Este trabajo fue apoyado por una RO1 de los NIH y comentarios al Mérito del Servicio de Investigación VA a C-MT, y una persona NRSA a CWL

Consideraciones generales de diseño Si la longitud de onda de la estimulación de fotos está en el rango visible, por ejemplo, para experimentos optogenetic, el diseño del sistema será mucho más sencillo que para los experimentos de fotólisis UV. Uno sólo tiene que comprar un módulo de cámara de doble puerto que está disponible en todas las empresas microscopio. El avión de DMD se puede colocar en el plano de la imagen conjugada de uno de los dos puertos de la cámara. Sin embargo, en la fotólisis UV la luz procedente de la DMD deben ser llevados a través de la vía epi-iluminación (Fig. 3A), ya que la lente del tubo de imagen que lleva a la cámara no se corrige la longitud de onda UV en cualquiera de los microscopios disponibles en el mercado. La aberración esférica de la lente del tubo de imagen a 350 nm es lo suficientemente grave como para evitar que la capacidad para enfocar la luz de una situación difícil y para generar suficiente resolución espacial. Este problema no se encuentra en la microscopía confocal, porque el lente del tubo se retira cuando un rayo láser colimado se trae a lo largo del eje óptico misma. El problema de la luz UV puede ser resuelto por traer la luz a través de la vía epi-fluorescencia debido a que el tubo de lentes que son parcialmente corregido la aberración esférica en la longitud de onda UV. Podemos ampliar la óptica de los microscopios en cualquier grado, los deseos de revistas. La comunidad científica es, en general, interesados ​​en este tema rápido y no hay muchas fuentes que se enseña bien. Con el fin de reducir al mínimo las modificaciones del microscopio y debido a limitaciones de espacio reducido en la unidad de epifluorescencia, la DMD se coloca en un plano de la imagen recién creada conjugado creado por una lente de relé (señalar la posición de la unidad de DMD en relación con la microscopio). Una lente con corrección UV comerciales relevo fue comprado (Óptica Especialidad) (punto en el diagrama y en el microscopio). Iluminación de la DMD Al recibir su entrada binaria una micromirror puede cambiar entre un positivo y un negativo de 12 ° de inclinación respecto al plano del chip. El eje de rotación a lo largo de las esquinas de cada espejo diagonal (45 ° a los lados del chip). La orientación de la rotación del espejo es designado por un triángulo de color oro en una esquina en la superficie frontal del chip. El ángulo de inclinación de la micromirror dicta la alineación de la cancha y azithmus del haz de iluminación de entrada. El tono del haz de iluminación debe ser de 24 ° desde el eje perpendicular del chip DMD y necesidades azithmus ser perpendicular al eje de rotación del espejo. Alineación del haz precisa es esencial para un funcionamiento eficiente. En el sistema prototipo que hemos diseñado varios ajustes de inclinación manual que nos ha permitido corregir las insuficiencias de diseño y mecanizado. Esto dio lugar a un sistema que es mucho más voluminoso que es necesario. Disposición alternativa, más compacto para traer a la luz es posible (muestra de diseño alternativo, si se considera útil). Para los experimentos de fotólisis una fuente de láser se requiere para generar el haz de luz de alta intensidad necesaria para uncaging rápida. Para los experimentos optogenetic donde la luz de alta intensidad muy concretos no es necesario, una fuente de luz no coherente sería adecuado. En el experimento de fotólisis se describe aquí se empleó un diodo casi continuo bombeo de estado sólido (DPSS) triplicó la frecuencia NdVO4 láser (1 W, 355 nm). (Para una discusión detallada de las opciones de fuentes de luz para la fotólisis ver referencia 2). Un láser de potencia relativamente alta se requiere en los experimentos descritos aquí, ya que sólo una pequeña fracción de la potencia del láser se entrega realmente a la muestra cuando se utiliza un sistema de DMD. La cantidad de luz entregada a la muestra es proporcional a la relación entre el número de ON / OFF espejos dentro de la región iluminada por el rayo láser. Si una fuente de luz láser se requiere, lo mejor es poner en marcha la salida del láser en una fibra multimodo para que pueda ser fácilmente la posición y orientación a lo largo del eje correcto para la iluminación de la DMD. Transmitir la luz a través de la fibra óptica resuelve un segundo problema, la manera de eliminar los patrones de manchas propias de iluminación coherente. La fibra se enrolla alrededor de una camilla de fibras piezoeléctricas (modelo 915, de instrumentación y de Investigación de Canadá, Ltd), que oscila a ~ 40 kHz. (A destacar este hecho en la plataforma) El microscopio de estiramiento de la fibra es suficiente a los movimientos del patrón moteado veces muchos durante la duración de milisegundos de cada pulso de estimulación de fotos, por lo tanto eliminando el efecto de moteado. La salida de la fibra óptica es entonces colimado con un objetivo de microscopio UV (Olympus DApo20UV). (Señalarlo) La calibración de la resolución óptica del sistema se muestra en la figura. 3B. La resolución efectiva fisiológico medido por la amplitud del flujo de corriente en función de la posición del punto de la fotoLa estimulación se muestra en la figura. 3C. Las respuestas actuales a la fotoestimulación de diferentes intensidades se muestra en la figura. 3D. Funcionamiento del sistema: Co-registro de la CCD píxeles con los espejos de DMD Un software de la casa estaba escrito que determina la correspondencia de cada uno de los espejos de DMD píxeles específicos de la cámara de imagen CCD. La interfaz gráfica de usuario (GUI) dentro de este software permite al usuario asignar los espejos DMD que corresponde a la región en la imagen CCD marcados por el ratón. Por lo tanto, la ubicación para la estimulación de fotos se pueden etiquetar con sólo mover el cursor sobre la imagen que aparece en la pantalla del ordenador y haciendo clic en la región de interés marcados. (Una imagen fluorescente de un cenador dendríticas se mostrará en la pantalla del ordenador. El estudiante marca una serie de lugares sobre la imagen en la pantalla del ordenador.) Programación de los patrones para la entrega de la luz El patrón marcado en la pantalla del ordenador por parte del operador se almacena como una serie de imágenes separadas. El tiempo de los pulsos del láser para cada patrón espacial se programa en el software que se integra con el programa de adquisición de datos (pCLAMP). (Demostrarlo). La coordinación de los pulsos de láser a los patrones de DMD El programa de adquisición de datos inicia y coordina los tiempos de la electrónica de DMD, la compuerta del láser, y la adquisición de la revisión fijada señal eléctrica de la neurona diana. (Simular la secuencia en la computadora) Los datos experimentales: No lineales a través de la suma distal puntos de ramificación dendrítica Integración dendríticas con electrodos ha sido tradicionalmente llevada a cabo por la variación de la amplitud de la estimulación en lugares discretos en lugar de ampliar el área de estimulación, manteniendo una intensidad constante. Las cuestiones relativas a la saturación de electrogénesis y el reclutamiento de canales dependen de la ubicación puede influir en el resultado y la conclusión. Estimulación distribuidos dendríticas pueden ser fácilmente implementados usando un sistema basado en DMD (Fig. 4A). La intensidad de entrada se varió al aumentar el número de puntos de fotoestimulación. Podemos ver que la sumación espacial puede ser no lineal en los puntos de ramificación cada vez más supra-lineal con amplitudes de entrada cada vez que llegan a las dos ramas hija. El supra-linealidad está mediada fundamentalmente receptores NMDA y no a la tensión de los canales cerrada (Fig. 5) Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Funcionamiento de los microespejos en la DMD. (Vista lateral) Las fuerzas electrostáticas dirigido a espejos individuales causar el espejo que se inclina en uno de dos posibles orientaciones de 12 ° sobre la horizontal. En la posición en un haz incidente se dirige a lo largo del eje óptico perpendicular del chip. En la posición de apagado del haz incidente se dirige 48 ° fuera del eje. Luz que incide en las diferencias finas entre los espejos se dirige 24 ° fuera del eje. (Vista superior) la inclinación está orientado 45 º con respecto a los lados de los espejos y el chip. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Disposición básica del microscopio de fluorescencia moderna. El cubo de filtro se coloca en el &quot;espacio infinito&quot; entre el objetivo y la lente del tubo. Hay un camino que conduce a la imagen de la cámara y no es un camino de iluminación que lleva la luz a la muestra. La lente del tubo de paso de luz de estos dos suelen ser diferentes en el diseño y en la longitud focal. La iluminación, pero no la imagen, lente de tubo está diseñado para operar en el espectro UV. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Diseño de sistema de UV basados ​​en DMD. Si la iluminación está en el espectro UV, entonces debe ser llevado a través de la lente del tubo que se corrige por la radiación UV. La lente del tubo en el camino de imagen no está diseñado para UV. Un sistema de relevo que se necesita para crear un plano conjugado de la imagen de fácil acceso. Los planos conjugados diferentes imágenes en el microscopio se caracteriza por líneas de puntos rojos. Patrones brillantes en un plano de la imagen se proyecta en planos conjugados otros. Durante la exploración del patrón en el plano de la muestra se proyecta sobre el detector / cámara. Para la iluminación del patrón generado por la DMD se proyecta sobre la muestra. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Diseño de la luz visible sistema de proyección de DMD. Si la luz de la iluminación está en el rango visible, es posible hasta que la DMD patrón generado la luz a través de la trayectoria de la luz imágenes. Esto puede ser fácilmente implementado con commercial doble adjuntos puerto de la cámara y el espejo dicroico apropiado. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Resolución lateral del sistema. (A) La resolución óptica en el blanco fluorescente ~ 2 micras. (B) Resolución efectiva, medida por fotólisis de glutamato enjaulado a través de una dendrita es de ~ 5 micras. El aumento de la distancia se debe a una combinación de difusión de glutamato y la anchura finita de la dendrita. (C) fotólisis puede simular la cinética de los eventos sinápticos. La familia de la tensión de sujetar las respuestas actuales se debe a las variaciones en la energía de la luz entregada a la dendrita. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. No lineal a través de la suma los puntos de ramificación dendrítica. (A) los insumos distribuidos se aplica a dos ramas dendríticas por separado. Sus respuestas respectivas de tensión se muestran a continuación. (B) Los estímulos se le dan al mismo tiempo. La respuesta medida (rojo traza) es diferente a la suma aritmética de las dos respuestas individuales (gris traza). <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Suma la figura 7. Supralineal es dependiente de los receptores NMDA. (A) APV, un antagonista selectivo del receptor de NMDA bloquea la suma supralineal. (B) La relación de la intensidad del estímulo y su sensibilidad a los antagonistas de los receptores NMDA se ha trazado.

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	<li>Scanziani, M., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930-939 (2009).</li><li>Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolysis+of+caged+neurotransmitters:+Theory+and+procedures+for+light+delivery.">Photolysis of caged neurotransmitters: Theory and procedures for light delivery.</a> Curr. Prot. Neurosci. , 6.21.1-6.21.12 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+Technology+Feature,+Cell+imaging:+Light+activated.">Nature Technology Feature, Cell imaging: Light activated.</a> Nature. 456, 826-827 (2008).</li><li>Lutz, C., Otis, T. S., DeSars, V., Charpak, S., DeGregorio, D. A., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+photolysis+of+caged+neurotransmitters.">Holographic photolysis of caged neurotransmitters.</a> Nature Methods. 5, 821-827 (2008).</li><li>Hornbeck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Digital Light Processing and MEMs: An overview. , .</li></ol>

La ventaja del enfoque basado en DMD fotoestimulación es más evidente en situaciones donde el objetivo ocupa un área relativamente grande. Si el objetivo de interés es muy pequeño, como una las espinas dendríticas pocos sistemas secuenciales confocal de barrido y dos fotones es probable que sean el mejor enfoque. Una debilidad importante del enfoque de DMD es el uso ineficiente de la luz disponible. La mayor parte de la luz disponible es necesariamente dirigida a los espejos OFF y no se utiliza. <p class="jove...

Erratum: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Modern upright fluorescent microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD camera and image acquisition software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Computer and data acquisition/interface system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DLP Discovery Developer Kit </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ALP3 USB interface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>S2 + Optics w/LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dual camera port unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DPSS Laser Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser shutter Model LS6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Uniblitz</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Canadian Instrument and Research, Ltd </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>100 um core multimode fiber</td>
</tr>
<tr>
<td>Multimode Fiber launcher </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Oz Optics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Signal generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>up to 50 kHz</td>
</tr>
<tr>
<td>Beam collimator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>DApo20UV340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UV relay lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Special Optics</td>
<td>#: 54-25-60-355</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

patterned photostimulation with digital micromirror devices to investigate dendritic integration across branch points

La luz es un medio versátil y preciso para el control de la excitabilidad neuronal. La reciente introducción de la luz efectores sensibles tales como el canal-rodopsina y los neurotransmisores enjaulados han llevado a los intereses en el desarrollo de mejores medios para controlar los patrones de luz en el espacio y el tiempo que son útiles para la neurociencia experimental. Una de las estrategias convencionales, empleados en microscopía confocal y dos fotones, es para enfocar la luz hacia un punto de difracción limitada y luego buscar ese lugar único secuencial a lo largo de la región de interés. Este enfoque se vuelve problemático si grandes áreas tienen que ser estimulado dentro de una ventana de tiempo breve, un problema más aplicable a la fotoestimulación de la imagen. Una estrategia alternativa consiste en proyectar el patrón espacial completo en el destino con la ayuda de un dispositivo digital de microespejos (DMD). El enfoque de DMD es atractiva porque los componentes de hardware son relativamente baratos y con el apoyo de intereses comerciales. Debido a que este sistema no está disponible para microscopios verticales, vamos a discutir los temas críticos en la construcción y operación de un sistema de DMD. A pesar de que serán los principales que describen la construcción del sistema de fotólisis UV, las modificaciones para la construcción del sistema mucho más simple la luz visible para los experimentos optogenetic también se proporcionará. El sistema de fotólisis UV se utilizó para llevar acabo experimentos para estudiar una cuestión fundamental en la neurociencia, ¿cómo son distribuidos espacialmente entradas integradas a través de los puntos de ramificación distal dendríticas. Los resultados sugieren que la integración puede ser no lineal en los puntos de ramificación y el supralinearity es en gran parte mediada por los receptores NMDA.

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Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

Dispositivos digitales de microespejos (DMD) pueden generar patrones complejos en tiempo y espacio con el que el control de la excitabilidad neuronal. Temas relevantes para el diseño, construcción y operación de sistemas de DMD se discuten. Dicho sistema permitió a la demostración de la no-lineal de integración a través de los puntos de ramificación distal dendríticas.

Patrón fotoestimulación con dispositivos digitales de Micromirror encargado de investigar la integración a través de puntos dendríticas Poder

Light is a versatile and precise means to control neuronal excitability. The recent introduction of light sensitive effectors such as channel-rhodopsin ...

patterned-photostimulation-with-digital-micromirror-devices-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.5K vistas.  University of Maryland School of Medicine. Dispositivos digitales de microespejos (DMD) pueden generar patrones complejos en tiempo y espacio con el que el control de la excitabilidad neuronal. Temas relevantes para el diseño, construcción y operación de sistemas de DMD se discuten. Dicho sistema permitió a la demostración de la no-lineal de integración a través de los puntos de ramificación distal dendríticas.

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Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

La creación de dos dimensiones con dibujos sustratos para el confinamiento de proteínas y células

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Investigación

Bioingeniería

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. Additionally, traversing cellular barriers in the body is crucial for both oral delivery of therapeutic NCs into the circulation and transport from the blood into tissues, where intervention is needed. NC transport across cellular barriers is achieved by: (i) the paracellular route, via transient disruption of the junctions that interlock adjacent cells, or (ii) the transcellular route, where materials are internalized by endocytosis, transported across the cell body, and secreted at the opposite cell surface (transyctosis). Delivery across cellular barriers can be facilitated by coupling therapeutics or their carriers with targeting agents that bind specifically to cell-surface markers involved in transport. Here, we provide methods to measure the extent and mechanism of NC transport across a model cell barrier, which consists of a monolayer of gastrointestinal (GI) epithelial cells grown on a porous membrane located in a transwell insert. Formation of a permeability barrier is confirmed by measuring transepithelial electrical resistance (TEER), transepithelial transport of a control substance, and immunostaining of tight junctions. As an example, ~200&#160;nm polymer NCs are used, which carry a therapeutic cargo and are coated with an antibody that targets a cell-surface determinant. The antibody or therapeutic cargo is labeled with 125I for radioisotope tracing and labeled NCs are added to the upper chamber over the cell monolayer for varying periods of time. NCs associated to the cells and/or transported to the underlying chamber can be detected. Measurement of free 125I allows subtraction of the degraded fraction. The paracellular route is assessed by determining potential changes caused by NC transport to the barrier parameters described above. Transcellular transport is determined by addressing the effect of modulating endocytosis and transcytosis pathways.

Many therapeutic applications require safe and efficient transport of drug carriers and their cargoes across cellular barriers in the body. This article describes an adaptation of established methods to evaluate the rate and mechanism of transport of drug nanocarriers (NCs) across cellular barriers, such as the gastrointestinal (GI) epithelium.

Modelos y métodos para evaluar el transporte de Drug Delivery Systems a través de barreras celulares

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Sistema de Difusión de degradado para Investigar quimiotaxis en una matriz de colágeno 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

La fabricación de una funcionalizado magnética bacteriana NANOCELULOSA con nanopartículas de óxido de hierro

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and provide information for follow-up treatment. Here, we demonstrate the development of a cotton-based urinalysis (i.e., nitrite, total protein, and urobilinogen assays) analytical device that employs a lateral flow-based format, and is inexpensive, easily fabricated, rapid, and can be used to conduct multiple tests without cross-contamination worries. Cotton is composed of cellulose fibers with natural absorptive properties that can be leveraged for flow-based analysis. The simple but elegant fabrication process of our cotton-based analytical device is described in this study. The arrangement of the cotton structure and test pad takes advantage of the hydrophobicity and absorptive strength of each material. Because of these physical characteristics, colorimetric results can persistently adhere to the test pad. This device enables physicians to receive clinical information in a timely manner and shows great potential as a tool for early intervention.

To investigate simple fabrication approaches for multiple assay needs, we created a fluid-absorbing channel system made of cotton material. This device was used to establish a multiple detection platform, and solve contamination issues that commonly affect lateral flow-based biomedical devices, for clinical urinalysis of nitrite, total protein, and urobilinogen.

La fabricación de dispositivos analíticos de algodón

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

El uso de adhesivo Patrones para construir dispositivos de microfluidos de papel 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular cartilage impairs its load-bearing function substantially as it experiences tremendous chemical degradation, i.e. proteoglycan loss and collagen fibril disruption. One promising way to investigate chemical damage mechanisms during OA is to expose the cartilage specimens to an external solute and monitor the diffusion of the molecules. The degree of cartilage damage (i.e. concentration and configuration of essential macromolecules) is associated with collisional energy loss of external solutes while moving across articular cartilage creates different diffusion characteristics compared to healthy cartilage. In this study, we introduce a protocol, which consists of several steps and is based on previously developed experimental micro-Computed Tomography (micro-CT) and finite element modeling. The transport of charged and uncharged iodinated molecules is first recorded using micro-CT, which is followed by applying biphasic-solute and multiphasic finite element models to obtain diffusion coefficients and fixed charge densities across cartilage zones.

We propose a protocol to investigate the transport of charged and uncharged molecules across articular cartilage with the aid of recently developed experimental and numerical methods.

Un experimental y el Protocolo de elementos finitos para investigar el transporte de solutos neutros y cargadas a través de cartílago articular

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Soft Lithographic Procedure for Producing Plastic Microfluidic Devices with View-ports Transparent to Visible and Infrared Light

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable microfluidic devices. Here, a protocol for the fabrication of plastic microfluidic devices is demonstrated, where soft lithographic techniques are used to embed transparent Calcium Fluoride (CaF2) view-ports in connection with observation chamber(s). The method is based on a replica casting approach, where a polydimethylsiloxane (PDMS) mold is produced through standard lithographic procedures and then used as the template to produce a plastic device. The plastic device features ultraviolet/visible/infrared (UV/Vis/IR) -transparent windows made of CaF2 to allow for direct observation with visible and IR light. The advantages of the proposed method include: a reduced need for accessing a clean room micro-fabrication facility, multiple view-ports, an easy and versatile connection to an external pumping system through the plastic body, flexibility of the design, e.g., open/closed channels configuration, and the possibility to add sophisticated features such as nanoporous membranes.

A protocol for the fabrication of plastic microfluidic devices with transparent view-ports for visible and infrared light imaging is described.

Procedimiento suave litográfica para la producción de dispositivos microfluídicos plástico con puertos de vista transparentes a luz Visible e infrarroja

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic respiration. However, the extent to which both pathways contribute to the landscape of cellular energy production is consistently overlooked. Transformed cells cultured in saturating levels of glucose often show a decreased dependency on oxidative phosphorylation for ATP production, which is compensated by an increase in substrate-level phosphorylation. This shift in metabolic poise allows cells to proliferate despite the presence of mitochondrial toxins. In neglecting the altered metabolic poise of transformed cells, results from a pharmaceutical screening may be misinterpreted since the potentially mitotoxic effects may not be detected using model cell lines cultured in the presence of high glucose concentrations. This protocol describes the pairing of two powerful techniques, respirometry and calorimetry, which allows for the quantitative and noninvasive assessment of both aerobic and anaerobic contributions to cellular ATP production. Both aerobic and anaerobic respirations generate heat, which can be monitored via calorimetry. Meanwhile, measuring the rate of oxygen consumption can assess the extent of aerobic respiration. When both heat dissipation and oxygen consumption are measured simultaneously, the calorespirometric ratio can be determined. The experimentally obtained value can then be compared to the theoretical oxycaloric equivalent and the extent of the anaerobic respiration can be judged. Thus, calorespirometry provides a unique method to analyze a wide range of biological questions, including drug development, microbial growth, and fundamental bioenergetics under both normoxic and hypoxic conditions.

This protocol describes calorespirometry, the direct and simultaneous measurement of both heat dissipation and respiration, which provides a noninvasive approach to assess energy metabolism. This technique is used to assess the contribution of both aerobic and anaerobic pathways to energy utilization by monitoring the total cellular energy flow.

Calorespirometry: Es un enfoque potente y no invasivo para investigar el metabolismo energético celular

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

Alta resolución con motivos Biofilm deposición utilizando pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...