وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة من RO1 والمراجعات تقدير من دائرة البحوث VA - إلى C. طن متري ، وNRSA الفردية إلى CWL

اعتبارات التصميم العامة إذا كان الطول الموجي من التحفيز الصورة هي في حدود واضحة ، مثل optogenetic للتجارب ، والتخطيط لنظام يكون أبسط بكثير من التحليل الضوئي للتجارب الأشعة فوق البنفسجية. يحتاج المرء فقط لشراء كاميرا مزدوجة المنفذ وحدة ما هو متاح من جميع الشركات المجهر. يمكن وضعه على متن الطائرة نائب العضو المنتدب في الطائرة صورة المتقارن إما واحدة من الموانئ كاميرا اثنين. ولكن يجب أن يكون للأشعة فوق البنفسجية في التحلل الضوئي جلبت ضوء مصدره DMD في المسار من خلال برنامج التحصين الموسع ، الإضاءة (الشكل 3A) ، لأنه لم يتم تصحيح عدسة التصوير أنبوب مما يؤدي إلى الكاميرا لطول موجة الأشعة فوق البنفسجية في أي من المجاهر متاحة تجاريا. والزيغ الكروي للعدسة التصوير أنبوب في 350 نانومتر شديدة بما فيه الكفاية لمنع القدرة على تركيز الضوء على بقعة ضيقة ولتوليد ما يكفي من القرار المكانية. لم يتم مواجهة هذه المشكلة في المجهر مبائر لأن إزالة العدسة أنبوب عندما يتم إحضارها شعاع ليزر على طول محور موازى في البصري نفسه. ويمكن حل مشكلة الإضاءة فوق البنفسجية التي تجلب في ضوء المسار من خلال برنامج التحصين الموسع ، فلوري لأن كل العدسات أنبوب هناك تصحيح انحراف جزئيا عن كروية في الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية. يمكننا التوسع في البصريات من المجاهر إلى أي درجة يرغب المجلة. الأوساط العلمية المهتمة في عامة وسريعة في هذا الموضوع وليس هناك العديد من المصادر أن يعلم ذلك جيدا. من أجل تقليل التعديلات المجهر وبسبب ضيق المساحة الضيقة في وحدة البرنامج الموسع للتمنيع ومضان ، يوضع على طائرة DMD الصورة المزدوجة التي أنشئت حديثا إنشاؤها بواسطة عدسة التتابع (نشير إلى الموقف من وحدة DMD في ما يتعلق ميكروسكوب). الأشعة فوق البنفسجية A تصحيح التجارية تم شراؤها تتابع عدسة (بصريات التخصص) (النقطة في الرسم البياني وعلى المجهر). الإضاءة لDMD لدى استقباله مدخلاته ثنائي يمكن micromirror التبديل بين الايجابية والسلبية لمدة 12 ° الميل النسبي لطائرة من الرقاقة. محور الدوران هو طول كل الزوايا المائلة مرآة (45 درجة على الجانبين من الشريحة). تم تعيينه لاتجاه دوران المرآة التي كتبها مثلث بلون الذهب في زاوية واحدة على السطح الأمامي للرقاقة. زاوية الميل للاملاءات micromirror محاذاة الملعب وazithmus من شعاع الإضاءة واردة. الملعب من شعاع الإضاءة يحتاج إلى 24 درجة من المحور العمودي للرقاقة DMD والاحتياجات azithmus أن يكون عمودي على محور دوران المرآة. دقة محاذاة الشعاع هو أمر حاسم لعملية فعالة. في نموذج أولي لنظام قمنا بتصميم عدة تعديلات الميل اليدوية التي سمحت لنا لتصحيح أوجه القصور تصميم وتصنيع الآلات. وأدى ذلك إلى النظام الذي هو أكثر بكثير مما هو ضروري الضخمة. بديل ، وترتيب أكثر إحكاما لتحقيق ذلك في ضوء ممكن (إظهار تصميم بديل إذا ما تراه مفيدا). التحلل الضوئي للتجارب مطلوب مصدر الليزر لتوليد شعاع ضوء ارتفاع كثافة تركز اللازمة لuncaging السريع. للتجارب optogenetic حيث لا يشترط ضوء ارتفاع كثافة وتركيز حاد ، ومصدر ضوء غير متماسكة تكون كافية. التحلل الضوئي في التجربة الموصوفة هنا استخدمنا الصمام الثنائي شبه المستمر ضخ الحالة الصلبة (DPSS) ثلاث مرات NdVO4 تردد الليزر (1 واط و 355 نانومتر). (للاطلاع على مناقشة مفصلة لاختيارات مصادر الضوء للتحلل الضوئي أنظر المرجع 2). مطلوب ليزر عالية الطاقة نسبيا في التجارب المذكورة هنا ليتم تسليمها في الواقع سوى جزء صغير من الانتاج ليزر لالعينة عند استخدام نظام DMD. كمية الضوء تسليمها الى العينة يتناسب مع نسبة عدد ON / OFF المرايا داخل المنطقة المضاءة بواسطة شعاع ليزر. إذا كنت بحاجة لمصدر ضوء الليزر ، فمن الأفضل لبدء انتاج الليزر في الألياف المتعدد بحيث يمكن بسهولة موقف وموجهة على طول المحور الصحيح من أجل إلقاء الضوء على DMD. يحيل بها الضوء عبر الألياف الضوئية يحل المشكلة الثانية ، وكيفية القضاء على أنماط رقطة الملازمة لإنارة متماسكة. وجرح نحو محفة الألياف الألياف كهرضغطية (طراز 915 ، والتهوية والأبحاث الكندية المحدودة) التي تتأرجح عند 40 كيلوهرتز ~. (نقطة في هذه الحفار) والمجهرية التي تمتد من الالياف هي كافية لنقل رقطة نمط مرات عديدة خلال فترة الالف من كل صورة نبض التحفيز ، وبالتالي القضاء على نحو فعال من تأثير التنقيط. وموازى ثم خرج من الألياف البصرية مع الهدف المجهر الأشعة فوق البنفسجية (أوليمبوس DApo20UV). (أشير إلى هذه النقطة) ويرد معايرة القرار البصري للنظام في الشكل. 3B. القرار الفعال الفسيولوجية مقاسا سعة التدفق الحالي بوصفها وظيفة من موقف البقعة من الصورةهو مبين في الشكل التحفيز. 3C. موضحة الاستجابات الحالية لضوئي من كثافات مختلفة في الشكل. 3D. تشغيل النظام : شارك في تسجيل بكسل CCD مع المرايا DMD وقد كتب أحد البرامج في المنزل الذي يحدد المراسلات من المرايا DMD فردية محددة إلى بكسل للكاميرا CCD التصوير. الرسومات واجهة المستخدم (GUI) ضمن هذا البرنامج يسمح للمستخدم ثم تعيين المرايا DMD الذي يتوافق مع المنطقة على الصورة CCD الموسومة بواسطة الفأرة. وبالتالي ، يمكن الموسومة الموقع لتحفيز الصورة بمجرد تحريك المؤشر على الصورة المعروضة على شاشة الكمبيوتر والنقر على المنطقة الموسومة المصالح. (سوف تظهر صورة لجذع الفلورسنت شجيري على شاشة الكمبيوتر. الطلابية سيمثل عدد من المواقع أكثر من الصورة على شاشة الكمبيوتر.) البرمجة الأنماط لتسليم الخفيفة يتم تخزين نمط ملحوظ على شاشة الكمبيوتر من قبل المشغل على شكل سلسلة من الصور منفصلة. ثم يتم برمجة توقيت نبضات الليزر لكل نمط المكاني في البرنامج والتي تتكامل مع برنامج الحصول على البيانات (pClamp). (تثبت ذلك). تنسيق نبضات الليزر إلى أنماط DMD برنامج الحصول على البيانات يبدأ وينسق توقيت الالكترونيات DMD ، وتبوب من الليزر ، والحصول على التصحيح فرضت الإشارة الكهربائية من الخلايا العصبية المستهدفة. (محاكاة هذا التسلسل على الكمبيوتر) البيانات التجريبية : غير الخطية عبر جمع نقاط القاصي فرع شجيري وقد جرت العادة على التكامل مع أقطاب شجيري نفذت من خلال تغيير السعة من التحفيز في مواقع منفصلة بدلا من توسيع مجال التحفيز مع الحفاظ على كثافة ثابتة. يمكن للمسائل المتعلقة تشبع electrogenesis وتوظيف قنوات الموقع يعتمد التأثير على النتيجة والاستنتاج. ويمكن تحفيز شجيري توزيع تنفيذها بسهولة باستخدام نظام يستند DMD (الشكل 4A). وتفاوتت شدة المدخلات عن طريق زيادة عدد البقع من ضوئي. يمكننا أن نرى أن الجمع المكاني يمكن أن تكون غير خطية عبر نقاط فرع يتزايد فوق خطي مع زيادة سعة الإدخال وصوله إلى فروع ابنة اثنين. وتوسطت إلى حد كبير فوق الخطي مستقبلات NMDA وعدم الجهد قنوات بوابات (الشكل 5) ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. عملية لmicromirrors في DMD. (عرض الجانبية) التي تستهدف قوات كهرباء المرايا الفردية يؤدي إلى إمالة المرآة في واحد من اثنين من التوجهات المحتملة 12 درجة من الأفقي. في موقف بشأن توجه شعاع عمودي الحادث على طول المحور البصري للرقاقة. في موقف OFF يتم توجيه شعاع الحادث 48 ° محور قبالة. يتم توجيه الضوء الذي يضرب رقيقة الفجوات بين المرايا 24 درجة قبالة المحور. (عرض أعلى) الميل يتجه 45 درجة فيما يتعلق الجانبين من المرايا ورقاقة. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. التخطيط الأساسي للالمجهر الفلورسنت الحديثة. يتم وضع المكعب التصفية في &quot;الفضاء اللانهاية&quot; بين الهدف والعدسة الأنبوب. هناك مسار التصوير الذي يؤدي الى الكاميرا ، وهناك مسار الإضاءة التي تجمع الضوء على العينة. العدسة أنبوب لهذه الطريق ضوء هما عادة مختلفة في التصميم والبعد البؤري. الإضاءة ، ولكن ليس في التصوير ، وهو مصمم لتشغيل أنبوب العدسة في طيف الأشعة فوق البنفسجية. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. الأشعة فوق البنفسجية لنظام تخطيط يستند DMD. إذا كانت الإضاءة في الطيف للأشعة فوق البنفسجية ، ثم يجب أن يقدم من خلال عدسة الأنبوب الذي يتم تصحيح للأشعة فوق البنفسجية. لم يتم تصميم العدسة في مسار أنبوب التصوير للأشعة فوق البنفسجية. هناك حاجة إلى نظام الترحيل إلى خلق صورة المتقارن يمكن الوصول إليها بسهولة الطائرة. يتم وضع علامة على صورة مختلفة المتقارن طائرات في المجهر من قبل الخطوط الحمراء المنقطة. ومن المتوقع أن أنماط مشرق في صورة واحدة في الطائرة المتقارن طائرات أخرى. أثناء التصوير من المتوقع أن النمط السائد في الطائرة على عينة كاشف / الكاميرا. لإنارة يتوقع أن نمط إنشاؤها بواسطة DMD على العينة. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. التخطيط لإسقاط نظام الضوء المرئي DMD. إذا كانت الإضاءة الخفيفة هي في حدود واضحة ، فمن الممكن لجعل نائب العضو المنتدب للنمط ضوء تولد عن طريق التصوير مسار الضوء. ويمكن تنفيذها بسهولة مع هذا commerciشركة ميناء الكاميرا المزدوجة والتجهيزات المناسبة المرآة مزدوج اللون. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5. القرار الجانبي للنظام. (أ) القرار الضوئية على الهدف هو الفلورسنت ~ 2 ميكرون. (ب) القرار الفعال مقاسا من التحلل الضوئي الغلوتامات قفص عبر تغصن هو ~ 5 ميكرون. المسافة زادت بسبب وجود مزيج من نشر الغلوتامات وعرض محدود للتغصن. (ج) يمكن التحلل الضوئي حركية تحاكي الأحداث متشابك. فرضت عائلة الجهد الاستجابات الحالية يرجع إلى الاختلافات في الطاقة الضوئية تسليمها إلى تغصن. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig6.jpg" alt="الشكل 6" /> الشكل 6 : عدم الجمع بين خطي نقطة فرع شجيري. (أ) يتم تطبيق المدخلات الموزعة إلى فرعين شجيري بشكل منفصل. وترد ردودها الجهد منهما أدناه. (B) ثم يتم إعطاء محفزات في الوقت نفسه. استجابة قياس (أحمر التتبع) مختلفة من مجموع العمليات الحسابية من الاستجابات الفردية two (رمادي التتبع). <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig7.jpg" alt="الشكل 7" /> الشكل 7. Supralinear هو الجمع NMDA مستقبلات التابعة. (A) APV ، ومستقبلات NMDA انتقائية خصم بحظر الجمع supralinear. (ب) يتم رسم العلاقة شدة حساسيتها والتحفيز لمستقبلات NMDA.

<ol>
	<li>Scanziani, M., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930-939 (2009).</li><li>Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolysis+of+caged+neurotransmitters:+Theory+and+procedures+for+light+delivery.">Photolysis of caged neurotransmitters: Theory and procedures for light delivery.</a> Curr. Prot. Neurosci. , 6.21.1-6.21.12 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+Technology+Feature,+Cell+imaging:+Light+activated.">Nature Technology Feature, Cell imaging: Light activated.</a> Nature. 456, 826-827 (2008).</li><li>Lutz, C., Otis, T. S., DeSars, V., Charpak, S., DeGregorio, D. A., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+photolysis+of+caged+neurotransmitters.">Holographic photolysis of caged neurotransmitters.</a> Nature Methods. 5, 821-827 (2008).</li><li>Hornbeck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Digital Light Processing and MEMs: An overview. , .</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ميزة DMD نهج ضوئي يستند على ما يبدو لمعظم الحالات التي يكون فيها الهدف وتحتل مساحة واسعة نسبيا. إذا كان الهدف من الفائدة صغيرة جدا ، مثل العمود الفقري شجيري قليلة ، وأنظمة المسح المتسلسل مبائر و 2 الفوتون ومن المحتمل أن يكون النهج الأفضل. إحدى نقاط ضعف كبيرة في نهج DMD هو ?...

Erratum: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Modern upright fluorescent microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD camera and image acquisition software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Computer and data acquisition/interface system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DLP Discovery Developer Kit </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ALP3 USB interface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>S2 + Optics w/LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dual camera port unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DPSS Laser Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser shutter Model LS6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Uniblitz</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Canadian Instrument and Research, Ltd </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>100 um core multimode fiber</td>
</tr>
<tr>
<td>Multimode Fiber launcher </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Oz Optics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Signal generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>up to 50 kHz</td>
</tr>
<tr>
<td>Beam collimator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>DApo20UV340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UV relay lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Special Optics</td>
<td>#: 54-25-60-355</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

patterned photostimulation with digital micromirror devices to investigate dendritic integration across branch points

الضوء هو وسيلة مرنة ودقيقة للسيطرة على استثارة العصبية. وقد أدى إدخال الأخيرة من المستجيبات الحساسة للضوء مثل قناة رودوبسين والنواقل العصبية في قفص للمصالح في تطوير وسائل أفضل للسيطرة على أنماط الضوء في المكان والزمان التي هي مفيدة لعلم الأعصاب التجريبي. استراتيجية واحدة التقليدية ، المستخدمة في المجهر مبائر و 2 الفوتون ، هو تركيز الضوء على بقعة محدودة والحيود ثم تفحص تلك البقعة واحد بالتتابع على المنطقة من الفائدة. هذا النهج يصبح مشكلة اذا مناطق واسعة يجب أن تكون ضمن إطار تحفيز فترة وجيزة ، وهي مشكلة أكثر مما ينطبق على ضوئي للتصوير. استراتيجية بديلة لإكمال المشروع نمط المكاني على الهدف بمساعدة جهاز micromirror الرقمية (DMD). نهج DMD جذابة لأن مكونات الأجهزة غير مكلفة نسبيا ، ومعتمد من قبل المصالح التجارية. لأن مثل هذا النظام غير قابل للمجاهر تستقيم ، وسوف نناقش هذه القضايا الحاسمة في بناء وتشغيل مثل هذا النظام DMD. على الرغم من أننا سوف تصف في المقام الأول على بناء نظام للتحلل الضوئي للأشعة فوق البنفسجية ، سيتم أيضا التعديلات لبناء نظام أبسط بكثير الضوء المرئي للتجارب optogenetic تقديمها. تم استخدام نظام التحليل الضوئي للأشعة فوق البنفسجية إلى وقوف تجارب لدراسة المسألة الأساسية في علم الأعصاب ، وكيف يتم توزيعها مكانيا المدخلات المتكاملة عبر نقاط القاصي فرع شجيري. وتشير النتائج إلى أن الاندماج يمكن أن يكون غير الخطية عبر نقاط فرع وساطة إلى حد كبير عن طريق المستقبلات NMDA supralinearity.

Watch this Scientific Journal Video about Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points at JoVE.com

Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

يمكن الرقمية micromirror الأجهزة (DMD) توليد أنماط معقدة في الزمان والمكان الذي السيطرة على استثارة العصبية. وتتم مناقشة القضايا ذات الصلة لبناء وتصميم وتشغيل نظم DMD. مكن هذا النظام تظاهرة غير خطية التكامل عبر نقاط القاصي فرع شجيري.

منقوشة ضوئي مع أجهزة رقمية Micromirror بالتحقيق في تكامل شجيرى عبر نقاط فرع

Light is a versatile and precise means to control neuronal excitability. The recent introduction of light sensitive effectors such as channel-rhodopsin ...

patterned-photostimulation-with-digital-micromirror-devices-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.5K Views.  University of Maryland School of Medicine. يمكن الرقمية micromirror الأجهزة (DMD) توليد أنماط معقدة في الزمان والمكان الذي السيطرة على استثارة العصبية. وتتم مناقشة القضايا ذات الصلة لبناء وتصميم وتشغيل نظم DMD. مكن هذا النظام تظاهرة غير خطية التكامل عبر نقاط القاصي فرع شجيري.

Video: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

إنشاء ثنائي الأبعاد ركائز منقوشة على الحبس البروتين والخلايا

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. Additionally, traversing cellular barriers in the body is crucial for both oral delivery of therapeutic NCs into the circulation and transport from the blood into tissues, where intervention is needed. NC transport across cellular barriers is achieved by: (i) the paracellular route, via transient disruption of the junctions that interlock adjacent cells, or (ii) the transcellular route, where materials are internalized by endocytosis, transported across the cell body, and secreted at the opposite cell surface (transyctosis). Delivery across cellular barriers can be facilitated by coupling therapeutics or their carriers with targeting agents that bind specifically to cell-surface markers involved in transport. Here, we provide methods to measure the extent and mechanism of NC transport across a model cell barrier, which consists of a monolayer of gastrointestinal (GI) epithelial cells grown on a porous membrane located in a transwell insert. Formation of a permeability barrier is confirmed by measuring transepithelial electrical resistance (TEER), transepithelial transport of a control substance, and immunostaining of tight junctions. As an example, ~200&#160;nm polymer NCs are used, which carry a therapeutic cargo and are coated with an antibody that targets a cell-surface determinant. The antibody or therapeutic cargo is labeled with 125I for radioisotope tracing and labeled NCs are added to the upper chamber over the cell monolayer for varying periods of time. NCs associated to the cells and/or transported to the underlying chamber can be detected. Measurement of free 125I allows subtraction of the degraded fraction. The paracellular route is assessed by determining potential changes caused by NC transport to the barrier parameters described above. Transcellular transport is determined by addressing the effect of modulating endocytosis and transcytosis pathways.

Many therapeutic applications require safe and efficient transport of drug carriers and their cargoes across cellular barriers in the body. This article describes an adaptation of established methods to evaluate the rate and mechanism of transport of drug nanocarriers (NCs) across cellular barriers, such as the gastrointestinal (GI) epithelium.

نماذج وأساليب لتقييم نقل المخدرات نظم التسليم عبر الحواجز الخلوية

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

مستو التدرج نظام إنتشار المعنية بالتحقيق في الانجذاب الكيميائي في الكولاجين مصفوفة 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

تلفيق من Functionalized المغناطيسي البكتيرية Nanocellulose مع أكسيد الحديد النانوية

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and provide information for follow-up treatment. Here, we demonstrate the development of a cotton-based urinalysis (i.e., nitrite, total protein, and urobilinogen assays) analytical device that employs a lateral flow-based format, and is inexpensive, easily fabricated, rapid, and can be used to conduct multiple tests without cross-contamination worries. Cotton is composed of cellulose fibers with natural absorptive properties that can be leveraged for flow-based analysis. The simple but elegant fabrication process of our cotton-based analytical device is described in this study. The arrangement of the cotton structure and test pad takes advantage of the hydrophobicity and absorptive strength of each material. Because of these physical characteristics, colorimetric results can persistently adhere to the test pad. This device enables physicians to receive clinical information in a timely manner and shows great potential as a tool for early intervention.

To investigate simple fabrication approaches for multiple assay needs, we created a fluid-absorbing channel system made of cotton material. This device was used to establish a multiple detection platform, and solve contamination issues that commonly affect lateral flow-based biomedical devices, for clinical urinalysis of nitrite, total protein, and urobilinogen.

افتعال القطن الأجهزة التحليلية

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

باستخدام لاصق الزخرفة لانشاء 3D ورقة أجهزة ميكروفلويديك

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular cartilage impairs its load-bearing function substantially as it experiences tremendous chemical degradation, i.e. proteoglycan loss and collagen fibril disruption. One promising way to investigate chemical damage mechanisms during OA is to expose the cartilage specimens to an external solute and monitor the diffusion of the molecules. The degree of cartilage damage (i.e. concentration and configuration of essential macromolecules) is associated with collisional energy loss of external solutes while moving across articular cartilage creates different diffusion characteristics compared to healthy cartilage. In this study, we introduce a protocol, which consists of several steps and is based on previously developed experimental micro-Computed Tomography (micro-CT) and finite element modeling. The transport of charged and uncharged iodinated molecules is first recorded using micro-CT, which is followed by applying biphasic-solute and multiphasic finite element models to obtain diffusion coefficients and fixed charge densities across cartilage zones.

We propose a protocol to investigate the transport of charged and uncharged molecules across articular cartilage with the aid of recently developed experimental and numerical methods.

والتجريبية وبروتوكول العناصر المحددة للتحقيق في نقل المواد المذابة المحايدة، واتهم في الغضروف المفصلي

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Soft Lithographic Procedure for Producing Plastic Microfluidic Devices with View-ports Transparent to Visible and Infrared Light

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable microfluidic devices. Here, a protocol for the fabrication of plastic microfluidic devices is demonstrated, where soft lithographic techniques are used to embed transparent Calcium Fluoride (CaF2) view-ports in connection with observation chamber(s). The method is based on a replica casting approach, where a polydimethylsiloxane (PDMS) mold is produced through standard lithographic procedures and then used as the template to produce a plastic device. The plastic device features ultraviolet/visible/infrared (UV/Vis/IR) -transparent windows made of CaF2 to allow for direct observation with visible and IR light. The advantages of the proposed method include: a reduced need for accessing a clean room micro-fabrication facility, multiple view-ports, an easy and versatile connection to an external pumping system through the plastic body, flexibility of the design, e.g., open/closed channels configuration, and the possibility to add sophisticated features such as nanoporous membranes.

A protocol for the fabrication of plastic microfluidic devices with transparent view-ports for visible and infrared light imaging is described.

الإجراء معدني لينة لإنتاج أجهزة موائع جزيئية البلاستيك مع عرض-منافذ شفافة للضوء المرئي والأشعة تحت الحمراء

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic respiration. However, the extent to which both pathways contribute to the landscape of cellular energy production is consistently overlooked. Transformed cells cultured in saturating levels of glucose often show a decreased dependency on oxidative phosphorylation for ATP production, which is compensated by an increase in substrate-level phosphorylation. This shift in metabolic poise allows cells to proliferate despite the presence of mitochondrial toxins. In neglecting the altered metabolic poise of transformed cells, results from a pharmaceutical screening may be misinterpreted since the potentially mitotoxic effects may not be detected using model cell lines cultured in the presence of high glucose concentrations. This protocol describes the pairing of two powerful techniques, respirometry and calorimetry, which allows for the quantitative and noninvasive assessment of both aerobic and anaerobic contributions to cellular ATP production. Both aerobic and anaerobic respirations generate heat, which can be monitored via calorimetry. Meanwhile, measuring the rate of oxygen consumption can assess the extent of aerobic respiration. When both heat dissipation and oxygen consumption are measured simultaneously, the calorespirometric ratio can be determined. The experimentally obtained value can then be compared to the theoretical oxycaloric equivalent and the extent of the anaerobic respiration can be judged. Thus, calorespirometry provides a unique method to analyze a wide range of biological questions, including drug development, microbial growth, and fundamental bioenergetics under both normoxic and hypoxic conditions.

This protocol describes calorespirometry, the direct and simultaneous measurement of both heat dissipation and respiration, which provides a noninvasive approach to assess energy metabolism. This technique is used to assess the contribution of both aerobic and anaerobic pathways to energy utilization by monitoring the total cellular energy flow.

كالوريسبيروميتري: اتباع نهج موسع، قوية للتحقيق في استقلاب الطاقة الخلوية

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

عالي الاستبانة "منقوشة استخدام الترسيب بيوفيلم" بدون-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...