Biz Dr teşekkür ederim. 35S Steve Mount ve Xiaoning Zhang: GFP pGlowbug inşa ve Z. L&#39;s laboratuvarda CH Araştırma Hokensen Doktora Bursu, ABD Ulusal Bilim Vakfı (IOB0616096 ve MCB0744752) tarafından desteklenmektedir. ZL, Maryland Zirai Araştırma İstasyonu Üniversitesi tarafından kısmen destekleniyor.

I. Plazmid hazırlık Bombardıman için kullanılan plazmid DNA 500ng/μl veya daha büyük bir konsantrasyon ve yüksek saflıkta olmalıdır. BiFC iki plazmid yapıları içeren, her plazmid 25 mg gereklidir. Diğer bir deyişle, iki plazmid 1:1 molar oranda kartuşlarının hazırlanması için 50 mg toplam plazmid DNA doğuran karıştırılmalıdır. 50 mg daha fazla DNA ekleyerek altın parçacıkları yığılma neden olabilir ve kaçınılmalıdır dikkatli olun. Ticari olarak mevcut plazmid DNA ekstraksiyon kitleri plazmid DNA&#39;ları izole etmek için tavsiye edilir. Plazmid vektörler bu pUC19 olarak boyutu oldukça küçük olmalıdır. Biz SEU ve LUH cDNA içine sırasıyla 3 pUC19 SPYNE ve pUC19 SPYCE, klonlanmış. İkili vektörler Agrobacterium dönüşüm için çok büyük ve bombardıman için uygunsuz. II. Kartuş hazırlık Kartuş hazırlık plazmid DNA ve daha sonra gen tabancası kartuşu sahipleri yüklenebilir yarım inç uzun parçalar halinde kesilmiş plastik boru içine yükleme kaplama altın parçacıkları içerir. Kartuş hazırlanması ayrı bir Jüpiter 4. maddesi çok detaylı olarak açıklanan ve bu yüzden burada açıklanan olmasıdır . Soğan hücreleri bombardıman için, biz, 12.5 mg ile 1 mg DNA/0.25 mg altın / kartuş 50 kartuşları hakkında verimleri hazırlık başına altın parçacıkları, plazmid DNA 50 mg karıştırma önerilir. Her kartuş, bir çekim için. Altın parçacıkları çapı 0.6 mm veya 1.0 mikron (Biorad Kedi # 1.652.262 ya da Cat # 1.652.263) ya olabilir. Ayrıca kartuş hazırlanması için 0.5 mg / ml PVP çözüm kullanmanızı öneririz. BiFC için, olası etkileşim ortağı aynı kartuş hazırlanmasında her iki plazmid DNA&#39;lar birleştirir. Kartuş hazırlanmasından sonra, bir Petri kabı sarılı bir kare Parafilm içine helyum basınç altında, 150 ila 200 psi arasında yeni yapılan kartuşları ateş kartuşları test etmek için önemlidir. Altın parçacıkları kartuşları verimli hareketli olabilir, bu test edecek; Parafilm soluk altın parçacıkları görmelisiniz. Bu alanın her çekimde kapsayacak bir fikir verir. Farklı helyum basıncı (150-200 psi aralığında) Parafilm üzerine yürür altın parçacıkları farklı miktarlarda fark edebilirsiniz. Anlamlı bir fark varsa, bombardıman için düşük basınç seçin. III. Soğan dokuların hazırlanması Çekim gününde, büyük bir sarı soğan dış deri soyulabilir. Temiz ve keskin bir jilet kullanarak yaklaşık 2 X 8 cm, derin bir dikdörtgen alan 4-5 kesilmiş katlar. Dikdörtgen soğan dokusu dışarı atın dış iki kat atmak, 2x1.5 cm parçalar halinde kalan katmanları soğan kesmek. Steril su ile ıslatılmış filtre kağıdı (whatman 3MM kağıt daireler halinde kesilir) içeren bir Petri kabındaki soğan parçalarını yerleştirin. Petri kabı Kapak ve onlar gitmek için hazırsınız. IV. Bombardıman <ol><li> Beyaz yuvarlak kartuş sahipleri kartuşları yükleyin. Kartuşları farklı plazmid yapıları içeren farklı bir kartuş sahipleri yüklenmiş olması gerekir. Her kartuş tutucu 12 çekimler için 12 kartuş kadar tutabilir. </li><li> Helios Gen Tabancası içine pil ve taze varil gemisi yerleştirin. Namlu astar ve silah hem de bağlı o-ringler ilgili olduğundan emin olun. </li><li> İlk olarak, kartuş tutucu tabancanın üst bakan işareti # 12 ile boş bir kartuş sahibi, gen tabancasının içine yerleştirin. Advance kartuş tutucu bir veya iki kez doğru takılı olduğundan emin olun. </li><li> Helyum tank silahı takın ve 150 ila 200 psi arasındaki basınç ayarlayın. </li><li> Silah odasında temiz ve boş kartuş tutucu basıncı sabit olduğundan emin olmak için, kulak koruma ve yangın silah birkaç kez giyin. </li><li> Boş kartuş yuvasını çıkarın ve yüklü bir kartuş tutucuya yerleştirin. Yangın istediğiniz kartuş kartuş tutucu (6 saat) alt kısmında konumlandırılmış böylece kartuş tutucu ilerletin. Burada bir parça soğan Atış, negatif kontrol için arka plan floresan bir form sağlar. </li><li> Yukarı bakacak şekilde soğan en iç tabakası ile boş bir Petri kabı orta soğan parçalarını yerleştirin. Petri kabı gen tabancası varil liner Dinlenme ve tetiği çekerken yan düğmesini basılı tutarak tüfek ateşiyle. Nemli 3MM filtre kağıdı içeren Petri bombardıman soğan aktarın. </li><li> Sonraki kartuş Advance ve farklı bir soğan parçası ateş. 4-5 adet soğan vurdu kadar bu adımı yineleyin. Her soğan parça bir kez vurulur. </li><li> Farklı bir plazmid veya farklı plazmid kombinasyonu içeren kartuşlar yüklü farklı bir kartuş sahibine değiştirin. Bir varil liner değiştirmeyi unutmayınler de bulaşmasını önlemek için. 04:56 soğan adet çekin. </li><li> Bombardımanından sonra, perti yemekleri tüm soğan dönün. Petri kapları kapakları ile kaplayın. Kurumasını önlemek için onları Parafilm ile sarın. Soğan adet oda sıcaklığında 16-48 saat boyunca karanlıkta inkübe edin. </li><li> Helyum tankı gen tabancası ayrılmakta önce gaz ve serbest basınç kapatın. Sökün varil liner, kartuş tutucu ve kullanılan veya kullanılmayan kartuşları çıkarın. </li><li> Temizleme sabunlu su ile bir behere daldırarak kartuşu sahipleri ve varil gömlekleri. Banyo sonikatör behere koyun ve 20 dakika sonikasyon. Daha sonra, tüm sabun artıkları çıkarmak için su ile durulayınız. % 70 etanol içinde bir saat bekletin ve sonra kağıt havlu üzerinde kurutun. </li></ol> V. Gözlem <ol><li> Oda sıcaklığında 16-20 saat boyunca bombardıman soğan adet kuluçka sonra, biz bu çalışmada kullanılan Zeiss Axio Observer.z1 gibi bir floresan mikroskop kullanılarak GFP veya YFP floresan izleyebilirsiniz. </li><li> Yavaş için soğan iç epidermis (bombardımanı sırasında silah doğrudan karşı karşıya katman) kapalı bir tek hücre tabakası kabuğu düz uçlu forseps kullanın. Slayt üzerinde bir damla su üzerine kabuğu koyun. Lamel ekle ama kabarcıkları en aza indirmek için dikkatli olun. </li><li> Parlak alan mikroskobu altında, ilk sitoplazmik akışı için kontrol hücreler canlı olduğundan emin olmak için. Bunu yapmak için, hareketli plastidlerin bakın sonra soğan doku ısınmak için bir kaç dakika boyunca parlak bir alan ışık slayt ortaya çıkarmak ve. Sitoplazmik akış görmek için her zaman kolay değildir, bu yüzden herhangi bir göremiyorsanız cesareti alamadım. </li><li> Floresan tespiti için, GFP veya YFP için uygun uyarma ve algılama filtreleri kullanın. Olmayan bir floresan plazmid ile çekilmiş soğan parçaları gibi negatif kontroller dahil etmek önemlidir. Soluk sarı sinyalleri yaralı hücreleri, hava kabarcıkları veya enkaz görünebilir. Pozitif kontrol için de önemlidir. 35S gibi bir plazmid içeren yapısal ifade floresan muhabiri: GFP mükemmel bir pozitif kontrol. Soğan epidermal hücreler (Şekil 1A, D) Görünür GFP sinyalleri kartuşları, soğan doku ve gen tabancası ateş hazırlanır ve yürütülür. : SEU pSPYNE ve 35S:: LUH pSPYCE DNA&#39;lar Daha sonra, biz 35S bir karışımını içeren kartuşlar ile bombardımana soğan adet SEU pSPYNE ve LUH-pSPYCE arasındaki etkileşimleri gözlemledi. Faint YFP çekirdeğinde bulunan bölünmüş YFP parçaları bir araya getirdi SEU ve LUH arasında doğrudan fiziksel bir etkileşim gösteren floresan sadece çekirdeğinde, (Şekil 1 B, E) gözlenmiştir. : GFP: BiFC YFP sinyal 35S GFP sinyale göre önemli ölçüde daha zayıf olduğunu unutmayın. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Bizim çalışmamızda, burada 35S bildirdi: plazmid GFP pozitif kontrol kapalı çekirdek ve sitoplazma (Şekil 1A, D) her ikisi de dahil olmak üzere tüm hücre, doldurur güçlü floresan verir. GFP protein kadar küçük bir nükleer lokalizasyon sinyal olmadan çekirdeği diffüz. Buna karşılık, SEU ve LUH, daha önce bir maya iki hibrit tahlil 2 etkileşim gösterilmiştir iki Arabidopsis transkripsiyonel faktörler . SEU-pSPYNE (SEU YFP N-terminal parçası erimiş) ve LUH-pSPYCE (SEU YFP N-terminal parçası erimiş), çekirdeğin içine diffüz nükleer lokalizasyon sinyaller içeren 2,5 hem de çok büyük. Soğan hücre çekirdeği (Şekil 1 B, E) tespit YFP floresan sinyal SEU pSPYNE ve LUH-pSPYCE soğan çekirdekleri etkileşim gösterir. YFP ve LUH-pSPYCE (Şekil 1C, F), N-terminal parçasını içeren vektör plazmid pSPYNE plazmid karışımı ile bombardımana soğan yok floresan sinyal tespit edilir. BiFC aracılı YFP floresan 35S GFP-aracılı floresan göre anlamlı derecede zayıf: GFP plazmid. Bizim çalışmamızda, onlar da (B) Şekil 1A karşılaştırmak farklı hücre içi lokalizasyonu gösterdi. Ayrıca, her iki ortak plazmid başarıyla girer ve aynı soğan hücreleri ifade BiFC sadece eser olarak floresan hücrelerinin sayısı, BiFC için oldukça düşüktür. <img src="/files/ftp_upload/1963/1963fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Floresan (A, B, C) ​​ve parlak bir alan (D, E, F) soğan hücreleri görüntüleri farklı plazmid yapıları ile bombaladı. (A) ve (D), Soğan hücreleri 35S ile bombaladı: GFP. GFP sitoplazma ve çekirdek boyunca yayılır. (B) ve (E), Soğan hücreleri 35S eşit molar karışımları ile bombardıman: SEU-pSPYNE (SEU YFP N-terminal parçası erimiş) ve 35S: LUH pSPYCE (LUH C-terminal parçası için erimiş ) plazmid DNA. SEU-pSPYNE ve LUH pSPYCE arasında bir etkileşim, bir floresan çekirdeği tarafından gösterilir. (C) ve (F), soğan hücreleri gösteren bir negatif kontrol vektör pUC19 SPYNE ve LUH pSPYCE plasmi karışımları ile bombaladıds. Yok floresan sinyal tespit edilmiştir.

<ol>
	<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).</li><li>Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LEUNIG_HOMOLOG+and+LEUNIG+perform+partially+redundant+functions+during+Arabidopsis+embryo+and+floral+development.">LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development.</a> Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).</li><li>Walter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).</li><li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture.">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEUSS+and+AINTEGUMENTA+mediate+patterning+and+ovule+initiation+during+gynoecium+medial+domain+development.">SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development.</a> Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).</li><li>Zhang, X. N., Mount, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+alternatively+spliced+isoforms+of+the+Arabidopsis+SR45+protein+have+distinct+roles+during+normal+plant+development.">Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).</li></ol>

<ol><li> GFP veya 35S:: GUS ilk kez kullanıcılar için, biz böyle 35S gibi tek bir plazmid kurucu muhabiri, kartuş hazırlanması gözlem, tüm prosedürü uygulamak öneririz. Biz 35S kullandı: plazmid GFP elde edilen Dr. Steve Mount ve Xiaoning Zhang 6 (Şekil 1A, D). RioRad (Kedi 165-2244) satılan gen atış kontrol kartuşları bitkiler için uygun değildir. </li><li> BiFC için, ikinci bir pozitif kontrol sırasıyla YFP C-terminal ve N-terminal parçalara kaynaşmış iki bilinen etkileşim ortakları, oluşmalıdır ger...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Yellow onion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any supermarket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios Gene Gun</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss, Nikon, Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bimolecular fluorescence complementation (bifc) assay for protein-protein interaction in onion cells using the helios gene gun

Çeşitli organizmaların gen fonksiyonu incelenmesi gen ürünleri, normal hücresel bir ortamda birbirleri ile nasıl etkileşimde bilgisine dayanmaktadır. Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) Testi<sup&gt; 1</sup&gt; Araştırmacılar, canlı hücreler protein-protein etkileşimleri görüntülemenizi sağlar ve önemli bir araştırma aracı haline gelmiştir. Bu testte, her bir potansiyel etkileşen protein ortak erimiş bir floresan protein (GFP) iki parça kolaylaştırdı ilişkisi üzerine dayanır. Iki protein ortakları etkileşim floresan yol açan, N-terminal ve C-terminal GFP parçası dernek kolaylaştıracaktır. Bitki araştırmacılar için, soğan epidermal hücreler, soğan dokuların elde edilmesi ve hazırlanmasında kolaylık ve minimum eşiğe floresan doğrudan görselleştirme BiFC tahlil yapılması için ideal bir deneysel sistem. Helios Gen Tabancası (BioRad) yaygın soğan hücreleri plazmid DNA bombardıman için kullanılır. Kullanımı iki etkileşim için plazmid yapıları tanıtmak Gen Tabancası Helios göstermektedir.<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Transkripsiyon faktörleri, Seuss (SEU) ve Leunig homolog (LUH)<sup&gt; 2</sup&gt; Ve soğan epidermal hücreler BiFC aracılığı ile kendi etkileşimlerinin görselleştirme.

Watch this Scientific Journal Video about Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun at JoVE.com

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bu makale BioRad düzgün soğan epidermal hücrelerin içine plazmid DNA tanıtmak için Helios Gen Tabancası ve nasıl Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) ilkesine dayalı soğan hücreleri protein-protein etkileşimleri test etmek için nasıl kullanılacağını göstermektedir

Helios Gen Tabancası kullanarak Soğan Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) Testi

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

bimolecular-fluorescence-complementation-bifc-assay-for-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

19.5K Görüntüleme.  University of Maryland. Bu makale BioRad düzgün soğan epidermal hücrelerin içine plazmid DNA tanıtmak için Helios Gen Tabancası ve nasıl Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) ilkesine dayalı soğan hücreleri protein-protein etkileşimleri test etmek için nasıl kullanılacağını göstermektedir

Video: Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gen tabancası Transfeksiyon Hipokampal Nöronlar

Biyoloji

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed protocol for biolistic transfection of rat hippocampal slices, from the initial preparation of DNA coated bullets to the final shooting of the organotypic slice cultures using a gene gun. Gene gun transfection is an efficient and easy means of transfecting neurons and is especially useful for fluorescently labeling a small subset of cells in tissue slice. In this video, we first outline the steps required to coat gold particles with DNA. We next demonstrate how to line the inside of plastic tubing with the gold/DNA bullets, and how to cut this tubing to obtain the plastic cartridges for loading into the gene gun. Finally, we perform biolistic transfection of rat hippocampal slice cultures, demonstrating handling of the Bio-Rad Helios gene gun, and offering trouble shooting advice to obtain healthy and optimally transfected tissue slices.  

We describe a method for preparing DNA coated gold bullets and demonstrate the use of such bullets to biolistically transfect neurons in cultured hippocampal slices.

Gen Tabancası İşaretleri ve Dilim Kültür Nöronlar Biyolistik Transfeksiyon hazırlanması

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

Bimoleküler Floresan tamamlama

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

Bimoleküler Floresan tamamlama akışı Sitometrik Analizi: Protein-protein etkileşim Eğitim Bir Yüksek Verimli Kantitatif Yöntemi

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Bir nanometre Hassasiyet Floresans Görüntüleme (Fiona)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...