عبارة الإسفار ثنائي الجزيء المتوافقة التكملة (BiFC) نظام

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Microbes typically live in communities. The spatial organization of cells within a community is believed to impact the survival and function of the community1. Optical sectioning techniques, including confocal and two-photon microscopy, have proven useful for observing spatial organization of bacterial and archaeal communities2,3. A combination of confocal imaging and physical sectioning of yeast colonies has revealed internal organization of cells4. However, direct optical sectioning using confocal or two-photon microscopy has been only able to reach a few cell layers deep into yeast colonies. This limitation is likely because of strong scattering of light from yeast cells4.
Here, we present a method based on fixing and cryosectioning to obtain spatial distribution of fluorescent cells within Saccharomyces cerevisiae communities. We use methanol as the fixative agent to preserve the spatial distribution of cells. Fixed communities are infiltrated with OCT compound, frozen, and cryosectioned in a cryostat. Fluorescence imaging of the sections reveals the internal organization of fluorescent cells within the community.
Examples of yeast communities consisting of strains expressing red and green fluorescent proteins demonstrate the potentials of the cryosectioning method to reveal the spatial distribution of fluorescent cells as well as that of gene expression within yeast colonies2,3. Even though our focus has been on Saccharomyces cerevisiae communities, the same method can potentially be applied to examine other microbial communities.

We present a protocol for freezing and cryosectioning yeast communities to observe internal patterns of fluorescent cells. The method relies on methanol-fixing and OCT-embedding to preserve the spatial distribution of cells without inactivating fluorescent proteins within a community.

Cryosectioning المجتمعات الخميرة لفحص أنماط الإسفار

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

تدفق تحليل Cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء: عالية الإنتاجية الأسلوب الكمي لدراسة التفاعل البروتين البروتين

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

التحليل السريع واستكشاف الإسفار الميكروسكوب الصور

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

الجينوم على نطاق فحص التفاعلات بين البروتينات التي كتبها البروتين جزء التكملة الفحص (PCA) في الخلايا الحية

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...