本作品は、VA研究サービスからC - MTにNIHとメリットのレビューからRO1でサポートされ、CWLの個々のNRSAした

一般的な設計上の考慮事項写真刺激の波長は、そのようなoptogenetic実験用として、可視範囲内にある場合、システムのレイアウトは、UV光分解実験よりもかなり単純になります。一つは、顕微鏡の会社のすべてから使用可能なデュアルカメラポートのモジュールを購入する必要があります。 DMD平面は2つのカメラポートのいずれかの共役結像面に配置することができます。カメラにつながるの撮像管のレンズは市販の顕微鏡のいずれかでUV波長に対して補正されていないので、しかし、UV光分解でDMDから発信された光は、落射照明のパス（図3A）を介して持ち込まれている必要があります。 350nmでの撮像管レンズの球面収差は、狭い場所に光を集中すると十分な空間分解能を生成する能力を防ぐのに十分厳しいです。平行レーザービームが同じ光軸に沿って持って来られるときにチューブレンズが削除されるため、この問題は、共焦点顕微鏡では発生しません。そこにチューブのレンズはすべて部分的に紫外波長における球面収差を補正しているため、UV照射の問題は、落射蛍光パスを通る光を取り込むことで解決できます。我々は、どの程度ジャーナルの希望に顕微鏡の光学系に拡張することができます。科学界は、このトピックでは一般的な迅速な興味がでており、よくそれを教える多くのソースがないです。 顕微鏡の改造を最小限とするため落射蛍光ユニットでタイトなスペースの制約のためには、DMDは、リレーレンズ（との関係でDMDユニットの位置を指摘することによって作成された、新しく作成された共役結像面に配置されています顕微鏡）。商業UVは、リレーレンズを修正（図にして顕微鏡でそれを指摘）（特殊光学）購入した。 DMDのイルミネーションそのバイナリの入力を受け取るとマイクロミラーは、正と負の12 °傾斜チップの面に対して相対的に切り替えることができます。回転の軸は、各ミラー（チップの両側に45 °）の対角に沿っている。ミラーの回転の向きは、チップの表面上の1コーナーで金色の三角形で示されている。マイクロミラーの傾斜角度は、着信照明ビームのピッチとazithmusの配置を指示します。照射ビームのピッチは、DMDチップとミラーの回転軸に垂直になるようazithmusのニーズの垂直な軸より24 °である必要があります。正確なビームアライメントには、効率的な運用のための非常に重要です。プロトタイプシステムでは、私たちは設計と加工の不備を補正するために許容される複数の手動のチルト調整を設計した。これはかなりかさばる必要以上なシステムとなりました。光にもたらすための代替、よりコンパクトな配置が（有用と判断した場合、代替設計を示す）ことが可能です。 光分解の実験のためのレーザ光源は、迅速なアンケージングために必要なビームの焦点高い光強度を生成するために必要です。高輝度焦点を絞った光を必要としないoptogenetic実験のために、非コヒーレント光源は十分です。光分解の実験はここで説明では、準連続ダイオードは、周波数がNdVO4レーザー（1 W、355 nm）を倍固体（DPSS）を励起採用。 （光分解用光源の選択肢の詳細については文献2参照）。 DMDシステムを使用するときにレーザーの出力のごく一部が実際に試料に配信されているため、比較的高出力のレーザーは、ここで説明する実験に必要となります。試料に供給される光の量は、レーザビームによって照射された領域内でON / OFFのミラーの数の比に比例します。 レーザ光源が必要な場合は、DMDを照明するための適切な軸に沿って容易に位置し、配向させることができるように、それはマルチモードファイバへのレーザーの出力を起動するのが最善です。光ファイバを通して光を透過することはコヒーレント照明に固有のスペックルパターンを除去する方法、2番目の問題を解決します。繊維は〜40kHzで振動する圧電ファイバストレッチャ（モデル915、カナダの機器＆リサーチ株式会社）に巻き取られる。 （リグのポイントこれらを）繊維のストレッチ顕微鏡は、このように効果的に斑点の影響を排除し、各写真の刺激パルスのミリ秒の持続時間の間にパターンを何度もスペックルの動きに十分です。光ファイバの出力は、UV顕微鏡対物（オリンパスDApo20UV）でコリメートされる。 （これを指す）システムの光学解像度のキャリブレーションは、図に示されています。 3B。として、写真のスポットの位置の関数として電流の流れの振幅で測定された効果的な生理的分解能刺激は、図に示されています。 3C。異なる強度の光刺激に対する電流応答を図に示します。 3D。 システムの操作： DMDのミラーとの共同登録するCCDの画素社内のソフトウェアは、イメージングCCDのカメラの特定のピクセルに個々のDMDのミラーの対応を決定する書かれています。このソフトウェア内のグラフィックユーザインタフェース（GUI）は、ユーザーがマウスでタグ付けされたCCD画像上の領域に対応するDMDのミラーを割り当てることができます。このように、写真の刺激のための場所は、単にコンピュータの画面上に表示された画像の上にカーソルを移動し、関心のタグ付き領域をクリックすることでタグを付けることができます。 （樹状アーバの蛍光画像は、コンピュータの画面上に表示されます。生徒は、コンピュータの画面上で画像の上に場所の番号をマークします。） 光配信のためのパターンをプログラミングオペレータがコンピュータ画面に表示されているパターンは独立した一連の画像として保存されます。各空間パターンのレーザーパルスのタイミングは、データ収集プログラム（pClamp）と統合されているソフトウェアにプログラムされます。 （これを示す）。 DMDパターンにレーザーパルスの調整データ収集プログラムが開始され、ターゲットのニューロンから電気信号をクランプDMDエレクトロニクス、レーザーのゲート、およびパッチの取得のタイミングを調整します。 （コンピュータにこのシーケンスをシミュレートする） 実験データ： 遠位樹状分岐点間の非線形和電極を有する樹枝状の統合は、従来、個別の場所で刺激の振幅を変化させるのではなく、一定の強度を維持しながら刺激の面積を拡大することで行われている。位置依存性チャネルの電気発生と募集の彩度に関係する問題は、結果や結論に影響を及ぼすことができる。分散型樹状刺激は容易にDMDベースのシステム（図4A）を使用して実装することができます。入力強度は、光刺激のスポット数を増やすことによって変化させた。我々はその空間的加重が2つの娘枝に到着増加する入力の振幅とますます超えた線形になる分岐点を越え非線形になることができる見ることができます。上記直線性は、主に電位依存性チャネル（図5）にNMDA受容体を媒介とされていません代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig1.jpg" alt="図1" /> 図1 DMDのマイクロミラーの動作。 （サイドビュー）個々のミラーに向けられた静電気力は、ミラーが2つの可能な方向、水平から12 °のいずれかに傾けることが原因となる。 ONの位置に入射ビームは、チップの光軸に垂直に沿って指示される。 OFFの位置に入射ビームは48 °の軸外に向けられている。ミラー間の薄い隙間に当たる光は24 °の軸外に向けられている。 （トップビュー）の傾きは、ミラーとチップの側面に対して45 °指向です。 <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。近代的な蛍光顕微鏡の基本的なレイアウト。フィルターキューブは、客観とチューブレンズの間に&quot;無限の空間&quot;内に位置している。カメラにつながると、試料に光をもたらす照明パスが存在する画像のパスがあります。これら2つの光パスのチューブレンズは、通常、設計で、焦点距離が異なります。照明ではなく、イメージング、チューブレンズは、UVスペクトルで動作するように設計されています。 <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。UVベースのDMDシステムのレイアウト。照明は、UVスペクトル内にある場合、それは紫外線のために補正されているチューブレンズを通して状態にする必要があります。イメージングパスのチューブレンズは、UVのために設計されていません。中継システムは、簡単にアクセス共役像面を作成するために必要です。顕微鏡で異なる共役のイメージプレーンは赤い点線の線でマークされています。一つの画像平面内の明るいパターンは他の共役面に投影されています。イメージング中にサンプルの平面上のパターンは、検出器/カメラ上に投影される。照明用DMDで生成されたパターンは、試料上に投影される。 <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。可視光DMD投影システムのためのレイアウト。照明光が目に見える範囲内にある場合、それは撮像光路を介してDMD生成された光パターンを実現することが可能です。これは簡単にcommerciで実装することができますらデュアルカメラポートの添付ファイルと適切なダイクロイックミラー。 <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。システムの横方向の解像度。 （A）蛍光ターゲット上の光学分解能は〜2μmである。 （B）のような樹状突起全体にケージドグルタミン酸の光分解によって測定された効果的な分解能は〜5μmである。上昇距離は、グルタミン酸の拡散と樹状突起の有限幅の組み合わせによるものです。 （C）光分解はシナプス事象の動態を模倣することができます。電圧の家族は、現在の応答が樹状突起に配信光エネルギーの変動に起因するクランプ。 <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig6.jpg" alt="図6" /> 図6。樹状分岐点間の非線形和。 （）分散入力は2つのサービス樹枝に適用されます。それぞれの電圧の応答を以下に示します。 （B）の刺激は、同時に投与されています。測定された応答（赤のトレース）は、2つの個別の回答（グレーのトレース）の算術和とは異なります。 <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig7.jpg" alt="図7" /> 図7。Supralinear総和は、NMDA受容体依存性である。 （）APV、選択的NMDA受容体アンタゴニストは、supralinear総和をブロックします。 （B）刺激強度の関係およびNMDA受容体拮抗薬への感受性がプロットされます。

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	<li>Scanziani, M., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930-939 (2009).</li><li>Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolysis+of+caged+neurotransmitters:+Theory+and+procedures+for+light+delivery.">Photolysis of caged neurotransmitters: Theory and procedures for light delivery.</a> Curr. Prot. Neurosci. , 6.21.1-6.21.12 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+Technology+Feature,+Cell+imaging:+Light+activated.">Nature Technology Feature, Cell imaging: Light activated.</a> Nature. 456, 826-827 (2008).</li><li>Lutz, C., Otis, T. S., DeSars, V., Charpak, S., DeGregorio, D. A., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+photolysis+of+caged+neurotransmitters.">Holographic photolysis of caged neurotransmitters.</a> Nature Methods. 5, 821-827 (2008).</li><li>Hornbeck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Digital Light Processing and MEMs: An overview. , .</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

DMDベースの光刺激のアプローチの利点は、ターゲットが比較的大きな面積を占める状況に最も明白である。興味の対象がそのような少数の樹状突起棘のような、非常に小さい場合、シーケンシャルスキャン共焦点、2光子のシステムは、より良いアプローチになる可能性があります。 DMDのアプローチの一つの重要な弱点は、使用可能な光のその非効率的な使用です。利用可能な光の大部分は?...

Erratum: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

<table><tbody><tr><td>Modern upright fluorescent microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD camera and image acquisition software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer and data acquisition/interface system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DLP Discovery Developer Kit </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ALP3 USB interface</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S2 + Optics w/LED</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual camera port unit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W)</td><td>DPSS Laser Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser shutter Model LS6</td><td>Uniblitz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915</td><td>Canadian Instrument and Research, Ltd</td><td></td><td>100 um core multimode fiber</td></tr><tr><td>Multimode Fiber launcher </td><td>Oz Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Signal generator</td><td></td><td></td><td>up to 50 kHz</td></tr><tr><td>Beam collimator</td><td>Olympus Corporation</td><td>DApo20UV340</td><td></td></tr><tr><td>UV relay lens</td><td>Special Optics</td><td>#: 54-25-60-355</td><td></td></tr></tbody></table>

patterned photostimulation with digital micromirror devices to investigate dendritic integration across branch points

光は、神経細胞の興奮性を制御するための汎用性と正確な手段です。このようなチャネルロドプシンとケージ神経伝達物質などの光に敏感なエフェクターの最近の導入は、スペースと実験的神経科学のための有用な時間で、光のパターンを制御するためのより良い手段を開発する上での利益につながっている。共焦点、2光子顕微鏡で使用されている1つの従来の戦略は、回折限界のスポットに光を集中し、関心領域で順次にその単一のスポットをスキャンすることです。大きな領域は、短い時間枠の、イメージングのためのより光刺激により適用される問題の中で刺激する必要がある場合は、この手法には問題になります。代替戦略は、デジタルマイクロミラーデバイス（DMD）の助けを借りて、ターゲット上で完全な空間パターンを投影することです。 DMDのアプローチは、ハードウェアコンポーネントが比較的安価であるため魅力的ですし、商業的利益によってサポートされています。そのようなシステムは直立顕微鏡の利用できないため、我々はこのようなDMDシステムの構築と運用に重要な問題を議論します。我々は主に紫外光分解のためにシステムの構築を記述する場合でも、optogeneticの実験のためにはるかに簡単な可視光システムを構築するための修正も提供されます。 UV光分解システムは神経科学における基本的な問題を研究する実験をCARRYOUTするために使用された、どのように空間的に遠位樹状分岐点間で統合の入力を配布されます。結果は、統合が分岐点を越え非線形することができ、超線形の大部分がNMDA受容体によって媒介されることを示唆している。

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Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

デジタルマイクロミラーデバイス（DMD）は、神経細胞の興奮性を制御するために、時間と空間の複雑なパターンを生成することができます。 DMDシステムの設計、建設、および操作に関連する問題について説明します。このようなシステムは、遠位樹状分岐点を越え非線形統合のデモンストレーションを有効にする。

分岐点間での樹の統合を調査するためにデジタルマイクロミラーデバイスと模様の光刺激

Light is a versatile and precise means to control neuronal excitability. The recent introduction of light sensitive effectors such as channel-rhodopsin ...

patterned-photostimulation-with-digital-micromirror-devices-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.6K ビュー.  University of Maryland School of Medicine. デジタルマイクロミラーデバイス（DMD）は、神経細胞の興奮性を制御するために、時間と空間の複雑なパターンを生成することができます。 DMDシステムの設計、建設、および操作に関連する問題について説明します。このようなシステムは、遠位樹状分岐点を越え非線形統合のデモンストレーションを有効にする。

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Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into diverse subtypes based on their immunochemical, morphological, and physiological properties1-4. Although previous research has revealed much about intrinsic properties of individual types of inhibitory neurons, knowledge about their local circuit connections is still relatively limited3,5,6. Given that each individual neuron's function is shaped by its excitatory and inhibitory synaptic input within cortical circuits, we have been using laser scanning photostimulation (LSPS) to map local circuit connections to specific inhibitory cell types. Compared to conventional electrical stimulation or glutamate puff stimulation, LSPS has unique advantages allowing for extensive mapping and quantitative analysis of local functional inputs to individually recorded neurons3,7-9. Laser photostimulation via glutamate uncaging selectively activates neurons perisomatically, without activating axons of passage or distal dendrites, which ensures a sub-laminar mapping resolution. The sensitivity and efficiency of LSPS for mapping inputs from many stimulation sites over a large region are well suited for cortical circuit analysis.
Here we introduce the technique of LSPS combined with whole-cell patch clamping for local inhibitory circuit mapping. Targeted recordings of specific inhibitory cell types are facilitated by use of transgenic mice expressing green fluorescent proteins (GFP) in limited inhibitory neuron populations in the cortex3,10, which enables consistent sampling of the targeted cell types and unambiguous identification of the cell types recorded. As for LSPS mapping, we outline the system instrumentation, describe the experimental procedure and data acquisition, and present examples of circuit mapping in mouse primary somatosensory cortex. As illustrated in our experiments, caged glutamate is activated in a spatially restricted region of the brain slice by UV laser photolysis; simultaneous voltage-clamp recordings allow detection of photostimulation-evoked synaptic responses. Maps of either excitatory or inhibitory synaptic input to the targeted neuron are generated by scanning the laser beam to stimulate hundreds of potential presynaptic sites. Thus, LSPS enables the construction of detailed maps of synaptic inputs impinging onto specific types of inhibitory neurons through repeated experiments. Taken together, the photostimulation-based technique offers neuroscientists a powerful tool for determining the functional organization of local cortical circuits.

This paper introduces an approach of combining laser scanning photostimulation with whole cell recordings in transgenic mice expressing GFP in limited inhibitory neuron populations. The technique allows for extensive mapping and quantitative analysis of local synaptic circuits of specific inhibitory cortical neurons.

レーザースキャニングの光刺激によって抑制神経回路のマッピング

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

神経科学

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

コンピュータ支援多電極パッチクランプシステム

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

列およびレイヤーで樹状形態を分析します

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

ショウジョウバエニューロンの開発における高速樹状分岐ダイナミクスのタイムラプスライブイメージングと定量化

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Automatic Identification of Dendritic Branches and their Orientation

The structure of neuronal dendritic trees plays a key role in the integration of synaptic inputs in neurons. Therefore, characterization of the morphology of dendrites is essential for a better understanding of neuronal function. However, the complexity of dendritic trees, both when isolated and especially when located within neuronal networks, has not been completely understood. We developed a new computational tool, SOA (Segmentation and Orientation Analysis), which allows automatic measurement of the orientation of dendritic branches from fluorescence images of 2D neuronal cultures. SOA, written in Python, uses segmentation to distinguish dendritic branches from the image background and accumulates a database on the spatial direction of each branch. The database is then used to calculate morphological parameters such as the directional distribution of dendritic branches in a network and the prevalence of parallel dendritic branch growth. The data obtained can be used to detect structural changes in dendrites in response to neuronal activity and to biological and pharmacological stimuli.

Presented is a computational tool that allows simple and direct automatic measurement of orientations of neuronal dendritic branches from 2D fluorescence images.

樹状枝の自動同定とその向き

The structure of neuronal dendritic trees plays a key role in the integration of synaptic inputs in neurons. Therefore, characterization of the morphology ...

A Cardiac Microphysiological System for Studying Ca2+ Propagation via Non-genetic Optical Stimulation

In vitro cardiac microphysiological models are highly reliable for scientific research, drug development, and medical applications. Although widely accepted by the scientific community, these systems are still limited in longevity due to the absence of non-invasive stimulation techniques. Phototransducers provide an efficient stimulation method, offering a wireless approach with high temporal and spatial resolution while minimizing invasiveness in stimulation processes. In this manuscript, we present a fully optical method for stimulating and detecting the activity of an in vitro cardiac microphysiological model. Specifically, we fabricated engineered laminar anisotropic tissues by seeding human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) generated in a 3D bioreactor suspension culture. We employed a phototransducer, an amphiphilic azobenzene derivative, named Ziapin2, for stimulation and a Ca2+ dye (X-Rhod 1) for monitoring the system&#39;s response. The results demonstrate that Ziapin2 can photomodulate Ca2+ responses in the employed system without compromising tissue integrity, viability, or behavior. Furthermore, we showed that the light-based stimulation approach offers a similar resolution compared to electrical stimulation, the current gold standard. Overall, this protocol opens promising perspectives for the application of Ziapin2 and material-based photostimulation in cardiac research.

Using light to control cardiac cells and tissue enables non-contact stimulation, thereby preserving the natural state and function of the cells, making it a valuable approach for both basic research and therapeutic applications.

非遺伝的光刺激によるCa2+ 伝播を研究するための心臓微小生理学的システム

In vitro cardiac microphysiological models are highly reliable for scientific research, drug development, and medical applications. Although widely ...

生物工学

Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy

Recent advances in optical bioimaging and optogenetics have enabled the visualization and manipulation of biological phenomena, including cellular activities, in living animals. In the field of neuroscience, detailed neural activity related to brain functions, such as learning and memory, has now been revealed, and it has become feasible to artificially manipulate this activity to express brain functions. However, the conventional evaluation of neural activity by two-photon Ca2+ imaging has the problem of low temporal resolution. In addition, manipulation of neural activity by conventional optogenetics through the optic fiber can only simultaneously regulate the activity of neurons with the same genetic background, making it difficult to control the activity of individual neurons. To solve this issue, we recently developed a microscope with a high spatiotemporal resolution for biological applications by combining optogenetics with digital holographic technology that can modify femtosecond infrared laser beams. Here, we describe protocols for the visualization, evaluation, and manipulation of neural activity, including the preparation of samples and operation of a two-photon holographic microscope (Figure 1). These protocols provide accurate spatiotemporal information on neural activity, which may be useful for elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that lead to abnormalities in neural activity.

We developed a two-photon holographic microscope that can visualize, assess, and manipulate neural activity using high spatiotemporal resolution, with the aim of elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that are associated with abnormal neural activity.

分岐点間での樹の統合を調査するためにデジタルマイクロミラーデバイスと模様の光刺激

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レーザースキャニングの光刺激によって抑制神経回路のマッピング

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ショウジョウバエニューロンの開発における高速樹状分岐ダイナミクスのタイムラプスライブイメージングと定量化

樹状枝の自動同定とその向き

非遺伝的光刺激によるCa²⁺ 伝播を研究するための心臓微小生理学的システム

2光子ホログラフィック顕微鏡を用いた神経活動の評価と操作

分岐点間での樹の統合を調査するためにデジタルマイクロミラーデバイスと模様の光刺激

要約

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レーザースキャニングの光刺激によって抑制神経回路のマッピング

コンピュータ支援多電極パッチクランプシステム

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

列およびレイヤーで樹状形態を分析します

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

ショウジョウバエニューロンの開発における高速樹状分岐ダイナミクスのタイムラプスライブイメージングと定量化

樹状枝の自動同定とその向き

非遺伝的光刺激によるCa2+ 伝播を研究するための心臓微小生理学的システム

2光子ホログラフィック顕微鏡を用いた神経活動の評価と操作

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウムイメージング

非遺伝的光刺激によるCa²⁺ 伝播を研究するための心臓微小生理学的システム