للبدء ، قم بإزالة قوارير الحرير FN من الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر ، وضعها في الثلج الجاف للنقل. أحضر القوارير إلى خزانة السلامة البيولوجية ، وضعها في رف أنبوب الطرد المركزي الصغير. عند الذوبان ، قم بإدخال 550 ميكرولتر من محلول الحرير في كل بئر ثان من صفيحة 48 بئرا.
ضع الغطاء على الطبق وضعه داخل صندوق معقم. انقل الصندوق بعناية من خزانة السلامة البيولوجية ، واتركه في الظروف المحيطة طوال الليل. في اليوم التالي ، أحضر الصندوق الذي يحتوي على اللوحة مع أغشية الحرير FN والإدخالات المعقمة في خزانة السلامة البيولوجية.
ارفع اللوحة بعناية من الصندوق ، وافتح غطاء اللوحة ، وتحقق بصريا من تكوين الغشاء من خلال مراقبة الغيوم في الآبار. باستخدام ملاقط معقمة ، التقط حشوة واحدة ووجهها لأسفل على الغشاء حتى تلامس المقابض الجزء العلوي من البئر. بمجرد خفض جميع الإدخالات ، ضع الغطاء على اللوحة ، وأعد اللوحة إلى الصندوق المعقم.
اسمح للأغشية بالالتصاق بالإدخالات لمدة ساعتين. بعد ذلك ، قم بإزالة اللوحة من الصندوق وافتح الغطاء. باستخدام ملاقط معقمة ، قم بإزالة الملحق من البئر.
املأ الملحق ب 100 ميكرولتر من DMEM / F12 للبذر القاعدي ، أو 200 ميكرولتر للبذر القمي. انقل الملحق إلى بئر فارغ من صفيحة 24 بئرا ، واملأ البئر بمليلتر واحد من DMEM / F12. بعد حصاد العدد المطلوب من الخلايا الكيراتينية البشرية ، باستخدام ماصة P200 ، استنشق 20 إلى 50 ميكرولترا من تعليق الخلية.
صوب طرف الماصة نحو مركز الغشاء واضغط ببطء على مكبس الماصة، مما يجعل القطرة ملامسة لوسط المزرعة داخل الملحق. بمجرد نقل جميع الأغشية ، حرك اللوحة في نمط الشكل ثمانية لتوزيع الخلايا بالتساوي عبر الأغشية. احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
باستخدام الملقط ، ارفع الحشوات من اللوحة المكونة من 24 بئرا ، واترك وسط الاستزراع في الآبار. ثم اقلب الملحق بحيث يكون الجانب القاعدي متجها لأعلى. ضع الملحق المقلوب في طبق بتري.
استنشق 20 ميكرولترا من تعليق خلية الكيراتينات البشرية المعلقة باستخدام ماصة P200. صوب طرف الماصة نحو مركز الغشاء، واضغط ببطء على مكبس الماصة لتشكيل قطرة تسقط على الغشاء. ضع الغطاء على طبق بتري.
انقل طبق بتري وطبق متوسط الاحتواء على 24 بئرا إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، أحضر الطبق المكون من 24 بئرا وطبق بتري إلى خزانة السلامة البيولوجية. باستخدام الملقط ، اختر إدخالا واحدا وقم بقلبه بحيث يكون الجانب القمي للغشاء متجها لأعلى والجانب القاعدي لأسفل.
باستخدام ماصة P200، أضف 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع داخل الملحق. ضع الملحق مرة أخرى في بئر مملوء مسبقا من اللوحة المكونة من 24 بئرا. استزراع الإدخالات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
غطت الخلايا الكيراتينية المستزرعة على غشاء الحرير FN السطح بالتساوي وأظهرت مورفولوجيا مرصوفة بالحصى في اليوم الأول. شكلت الخلايا الكيراتينية طبقة ملتقية بحلول اليوم الثالث ، مما يشير إلى الوظيفة الظهارية ، وشكلت شبكة من التقاطعات الضيقة التي تشير إلى أنها كانت تتولى وظائف ظهارية فسيولوجية. لوحظت قابلية عالية للخلايا على البقاء عبر أغشية الحرير FN بعد ثلاثة أيام ، مع عدم وجود فرق كبير في الجدوى بين المركز والمحيط.
دعم نظام غشاء الحرير FN صلاحية الخلايا الكيراتينية المشابهة أو أفضل من أنظمة أغشية PET التجارية.
