Este trabalho foi financiado por um RO1 de NIH e Comentários Mérito do Serviço de Pesquisa do VA de C.-MT, e um NRSA individuais para CWL

Considerações gerais de projeto Se o comprimento de onda de estimulação foto está na faixa do visível, como para experiências optogenetic, o layout do sistema será consideravelmente mais simples do que para os experimentos de fotólise UV. Um só precisa comprar um módulo de porta dupla câmara que está disponível a partir de todas as empresas microscópio. O avião DMD pode ser posicionado no plano da imagem conjugada de qualquer uma das duas portas da câmara. Mas, na fotólise UV a luz proveniente da DMD devem ser levados em pelo caminho epi-iluminação (Fig. 3A), porque a lente do tubo de imagem de liderança para a câmera não for corrigido para comprimento de onda UV em qualquer um dos microscópios comercialmente disponíveis. A aberração esférica da lente do tubo de imagem em 350 nm é grave o suficiente para impedir a capacidade de focalizar a luz para um local apertado e gerar resolução espacial suficiente. Este problema não é encontrado em microscopia confocal porque a lente do tubo é removido quando um feixe de laser colimado é trazido ao longo do mesmo eixo óptico. O problema da iluminação UV pode ser resolvido por trazer à luz através do caminho epi-fluorescente porque as lentes do tubo existem todos os parcialmente corrigida para aberração esférica no comprimento de onda UV. Podemos expandir a ótica dos microscópios em qualquer grau, os desejos do jornal. A comunidade científica é, em geral, interessados ​​rápida neste tópico e não há muitas fontes que ensina-lo bem. A fim de minimizar modificações do microscópio e devido a restrições de espaço apertado na unidade de epi-fluorescência, a DMD é colocado em um plano de imagem recém-criada conjugado criado por uma lente relay (ponto a posição da unidade de DMD em relação ao microscópio). A UV comercial corrigido lente relay foi comprado (Optics Especialidade) (ponto-a no diagrama e no microscópio). Iluminação da DMD Ao receber a sua entrada binária um micromirror pode alternar entre um positivo e um negativo 12 ° de inclinação em relação ao plano do chip. O eixo de rotação é ao longo da diagonal cantos de cada espelho (45 ° para os lados do chip). A orientação da rotação do espelho é designado por um triângulo dourado em um canto na superfície frontal do chip. O ângulo de inclinação dos microespelhos dita o alinhamento do campo e azithmus do feixe de iluminação de entrada. A afinação do feixe de iluminação precisa ser 24 ° do eixo perpendicular do chip DMD e necessidades azithmus ser perpendicular ao eixo de rotação do espelho. Alinhamento do feixe preciso é fundamental para uma operação eficiente. No sistema protótipo nós projetamos múltiplos ajustes de inclinação manual que nos permitiu corrigir inadequações de projeto e usinagem. Isto resultou em um sistema que é consideravelmente mais volumoso do que o necessário. Arranjo, alternativo mais compacto para trazer à luz é possível (show projeto alternativo, se for considerado útil). Para experimentos de fotólise uma fonte de laser é necessária para gerar o feixe de alta intensidade de luz focada necessários para uncaging rápida. Para experimentos optogenetic onde a luz de alta intensidade focalizados não é necessária, uma fonte de luz não coerente seria adequada. No experimento descrito aqui fotólise empregados um diodo semi-contínua bombeado de estado sólido (DPSS) freqüência triplicou NdVO4 laser (1 W, 355 nm). (Para uma discussão detalhada sobre as opções de fontes de luz para fotólise ver referência 2). Um laser de potência relativamente alta é necessário nos experimentos descritos aqui porque apenas uma pequena fração da saída do laser é efectivamente entregue ao espécime quando se utiliza um sistema de DMD. A quantidade de luz entregues ao modelo é proporcional à razão entre o número de ON / OFF espelhos na região iluminada pelo feixe de laser. Se uma fonte de luz laser é necessário, é melhor para lançar a saída do laser em uma fibra multimodo para que ele possa ser facilmente posição e orientada ao longo do eixo correto para iluminar a DMD. Transmissão da luz através da fibra óptica resolve um segundo problema, como eliminar os padrões speckle inerentes à iluminação coerente. A fibra é enrolada em torno de uma maca de fibra piezoelétrico (modelo 915, Instrumentação Canadian &amp; Research, Ltd), que oscila em ~ 40 kHz. (Ponto estas no rig) O microscópicas alongamento da fibra é suficiente para move o speckle pattern muitas vezes durante a duração de cada pulso milissegundos foto estimulação, assim, efetivamente eliminando o efeito de manchas. A saída da fibra óptica é então colimados com uma objetiva de microscópio UV (Olympus DApo20UV). (Apontar isso) A calibração da resolução óptica do sistema é mostrado na figura. 3B. A resolução efetiva fisiológica medida pela amplitude do fluxo de corrente em função da posição do local da fotoestimulação é mostrado na figura. 3C. Respostas atual para fotoestimulação de diferentes intensidades são ilustrados na fig. 3D. Funcionamento do sistema: Co-registro do pixels CCD com os espelhos DMD Um software in-house foi escrito que determina a correspondência de cada um dos espelhos DMD para pixels específicos da câmera CCD de imagem. O usuário interface gráfica (GUI) dentro deste software, permite que o usuário atribua os espelhos DMD que corresponde à região na imagem CCD marcados pelo mouse. Assim, o local para a estimulação da foto pode ser marcado simplesmente movendo o cursor sobre a imagem exibida na tela do computador e clicar na região com a tag de interesse. (A imagem fluorescente de um mandril dendríticas será exibido na tela do computador. Student vai marcar um número de posições sobre a imagem na tela do computador.) Programação dos padrões para a entrega de luz O padrão marcado na tela do computador pelo operador é armazenado como uma série de imagens separadas. O tempo dos pulsos de laser para cada padrão espacial é então programado para o software que está integrado com os dados do programa de aquisição (pClamp). (Demonstrar isso). Coordenar os pulsos de laser para os padrões de DMD O programa de aquisição de dados inicia e coordena o tempo da eletrônica DMD, a propagação do laser, ea aquisição do patch preso sinal elétrico do neurônio alvo. (Simular esta seqüência no computador) Dados experimentais: Não-linear através de somatório distal pontos de ramificação dendríticas Integração dendríticas com eletrodos tem sido tradicionalmente realizado através da variação da amplitude da estimulação em locais discretos, em vez de expandir a área de estimulação, mantendo uma intensidade constante. Questões relacionadas com a saturação do eletrogênese e recrutamento de canais dependentes da localização pode influenciar o resultado e conclusão. Distribuídos estimulação dendríticas pode ser facilmente implementado usando um sistema baseado DMD (Fig. 4A). Intensidade de entrada foi variado, aumentando o número de pontos de fotoestimulação. Podemos ver que soma espacial pode ser não-linear ao longo pontos de ramificação cada vez mais supra-linear, com amplitudes de entrada aumentando chegando em dois ramos filha. O supra-linearidade é largamente mediada receptores NMDA e não a tensão de canais fechados (Fig. 5) Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Operação da microespelhos na DMD. (Vista lateral) forças eletrostáticas dirigida a espelhos individuais causam o espelho para ser inclinado em uma das duas orientações possíveis 12 ° da horizontal. Na posição ON um feixe incidente é direcionado ao longo do eixo óptico perpendicular do chip. Na posição OFF o feixe incidente é direcionado 48 ° fora do eixo. Luz que atinge as lacunas fina entre os espelhos é direcionado 24 ° fora do eixo. (Vista de cima) a inclinação é orientada 45 ° com relação aos lados dos espelhos e chip. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Arranjo básico de um microscópio fluorescente moderna. O cubo de filtro está posicionado no &quot;espaço infinito&quot; entre o objetivo ea lente do tubo. Há um caminho que leva a imagem da câmera e não há um caminho de iluminação que traz a luz para a amostra. A lente do tubo para estas caminho da luz dois são tipicamente diferentes no projeto e no comprimento focal. A iluminação, mas não a imagem, lente do tubo é projetado para operação no espectro UV. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Layout para sistema baseado UV DMD. Se a iluminação está no espectro UV, então ele deve ser trazido através da lente do tubo que é corrigida por UV. A lente do tubo no caminho de imagem não é projetada para UV. Um sistema de revezamento é necessária para criar um plano de imagem facilmente acessível conjugado. Os planos diferentes de conjugado imagem no microscópio é marcada por linhas pontilhadas vermelhas. Padrões brilhantes em um plano de imagem são projetadas em planos conjugados outros. Durante a gravação do padrão no plano da amostra é projetada sobre o detector / câmera. Para a iluminação do padrão gerado pela DMD é projetada na amostra. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Layout para sistema de projeção de luz visível DMD. Se a luz de iluminação é na faixa do visível, é possível trazer o padrão de luz DMD gerado através do caminho da luz de imagem. Isso pode ser facilmente implementado com commercial câmera dupla anexos porta eo espelho apropriado dicróicas. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Resolução lateral do sistema. (A) Resolução óptica no alvo fluorescente é ~ 2 micra. (B) resolução efetiva medida por fotólise de glutamato enjaulado em um dendrito é de aproximadamente 5 mm. A distância maior é devido a uma combinação de difusão de glutamato ea largura finita do dendrito. (C) Fotólise podem imitar a cinética de eventos sinápticos. A família de tensão preso respostas atual se deve a variações na energia da luz entregue ao dendrito. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Non-linear através de somatório pontos de ramificação dendrítica. (A) entradas distribuídas são aplicadas a dois ramos dendríticas separadamente. Suas respostas tensão respectivas são mostradas abaixo. (B) Os estímulos são dadas simultaneamente. A resposta medida (vermelho trace) é diferente do que a soma aritmética das duas respostas individuais (cinza traço). <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Somatório supralinear é dependente do receptor NMDA. (A) APV, um antagonista do receptor NMDA seletivo bloqueia o somatório supralinear. (B) A relação intensidade do estímulo e sua sensibilidade para antagonista do receptor NMDA é traçado.

<ol>
	<li>Scanziani, M., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930-939 (2009).</li><li>Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolysis+of+caged+neurotransmitters:+Theory+and+procedures+for+light+delivery.">Photolysis of caged neurotransmitters: Theory and procedures for light delivery.</a> Curr. Prot. Neurosci. , 6.21.1-6.21.12 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+Technology+Feature,+Cell+imaging:+Light+activated.">Nature Technology Feature, Cell imaging: Light activated.</a> Nature. 456, 826-827 (2008).</li><li>Lutz, C., Otis, T. S., DeSars, V., Charpak, S., DeGregorio, D. A., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+photolysis+of+caged+neurotransmitters.">Holographic photolysis of caged neurotransmitters.</a> Nature Methods. 5, 821-827 (2008).</li><li>Hornbeck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Digital Light Processing and MEMs: An overview. , .</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A vantagem da abordagem baseada fotoestimulação DMD é mais aparente para situações em que o alvo ocupa uma área relativamente grande. Se o alvo de interesse é muito pequeno, como um espinhas dendríticas, sistemas de digitalização seqüencial confocal e 2-fótons são susceptíveis de ser a melhor abordagem. Uma fraqueza significativa da abordagem DMD é o uso ineficiente da luz disponível. A maior parte da luz disponível é necessariamente direcionado para os espelhos OFF e não utilizados. <p class="jov...

Erratum: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

<table><tbody><tr><td>Modern upright fluorescent microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD camera and image acquisition software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer and data acquisition/interface system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DLP Discovery Developer Kit </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ALP3 USB interface</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S2 + Optics w/LED</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual camera port unit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W)</td><td>DPSS Laser Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser shutter Model LS6</td><td>Uniblitz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915</td><td>Canadian Instrument and Research, Ltd</td><td></td><td>100 um core multimode fiber</td></tr><tr><td>Multimode Fiber launcher </td><td>Oz Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Signal generator</td><td></td><td></td><td>up to 50 kHz</td></tr><tr><td>Beam collimator</td><td>Olympus Corporation</td><td>DApo20UV340</td><td></td></tr><tr><td>UV relay lens</td><td>Special Optics</td><td>#: 54-25-60-355</td><td></td></tr></tbody></table>

patterned photostimulation with digital micromirror devices to investigate dendritic integration across branch points

A luz é um meio versátil e precisa para o controle da excitabilidade neuronal. A recente introdução da luz effectors sensíveis, tais como canais de rodopsina e neurotransmissores enjaulado levaram a interesses no desenvolvimento de melhores meios para controlar os padrões de luz no espaço e no tempo que são úteis para fins experimentais da neurociência. Uma estratégia convencional, empregada na microscopia confocal e 2-fóton, é para focalizar a luz para um ponto de difração limitada e, então, verificar que o único ponto em seqüência sobre a região de interesse. Esta abordagem torna-se problemática se grandes áreas devem ser estimuladas dentro de uma janela de tempo breve, um problema mais aplicável a fotoestimulação do que para a imagem latente. Uma estratégia alternativa é projetar o padrão completo espacial no alvo com o auxílio de um dispositivo de microespelhos digitais (DMD). A abordagem DMD é atraente porque os componentes de hardware são relativamente baratos e é apoiado por interesses comerciais. Porque esse sistema não está disponível para microscópios verticais, vamos discutir as questões críticas na construção e operação de um tal sistema DMD. Mesmo que será principalmente descrevendo a construção do sistema de fotólise UV, as modificações para a construção do sistema de luz visível muito mais simples para os experimentos optogenetic também serão fornecidas. O sistema de fotólise UV foi usada para carryout experimentos para estudar uma questão fundamental em neurociência, como estão espacialmente distribuídos insumos integrada através de pontos de ramificação distal dendríticas. Os resultados sugerem que a integração pode ser não-linear em pontos de ramificação eo supralinearity é largamente mediada por receptores NMDA.

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Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

Digital micromirror dispositivos (DMD) pode gerar padrões complexos em tempo e espaço com o qual o controle da excitabilidade neuronal. Questões relevantes para a concepção, construção e operação de sistemas de DMD são discutidos. Tal sistema permitiu a demonstração de não-linear integração entre distal pontos de ramificação dendrítica.

Padronizada fotoestimulação com dispositivos Digital Micromirror para Investigar Integração dendríticas em pontos Branch

Light is a versatile and precise means to control neuronal excitability. The recent introduction of light sensitive effectors such as channel-rhodopsin ...

patterned-photostimulation-with-digital-micromirror-devices-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.6K visualizações.  University of Maryland School of Medicine. Digital micromirror dispositivos (DMD) pode gerar padrões complexos em tempo e espaço com o qual o controle da excitabilidade neuronal. Questões relevantes para a concepção, construção e operação de sistemas de DMD são discutidos. Tal sistema permitiu a demonstração de não-linear integração entre distal pontos de ramificação dendrítica.

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Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into diverse subtypes based on their immunochemical, morphological, and physiological properties1-4. Although previous research has revealed much about intrinsic properties of individual types of inhibitory neurons, knowledge about their local circuit connections is still relatively limited3,5,6. Given that each individual neuron's function is shaped by its excitatory and inhibitory synaptic input within cortical circuits, we have been using laser scanning photostimulation (LSPS) to map local circuit connections to specific inhibitory cell types. Compared to conventional electrical stimulation or glutamate puff stimulation, LSPS has unique advantages allowing for extensive mapping and quantitative analysis of local functional inputs to individually recorded neurons3,7-9. Laser photostimulation via glutamate uncaging selectively activates neurons perisomatically, without activating axons of passage or distal dendrites, which ensures a sub-laminar mapping resolution. The sensitivity and efficiency of LSPS for mapping inputs from many stimulation sites over a large region are well suited for cortical circuit analysis.
Here we introduce the technique of LSPS combined with whole-cell patch clamping for local inhibitory circuit mapping. Targeted recordings of specific inhibitory cell types are facilitated by use of transgenic mice expressing green fluorescent proteins (GFP) in limited inhibitory neuron populations in the cortex3,10, which enables consistent sampling of the targeted cell types and unambiguous identification of the cell types recorded. As for LSPS mapping, we outline the system instrumentation, describe the experimental procedure and data acquisition, and present examples of circuit mapping in mouse primary somatosensory cortex. As illustrated in our experiments, caged glutamate is activated in a spatially restricted region of the brain slice by UV laser photolysis; simultaneous voltage-clamp recordings allow detection of photostimulation-evoked synaptic responses. Maps of either excitatory or inhibitory synaptic input to the targeted neuron are generated by scanning the laser beam to stimulate hundreds of potential presynaptic sites. Thus, LSPS enables the construction of detailed maps of synaptic inputs impinging onto specific types of inhibitory neurons through repeated experiments. Taken together, the photostimulation-based technique offers neuroscientists a powerful tool for determining the functional organization of local cortical circuits.

This paper introduces an approach of combining laser scanning photostimulation with whole cell recordings in transgenic mice expressing GFP in limited inhibitory neuron populations. The technique allows for extensive mapping and quantitative analysis of local synaptic circuits of specific inhibitory cortical neurons.

Mapeamento Inibitória Circuitos Neuronal por Laser Scanning fotoestimulação

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

Neurociência

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

A Multi-eletrodo Sistema patch-clamp assistida por computador

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Utilizando metodologias combinadas para definir o papel do Plasma Membrane entrega durante Axon Ramificação e Neuronal morfogênese

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

Analisando dendríticas Morfologia em Colunas e Camadas

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

Tempo-lapso de imagem ao vivo e quantificação da dinâmica da filial dendrítica rápida no desenvolvimento de neurônios de Drosophila

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Automatic Identification of Dendritic Branches and their Orientation

The structure of neuronal dendritic trees plays a key role in the integration of synaptic inputs in neurons. Therefore, characterization of the morphology of dendrites is essential for a better understanding of neuronal function. However, the complexity of dendritic trees, both when isolated and especially when located within neuronal networks, has not been completely understood. We developed a new computational tool, SOA (Segmentation and Orientation Analysis), which allows automatic measurement of the orientation of dendritic branches from fluorescence images of 2D neuronal cultures. SOA, written in Python, uses segmentation to distinguish dendritic branches from the image background and accumulates a database on the spatial direction of each branch. The database is then used to calculate morphological parameters such as the directional distribution of dendritic branches in a network and the prevalence of parallel dendritic branch growth. The data obtained can be used to detect structural changes in dendrites in response to neuronal activity and to biological and pharmacological stimuli.

Presented is a computational tool that allows simple and direct automatic measurement of orientations of neuronal dendritic branches from 2D fluorescence images.

Identificação Automática de Ramos Dendráticos e sua Orientação

The structure of neuronal dendritic trees plays a key role in the integration of synaptic inputs in neurons. Therefore, characterization of the morphology ...

A Cardiac Microphysiological System for Studying Ca2+ Propagation via Non-genetic Optical Stimulation

In vitro cardiac microphysiological models are highly reliable for scientific research, drug development, and medical applications. Although widely accepted by the scientific community, these systems are still limited in longevity due to the absence of non-invasive stimulation techniques. Phototransducers provide an efficient stimulation method, offering a wireless approach with high temporal and spatial resolution while minimizing invasiveness in stimulation processes. In this manuscript, we present a fully optical method for stimulating and detecting the activity of an in vitro cardiac microphysiological model. Specifically, we fabricated engineered laminar anisotropic tissues by seeding human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) generated in a 3D bioreactor suspension culture. We employed a phototransducer, an amphiphilic azobenzene derivative, named Ziapin2, for stimulation and a Ca2+ dye (X-Rhod 1) for monitoring the system&#39;s response. The results demonstrate that Ziapin2 can photomodulate Ca2+ responses in the employed system without compromising tissue integrity, viability, or behavior. Furthermore, we showed that the light-based stimulation approach offers a similar resolution compared to electrical stimulation, the current gold standard. Overall, this protocol opens promising perspectives for the application of Ziapin2 and material-based photostimulation in cardiac research.

Using light to control cardiac cells and tissue enables non-contact stimulation, thereby preserving the natural state and function of the cells, making it a valuable approach for both basic research and therapeutic applications.

Um sistema microfisiológico cardíaco para estudar a propagação de Ca2+ via estimulação óptica não genética

In vitro cardiac microphysiological models are highly reliable for scientific research, drug development, and medical applications. Although widely ...

Bioengenharia

Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy

Recent advances in optical bioimaging and optogenetics have enabled the visualization and manipulation of biological phenomena, including cellular activities, in living animals. In the field of neuroscience, detailed neural activity related to brain functions, such as learning and memory, has now been revealed, and it has become feasible to artificially manipulate this activity to express brain functions. However, the conventional evaluation of neural activity by two-photon Ca2+ imaging has the problem of low temporal resolution. In addition, manipulation of neural activity by conventional optogenetics through the optic fiber can only simultaneously regulate the activity of neurons with the same genetic background, making it difficult to control the activity of individual neurons. To solve this issue, we recently developed a microscope with a high spatiotemporal resolution for biological applications by combining optogenetics with digital holographic technology that can modify femtosecond infrared laser beams. Here, we describe protocols for the visualization, evaluation, and manipulation of neural activity, including the preparation of samples and operation of a two-photon holographic microscope (Figure 1). These protocols provide accurate spatiotemporal information on neural activity, which may be useful for elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that lead to abnormalities in neural activity.

We developed a two-photon holographic microscope that can visualize, assess, and manipulate neural activity using high spatiotemporal resolution, with the aim of elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that are associated with abnormal neural activity.

Padronizada fotoestimulação com dispositivos Digital Micromirror para Investigar Integração dendríticas em pontos Branch

Resumo

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