עבודה זו נתמכה על ידי RO1 מ NIH וסקירות ההצטיינות של שירות המחקר של VA אל C.-MT ו NRSA הפרט CWL

עיצוב שיקולים כללי אם אורך הגל של גירוי תמונה נמצאת בטווח הנראה לעין, כגון ניסויים optogenetic, את הפריסה של המערכת יהיה הרבה יותר פשוט עבור ניסויים photolysis UV. צריך רק לרכוש מצלמה כפול יציאת מודול זמין מכל החברות מיקרוסקופ. המטוס DMD יכול להיות מוצב במרחק של המטוס תמונה המצומד של אחד אחד משני הנמלים המצלמה. אבל photolysis UV באור שמקורו DMD חייב להיות מובא דרך נתיב עלית תאורה (איור 3A), כי הצינור המוביל הדמיה העדשה המצלמה לא תוקנה על הגל UV בכל אחד מיקרוסקופים זמינים מסחרית. סטייה כדורית של העדשה צינור הדמיה ב 350 ננומטר הוא חמור מספיק כדי למנוע את היכולת למקד את האור לנקודה חזק כדי לייצר ברזולוציה מרחבית מספקת. בעיה זו לא נתקל מיקרוסקופיה confocal כי העדשה צינור מוסר כאשר קרן לייזר collimated הוא הביא לאורך ציר אופטי זהה. הבעיה של תאורה UV יכולה להיפתר על ידי להביא את האור דרך נתיב עלית פלורסנט כי העדשות צינור יש לתקן את כל חלקי סטייה כדורית באורך גל UV. אנחנו יכולים להרחיב על אופטיקה של מיקרוסקופים במידה כלשהי מבקשת העת. הקהילה המדעית היא עניין מהיר כללית בנושא זה ואין מקורות רבים אשר מלמדת את זה היטב. כדי למזער שינויים של המיקרוסקופ וגם בגלל אילוצי מקום הדוקה ביחידת עלית הקרינה, DMD ממוקם על המטוס החדש שנוצר תמונת המצומד שנוצר על ידי העדשה ממסר (להצביע על המיקום של יחידת DMD ביחס המיקרוסקופ). UV מסחרי לתקן עדשה ממסר נרכש (אופטיקה מיוחדים) (לציין זאת בתרשים על המיקרוסקופ). תאורה של DMD עם קבלת קלט בינארי שלה micromirror יכול לעבור בין חיובי שלילי 12 ° הטיה ביחס למישור של השבב. ציר הסיבוב הוא לאורך הפינות של כל מראה אלכסוני (45 ° עד צידי השבב). הכיוון של הסיבוב מראה מיועד ידי משולש בצבע זהב בפינה אחת על המשטח הקדמי של השבב. זווית הטיה של micromirror מכתיב את היישור של המגרש azithmus של קרן אור הנכנסת. ההגשה של הקורה תאורה צריך להיות ° 24 מ בניצב לציר של השבב DMD והצרכים azithmus להיות בניצב לציר הסיבוב של המראה. יישור קרן מדויקת היא קריטית לתפעול יעיל. במערכת אבטיפוס עיצבנו מספר התאמות להטות ידנית שאיפשרה לנו לתקן הליקויים בתכנון מכונות. זה הביא למערכת כי הוא הרבה יותר מגושמים הוא הכרחי. הסדר חלופי, קומפקטית יותר להבאת לאור אפשרי (הצג עיצוב חלופי אם יראו שימושי). על הניסויים photolysis מקור לייזר נדרש כדי ליצור את עוצמת אור גבוהה קרן ממוקדת הכרחי משחררות רפרוף מהיר. על הניסויים optogenetic שם אור בעוצמה גבוהה ממוקד בחדות אינו נדרש, מקור אור לא קוהרנטי יהיה הולם. במהלך הניסוי המתואר כאן photolysis העסקנו דיודה מעין רציף שאוב מצב מוצק (DPSS) תדירות שילש NdVO4 לייזר (1 ואט, 355 ננומטר). (לדיון מפורט של הבחירות של מקורות אור עבור photolysis לראות התייחסות 2). לייזר בהספק גבוה יחסית נדרש הניסויים שתוארו כאן, כי רק חלק קטן של פלט הלייזר מועברת בפועל הדגימה בעת שימוש במערכת DMD. כמות האור נמסר הדגימה הוא יחסי היחס של מספר ON / OFF מראות בתוך האזור מואר על ידי קרן לייזר. אם מקור אור לייזר נדרש, מוטב להשיק את הפלט של הלייזר לתוך סיב multimode כך ניתן בקלות המיקום לאורך הציר בכיוון הנכון עבור הארת DMD. העברת אור דרך סיב אופטי פותר הבעיה השנייה, איך לחסל את דפוסי רבב הטבועה תאורה קוהרנטית. סיבים הוא נכרך סביב אלונקה סיבים פיזואלקטריים (דגם 915, מכשור המחקר הקנדי &amp; בע&quot;מ) אשר נעה ב ~ 40 kHz. (נקודה אלה החוצה המתקן) מיקרוסקופיים מתיחה של סיבים די מעביר את דפוס רבב פעמים רבות במהלך משך אלפיות השנייה של הדופק בכל גירוי צילום, ובכך למעשה לבטל את ההשפעה של ככתמים. הפלט של סיב אופטי הוא collimated אז במטרה במיקרוסקופ UV (אולימפוס DApo20UV). (בשלב זה החוצה) כיול ההחלטה אופטי של המערכת מוצג באיור. 3B. ההחלטה פיזיולוגי יעיל, כפי שהיא נמדדת כפונקציה של המיקום של המקום של צילום משרעת של זרימת הזרםגירוי מוצג באיור. 3C. תגובות הנוכחית כדי photostimulation בעוצמות שונות מומחשים איור. 3D. מבצע של המערכת: Co-רישום CCD פיקסלים עם המראות DMD התוכנה in-house נכתב הקובע את ההתכתבות של מראות DMD הפרט פיקסלים ספציפיים של המצלמה הדמיה CCD. ממשק המשתמש הגרפי (GUI) בתוך מערכת זו מאפשרת למשתמש הקצה את מראות DMD התואם לאזור על התמונה CCD מתויג על ידי העכבר. לכן, המיקום לגירוי תמונה יכול להיות מתויג פשוט על ידי הזזת הסמן מעל התמונה המוצגת על מסך המחשב ולחיצה על אזור מתויג של עניין. (תמונה הניאון של סוכת הדנדריטים יוצג על מסך המחשב. הסטודנט יציין מספר מקומות מעל התמונה על מסך המחשב). תכנות דפוסי למסירה אור דפוס מסומן על מסך המחשב על ידי המפעיל מאוחסן כסדרה של תמונות נפרדות. העיתוי של פעימות לייזר לכל דפוס מרחבי מתוכנת מכן לתוך התוכנה אשר משולבת עם תוכנית רכישת נתונים (pClamp). (להוכיח זאת). תיאום פעימות לייזר לדפוסי DMD תוכנית הרכישה נתונים יוזם ומתאם את התזמון של האלקטרוניקה DMD, gating של הלייזר, ורכישת התיקון הידק האות החשמלי של הנוירון היעד. (לדמות זה רצף במחשב) ניסויית נתונים: שאינו ליניארי סיכום ברחבי דיסטלי נקודות סניף הדנדריטים שילוב דנדריטים עם אלקטרודות באופן מסורתי בוצעו על ידי שינוי משרעת של גירוי במקומות נפרדים ולא להרחיב את אזור הגירוי תוך שמירה על עוצמת מתמדת. סוגיות הנוגעות הרוויה של electrogenesis וגיוס ערוצי תלוי במיקום יכולים להשפיע על התוצאה והמסקנה. גירוי הדנדריטים מבוזר יכול להיות מיושם בקלות באמצעות מערכת המבוססת DMD (איור 4 א). עוצמת קלט היתה מגוונת על ידי הגדלת מספר נקודות של photostimulation. אנו יכולים לראות כי סיכום מרחבי יכול להיות שאינו ליניארי על פני נקודות הסניף הופך יותר ויותר לעיל ליניארי עם אמפליטודות קלט הגדלת המגיעים על שני סניפים בת. העל ליניאריות מתווכת בעיקר רצפטורים NMDA ולא מתח ערוצי מגודרת (איור 5) נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. מבצע של micromirrors ב DMD. (מבט צד) כוחות אלקטרוסטטיים מכוונים מראות הפרט לגרום המראה להיות מוטה באחד משני כיוונים אפשריים 12 ° מן האופקי. במצב ON קרן תקרית מופנית בניצב לאורך הציר האופטי של השבב. במצב OFF הקורה האירוע מכוון ציר 48 ° משם. אור שפוגע הפערים דק בין המראות מופנית ° 24 מעל ציר. (תצוגה למעלה) הטיה מכוונת 45 ° ביחס צידי מראות שבב. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. הפריסה יסוד של מיקרוסקופ פלואורסצנטי המודרנית. קוביה המסנן ממוקם בתוך &quot;מרחב האינסוף&quot; בין המטרה לבין העדשה צינור. יש שביל שמוביל הדמיה המצלמה ויש נתיב ההארה שמביא את האור המדגם. העדשה צינור עבור נתיב אור שני אלה הם בדרך כלל שונים בעיצוב של אורך המוקד. תאורה, אבל לא הדמיה, עדשה הצינור מיועד המבצע בספקטרום UV. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. פריסה של מערכת UV DMD מבוסס. אם התאורה היא בספקטרום UV, אז זה חייב להיות מובא מבעד לעדשה הצינור הוא תיקן עבור UV. העדשה צינור בנתיב הדמיה אינו מיועד UV. מערכת ממסר יש צורך ליצור דימוי נגיש מטוס המצומד. תמונה שונה המצומד מטוסים המיקרוסקופ מסומן על ידי קווים אדומים מנוקדים. דפוסי מוארת במישור תמונה אחת מוקרנים במטוסים המצומד אחרים. במהלך הדמיה דפוס במטוס מדגם מוקרנת על הגלאי / מצלמה. עבור תאורה דפוס שנוצר על ידי DMD היא מוקרנת על המדגם. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. פריסת מערכת הקרנת האור הנראה DMD. אם נורית תאורה נמצאת בטווח הנראה לעין, אפשר להביא את התבנית DMD האור שנוצר דרך נתיב האור הדמיה. זה יכול להיות מיושם בקלות עם commerciאל נמל כפול המצלמה קבצים מצורפים dichroic את המראה המתאים. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. ברזולוציה רוחבית של המערכת. (א) רזולוציה אופטית על המטרה ניאון הוא ~ 2 מיקרומטר. (ב) החלטה אפקטיבית, כפי שהיא נמדדת על פני דנדריט ידי photolysis של גלוטמט בכלוב היא ~ 5 מיקרומטר. המרחק גדל נובע משילוב של דיפוזיה של גלוטמט ורוחב סופי של דנדריט. (ג) Photolysis יכול לחקות את קינטיקה של אירועים הסינפטי. משפחתו של מתח הידק התגובות הנוכחי נובע וריאציות אנרגיית האור נמסר דנדריט. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig6.jpg" alt="איור 6" /> איור 6. שאינו ליניארי סיכום נקודות על פני סניף הדנדריטים. (א) תשומות מבוזרת מוחלים על שני סניפים הדנדריטים בנפרד. התגובות שלהם מתח מוצגים להלן. (ב) גירויים ניתנים ואז בו זמנית. התגובה נמדד (אדום זכר) הוא שונה מסכום החשבון של שתי התגובות הפרט (אפור זכר). <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig7.jpg" alt="איור 7" /> איור 7. סיכום Supralinear הקולטן NMDA הוא תלוי. (א) APV, אנטגוניסט לרצפטור NMDA סלקטיבית חוסם את סיכום supralinear. (ב) עוצמת הגירוי היחסים ואת הרגישות שלו אנטגוניסט לרצפטור NMDA הוא זממו.

<ol>
	<li>Scanziani, M., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930-939 (2009).</li><li>Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolysis+of+caged+neurotransmitters:+Theory+and+procedures+for+light+delivery.">Photolysis of caged neurotransmitters: Theory and procedures for light delivery.</a> Curr. Prot. Neurosci. , 6.21.1-6.21.12 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+Technology+Feature,+Cell+imaging:+Light+activated.">Nature Technology Feature, Cell imaging: Light activated.</a> Nature. 456, 826-827 (2008).</li><li>Lutz, C., Otis, T. S., DeSars, V., Charpak, S., DeGregorio, D. A., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+photolysis+of+caged+neurotransmitters.">Holographic photolysis of caged neurotransmitters.</a> Nature Methods. 5, 821-827 (2008).</li><li>Hornbeck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Digital Light Processing and MEMs: An overview. , .</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

היתרון של גישה DMD photostimulation מבוסס ניכר ביותר במצבים שבהם המטרה תופסת שטח גדול יחסית. אם המטרה של עניין הוא קטן מאוד, כגון הקוצים הדנדריטים כמה מערכות סריקה סדרתית confocal ו -2 פוטון צפויים להיות גישה טובה יותר. אחת חולשה משמעותית של הגישה DMD היא שימוש לא יעיל של האור זמין. עי...

Erratum: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Modern upright fluorescent microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD camera and image acquisition software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Computer and data acquisition/interface system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DLP Discovery Developer Kit </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ALP3 USB interface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>S2 + Optics w/LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dual camera port unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DPSS Laser Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser shutter Model LS6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Uniblitz</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Canadian Instrument and Research, Ltd </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>100 um core multimode fiber</td>
</tr>
<tr>
<td>Multimode Fiber launcher </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Oz Optics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Signal generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>up to 50 kHz</td>
</tr>
<tr>
<td>Beam collimator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>DApo20UV340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UV relay lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Special Optics</td>
<td>#: 54-25-60-355</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

patterned photostimulation with digital micromirror devices to investigate dendritic integration across branch points

האור הוא אמצעי תכליתי ומדויק לשלוט רגישות עצבית. המבוא האחרונות של effectors רגיש לאור כגון ערוץ rhodopsin ונוירוטרנסמיטרים בכלוב הובילו האינטרסים בפיתוח אמצעים טובים יותר לשלוט דפוסי אור במרחב ובזמן כי הם שימושיים עבור ניסויי המוח. אסטרטגיה אחת קונבנציונלי, המועסקים מיקרוסקופיה confocal ו -2 פוטון, היא למקד את האור לנקודה עקיפה מוגבל ולאחר מכן לסרוק את המקום יחיד ברצף על האזור של עניין. גישה זו הופכת להיות בעייתית אם שטחים גדולים צריך להיות מגורה בתוך חלון זמן קצר, בעיה רלוונטי יותר מאשר photostimulation הדמיה. אסטרטגיה חלופית היא הפרויקט דפוס מרחבי להשלים על היעד בעזרת מכשיר micromirror הדיגיטלי (DMD). הגישה DMD מושך בגלל רכיבי חומרה זולים יחסית והוא נתמך על ידי אינטרסים מסחריים. כי מערכת כזו אינה זמינה עבור מיקרוסקופים זקוף, נדון בנושאים קריטיים בבניית ותפעול של מערכת כזו DMD. למרות שאנו יהיה בעיקר המתאר את הבנייה של המערכת עבור photolysis UV, השינויים לבניית מערכת הרבה יותר פשוט האור הנראה לניסויים optogenetic יהיה גם סיפק. מערכת UV photolysis שימש לוקח אוכל הביתה ניסויים ללמוד שאלת יסוד במדעי המוח, איך מופצים מרחבית תשומות משולב ברחבי דיסטלי נקודות סניף הדנדריטים. מהתוצאות עולה כי השילוב יכול להיות שאינו ליניארי על פני נקודות הסניף ואת supralinearity מתווכת בעיקר על ידי קולטני NMDA.

Watch this Scientific Journal Video about Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points at JoVE.com

Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

Digital micromirror התקנים (DMD) יכול לייצר תבניות מורכבות בזמן ובמרחב שבה לשלוט רגישות עצבית. נושאים רלוונטיים לבניית עיצוב, והפעלה של מערכות DMD הם דנו. מערכת כזו אפשרה הדגמה של שילוב שאינו ליניארי לאורך דיסטלי נקודות סניף הדנדריטים.

Patterned Photostimulation עם התקנים דיגיטליים Micromirror לחקור שילוב דנדריטים מעבר סניף נקודות

Light is a versatile and precise means to control neuronal excitability. The recent introduction of light sensitive effectors such as channel-rhodopsin ...

patterned-photostimulation-with-digital-micromirror-devices-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.5K Views.  University of Maryland School of Medicine. Digital micromirror התקנים (DMD) יכול לייצר תבניות מורכבות בזמן ובמרחב שבה לשלוט רגישות עצבית. נושאים רלוונטיים לבניית עיצוב, והפעלה של מערכות DMD הם דנו. מערכת כזו אפשרה הדגמה של שילוב שאינו ליניארי לאורך דיסטלי נקודות סניף הדנדריטים.

Video: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. Additionally, traversing cellular barriers in the body is crucial for both oral delivery of therapeutic NCs into the circulation and transport from the blood into tissues, where intervention is needed. NC transport across cellular barriers is achieved by: (i) the paracellular route, via transient disruption of the junctions that interlock adjacent cells, or (ii) the transcellular route, where materials are internalized by endocytosis, transported across the cell body, and secreted at the opposite cell surface (transyctosis). Delivery across cellular barriers can be facilitated by coupling therapeutics or their carriers with targeting agents that bind specifically to cell-surface markers involved in transport. Here, we provide methods to measure the extent and mechanism of NC transport across a model cell barrier, which consists of a monolayer of gastrointestinal (GI) epithelial cells grown on a porous membrane located in a transwell insert. Formation of a permeability barrier is confirmed by measuring transepithelial electrical resistance (TEER), transepithelial transport of a control substance, and immunostaining of tight junctions. As an example, ~200&#160;nm polymer NCs are used, which carry a therapeutic cargo and are coated with an antibody that targets a cell-surface determinant. The antibody or therapeutic cargo is labeled with 125I for radioisotope tracing and labeled NCs are added to the upper chamber over the cell monolayer for varying periods of time. NCs associated to the cells and/or transported to the underlying chamber can be detected. Measurement of free 125I allows subtraction of the degraded fraction. The paracellular route is assessed by determining potential changes caused by NC transport to the barrier parameters described above. Transcellular transport is determined by addressing the effect of modulating endocytosis and transcytosis pathways.

Many therapeutic applications require safe and efficient transport of drug carriers and their cargoes across cellular barriers in the body. This article describes an adaptation of established methods to evaluate the rate and mechanism of transport of drug nanocarriers (NCs) across cellular barriers, such as the gastrointestinal (GI) epithelium.

מודלים ושיטות להערכת תחבורה של ליפידיות פני מחסומים נייד

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

המצאה של ננוצלולוז בקטריאלי המגנטי פונקציונלי עם חלקיקים של תחמוצת ברזל

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and provide information for follow-up treatment. Here, we demonstrate the development of a cotton-based urinalysis (i.e., nitrite, total protein, and urobilinogen assays) analytical device that employs a lateral flow-based format, and is inexpensive, easily fabricated, rapid, and can be used to conduct multiple tests without cross-contamination worries. Cotton is composed of cellulose fibers with natural absorptive properties that can be leveraged for flow-based analysis. The simple but elegant fabrication process of our cotton-based analytical device is described in this study. The arrangement of the cotton structure and test pad takes advantage of the hydrophobicity and absorptive strength of each material. Because of these physical characteristics, colorimetric results can persistently adhere to the test pad. This device enables physicians to receive clinical information in a timely manner and shows great potential as a tool for early intervention.

To investigate simple fabrication approaches for multiple assay needs, we created a fluid-absorbing channel system made of cotton material. This device was used to establish a multiple detection platform, and solve contamination issues that commonly affect lateral flow-based biomedical devices, for clinical urinalysis of nitrite, total protein, and urobilinogen.

בודה כותנה התקנים אנליטית

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

באמצעות דפוסים דבקים כדי לבנות התקני 3D נייר Microfluidic

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular cartilage impairs its load-bearing function substantially as it experiences tremendous chemical degradation, i.e. proteoglycan loss and collagen fibril disruption. One promising way to investigate chemical damage mechanisms during OA is to expose the cartilage specimens to an external solute and monitor the diffusion of the molecules. The degree of cartilage damage (i.e. concentration and configuration of essential macromolecules) is associated with collisional energy loss of external solutes while moving across articular cartilage creates different diffusion characteristics compared to healthy cartilage. In this study, we introduce a protocol, which consists of several steps and is based on previously developed experimental micro-Computed Tomography (micro-CT) and finite element modeling. The transport of charged and uncharged iodinated molecules is first recorded using micro-CT, which is followed by applying biphasic-solute and multiphasic finite element models to obtain diffusion coefficients and fixed charge densities across cartilage zones.

We propose a protocol to investigate the transport of charged and uncharged molecules across articular cartilage with the aid of recently developed experimental and numerical methods.

ניסויי ו אלמנטים סופיים פרוטוקול לחקר התחבורה של מומסים ניטראליים והואשמו ברחבי Articular סחוס

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Soft Lithographic Procedure for Producing Plastic Microfluidic Devices with View-ports Transparent to Visible and Infrared Light

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable microfluidic devices. Here, a protocol for the fabrication of plastic microfluidic devices is demonstrated, where soft lithographic techniques are used to embed transparent Calcium Fluoride (CaF2) view-ports in connection with observation chamber(s). The method is based on a replica casting approach, where a polydimethylsiloxane (PDMS) mold is produced through standard lithographic procedures and then used as the template to produce a plastic device. The plastic device features ultraviolet/visible/infrared (UV/Vis/IR) -transparent windows made of CaF2 to allow for direct observation with visible and IR light. The advantages of the proposed method include: a reduced need for accessing a clean room micro-fabrication facility, multiple view-ports, an easy and versatile connection to an external pumping system through the plastic body, flexibility of the design, e.g., open/closed channels configuration, and the possibility to add sophisticated features such as nanoporous membranes.

A protocol for the fabrication of plastic microfluidic devices with transparent view-ports for visible and infrared light imaging is described.

הליך ליטוגרפית רך לייצור מכשירים Microfluidic פלסטיק עם יציאות תצוגה שקוף לאור גלויים ולא אינפרא-אדום

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic respiration. However, the extent to which both pathways contribute to the landscape of cellular energy production is consistently overlooked. Transformed cells cultured in saturating levels of glucose often show a decreased dependency on oxidative phosphorylation for ATP production, which is compensated by an increase in substrate-level phosphorylation. This shift in metabolic poise allows cells to proliferate despite the presence of mitochondrial toxins. In neglecting the altered metabolic poise of transformed cells, results from a pharmaceutical screening may be misinterpreted since the potentially mitotoxic effects may not be detected using model cell lines cultured in the presence of high glucose concentrations. This protocol describes the pairing of two powerful techniques, respirometry and calorimetry, which allows for the quantitative and noninvasive assessment of both aerobic and anaerobic contributions to cellular ATP production. Both aerobic and anaerobic respirations generate heat, which can be monitored via calorimetry. Meanwhile, measuring the rate of oxygen consumption can assess the extent of aerobic respiration. When both heat dissipation and oxygen consumption are measured simultaneously, the calorespirometric ratio can be determined. The experimentally obtained value can then be compared to the theoretical oxycaloric equivalent and the extent of the anaerobic respiration can be judged. Thus, calorespirometry provides a unique method to analyze a wide range of biological questions, including drug development, microbial growth, and fundamental bioenergetics under both normoxic and hypoxic conditions.

This protocol describes calorespirometry, the direct and simultaneous measurement of both heat dissipation and respiration, which provides a noninvasive approach to assess energy metabolism. This technique is used to assess the contribution of both aerobic and anaerobic pathways to energy utilization by monitoring the total cellular energy flow.

Calorespirometry: גישה חזקה, לא פולשנית כדי לחקור את חילוף החומרים האנרגיה התאית

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

ברזולוציה גבוהה בדוגמת באמצעות התצהיר Biofilm pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...