ويدعم هذا البحث من قبل مؤسسة هارتويل ، وجمعية القلب الاميركية (عالم التنمية المنحة # 0830384N) ومؤسسة Leducq : 07CVD04 التاجي.

1. إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان السمان الخصبة أو بيض الدجاج لمرحلة 14 -- (حوالي 2 يوما) أو 25 (حوالي 4.5 أيام) عند درجة رطوبة 60 ٪ و 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول معقم للملح ايرل المتوازن (EBSS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 مل 10X EBSS إلى 600 مليلتر من الماء MΩ 18 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بيكربونات الصوديوم 2.2 غرام </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الرقم الهيدروجيني من الحل إلى 7.2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم حل ما يصل إلى 1000 مل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الحل عن طريق تمرير من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد عقيمة مستنبت M199. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 حزمة من مسحوق M199 إلى 700 مل ماء MΩ 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بيكربونات الصوديوم 2.2 غرام </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الرقم الهيدروجيني من الحل إلى 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل (1 ٪) البنسلين ، الستربتوميسين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم حل ما يصل إلى 1000 مل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الحل عن طريق تمرير من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل العقيمة 100X الانسولين ترانسفيرين السيلينيوم - G - تكملة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل (1 ٪) عقيمة من مصل الدجاج </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ثلاث الابعاد المواد الهلامية الكولاجين الكولاجين بتركيز 1.5 ملغ / مل. وقد أظهرت الأعمال السابقة في مختبرنا أن تركيز مادة الكولاجين أكثر من 1.5 ملغ / مل يوفر مصفوفة التي biomechanically قاسية جدا للخلايا للتنقل. هلام الكولاجين تركيزات أقل من 1.5 ملغ / مل من ألياف الكولاجين قليلة بحيث تتجمع الخلايا يمكن أن أجاد الألياف محليا ، وتنتج جزيرة من الخلايا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة التالية الجليد الباردة الكواشف إلى العقيمة 15 مل أنبوب الطرد المركزي من أجل : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3X M199 : حجم = إجمالي حجم اللازمة / 3 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MΩ المياه المعقمة 18 : حجم = إجمالي حجم الضرورية (M199 + حجم الدجاج حجم المصل + 0.1 هيدروكسيد الصوديوم حجم M حجم الكولاجين +) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معقمة مصل الدجاج : حجم = إجمالي حجم اللازمة * 0.01 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفئران الكولاجين الذيل الأول : حجم = (الكولاجين تركيز جل * إجمالي حجم الضرورة) / الكولاجين تركيز الأسهم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هيدروكسيد الصوديوم العقيمة 0.1 M : المجلد = 0.2 * حجم الكولاجين ملاحظة : كمية المياه ، 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم ، والكولاجين وأضاف سوف تختلف تبعا لتركيز محلول المخزون الكولاجين. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج الكولاجين حل جيد مع ماصة معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل على الفور 0.3 مل من محلول الكولاجين في 1.9 سم 2 آبار منطقة النمو. هذا هو ما يكفي لتغطية الحل الكولاجين تماما البئر وتوفير جل أن ما يقرب من 3 مم. وسمك جل ما لا يقل عن 250 ميكرون هو ضروري للدراسات غزو الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسمح الحل الكولاجين لجل ما لا يقل عن 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 ، و 100 ٪ الرطوبة. </li></ol></li></ol> 2. قبل EMT عزل خلية الشغاف والثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جنين العزلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان قطعة واحدة طويلة شبر من الشريط على أكبر مختبر نهاية البيض. هذا هو المكان الذي يقع الخلية الهواء. الشريط استقرار البويضة السمان الهشة قذيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقب بلطف المنطقة مسجلة للبويضة في الخلية الهواء مع غيض من مقص منحني تعقيمها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع ثقب في الجزء مسجلة للبويضة كبيرة بما يكفي للسماح للصفار بالمرور. بدء ثقب في ثقب وقطع الخارج في شكل حلزوني. تأكد من قطع طريق الغشاء الخارجي ، ولكن تجنب اختراق صفار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما ثقب في وعاء كاملة ، تصور الجنين السمان. يقع عادة الجنين في الجانب العلوي من صفار البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البدء في صب صفار من خلال ثقب في قطع البيض مع يد واحدة. عقد منتاش # 55 في اليد الأخرى. كما الجنين خروجها من البيض في الجانب العلوي من صفار البيض ، حرك بلطف ملاقط # 55 تحت الجنين وإزالته من صفار البيض. ملاحظة : للحصول على بيض الدجاج ، وعزل الجنين تتضمن تكسير البيض الدجاج على سطح نظيف الحاد وكسر البيض في صحن بيتري 100 ملم. يجب أن يكون موجودا في الجنين في الجانب العلوي من صفار البيض. الشريحة بلطف # 55 ملاقط تحت الجنين وإزالته من صفار البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجنين في طبق بتري 100 ملم تحتوي على الجليد الباردة ، EBSS العقيمة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرحلة الأجنة وفقا لمعايير همبرغر وهاميلتون 1. الأجنة في مرحلة 14 -- 13 من المرحلة الماضية ، ولكن لم نصل بعد إلى المرحلة 15 ، مع 20-21 somites وبرعم الذيل. ومن الخصائص الرئيسية لمرحلة 14 -- الأجنة هي الزاوية الرأس ، وهو أكبر قليلا من 90 درجة الى الجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قلوب من الأجنة في مرحلة السمان 14 -- عن طريق قطع بالعرض حيث قناة AV OFT واجراء اتصالات مع جدار الصدر مع ملاقط # 55. مكان قلوب معا على جانب واحد من طبق بيتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع قلوب معزولة مع ماصة نقل معقمة ووضعها في صحن بيتري الجديدة 100 مم مملوءة العقيمة EBSS الجليد الباردة. </li><html><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع OFTs والقنوات AV بالعرض من البطينين مع ملاقط # 55. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسم القنوات المتبقية للمركبات و / أو مساحات تدفق (OFTs) طوليا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين ماصة لحجم 20 ماي. استخدام هذا ماصة لنضح six طوليا قطع قنوات AV وOFTs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرد القنوات AV وOFTs على الجل الكولاجين. نضح أي EBSS الزائدة من سطح هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملاقط ل# 55 explants المشرق بحيث تكون مسطحة وبالتالي فإن الجانب التجويف يواجه الجل الكولاجين. ليس محاولة لثقب هلام الكولاجين مع ملاقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 2 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 ، إزالة عضلة القلب من explants مع ملاقط # 55. ينبغي ترك الخلايا وراء الشغاف على سطح الجل الكولاجين. بدلا من ذلك ، يمكن ترك لعضلة القلب على ازدراع. مع إزالة عضلة القلب ، والخلايا الشغاف مع عدم الخضوع EMT دون تدخل. عضلة القلب مع الحاضر ومجموعة فرعية من خلايا اللحمة المتوسطة تتحول الشغاف ، ولكن درجة التحول يمكن التضمين مع العوامل الخارجية. ملاحظة : حتى لو ستترك على عضلة القلب ، ويجب أن يسمح لازدراع لا يقل عن 2 ساعة لنعلق على الجل قبل إضافة المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.4 مل M199 المتوسط ​​وتحتوي على كل explants جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 ، و 100 ٪ الرطوبة. </li></ol> 3. بعد EMT AV عزل خلية سائد الوسيطة والثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كسر بيضة الدجاج على سطح نظيف الحاد وكسر البيض في صحن بيتري 100 ملم. يجب أن يكون موجودا في الجنين في الجانب العلوي من صفار البيض. التقاط الجنين مع # 5 بواسطة ملاقط الاستيلاء على الأغشية التي تحيط بالجنين ثم ضع الجنين في طبق بتري 100 مم مملوءة EBSS والثلج الباردة العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرحلة الأجنة وفقا لمعايير همبرغر وهاميلتون 1. ملامح الجنين وتشمل 25 مرحلة متميزة الكوع والمفاصل في الركبة وتصبغ طفيف العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل من جميع قلوب الأجنة ومكان HH25 قلوب معا على جانب واحد من طبق بيتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع قلوب معزولة مع ماصة نقل معقمة ووضعها في صحن بيتري الجديدة 100 مم مملوءة العقيمة EBSS الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل المنطقة AV من كل القلوب في آن واحد. وضع الهلال معا في جانب واحد من طبق بيتري. تستنهض الهمم المنطقة بلطف لإزالة جميع مركبات الدم ، التي يمكن أن تؤثر على بقاء الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الهلال مع معزولة ماصة نقل معقمة ووضعها في صحن بيتري الجديدة 100 مم مملوءة العقيمة EBSS الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل بالتسلسل وسائد من AV. تأكد من عدم وجود الحاضر على عضلة القلب وسائد AV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع وسائد معزولة مع ماصة نقل معقمة ووضعها في أنبوب 15 مل العقيمة الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في الوسائد إلى أسفل أنبوب الطرد المركزي في 15 XG لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام غيض العقيمة مل 1000 لإزالة أكبر قدر من طاف EBSS ممكن من دون إزعاج الوسائد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من 0.25 ٪ التربسين - EDTA الذي تم قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية. السماح للسائد في لاحتضان التربسين حتى تذوب تماما والتي هي عادة حوالي 3-5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من مصل الدجاج إلى أنبوب الطرد المركزي لإخماد التربسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا في 160 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف مع طرف عقيمة ، ميكرولتر 1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 2 مل من مزيج M199 المتوسطة والتي pipetting. يستغرق 10 ميكرولتر لتعليق الخلية إلى الاعتماد على عدادة الكريات وتحديد عدد الخلايا التي تم عزلها </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد وستتاح المواد الهلامية الكولاجين استنادا إلى عدد من الخلايا المعزولة. الخلايا تحتاج إلى مطلي في كثافة الخلايا 2 × 5 10 / مل مع حجم 250 هلام ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا في 160 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف مع طرف عقيمة ، ميكرولتر 1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام بروتوكول المذكورة أعلاه ، إضافة M199 3X ، والمياه ، والدجاج مصل ، والكولاجين ، وهيدروكسيد الصوديوم 0،1 م ، في هذا النظام ، لبيليه الخلية. مزيج لطيف من قبل pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى 250 ميكرولتر كل مجال من مجالات النمو 1.9 سم 2 أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسمح الحل الكولاجين لجل ما لا يقل عن 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 ، و 100 ٪ الرطوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.4 مل من وسائل الإعلام والثقافة ، واحتضان بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستمرار في زراعة المواد الهلامية في ظروف خالية من الإجهاد ، وتحرير المواد الهلامية من جوانب الثقافة باستخدام بئر العقيمة 200 غيض ميكرولتر ماصة. ثقافات مقيدة ميكانيكيا والمواد الهلامية التي لا تزال تعلق على جوانب الثقافة أيضا. </li></ol> 4. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 : يتم عرض أمثلة للأجنة (أ) الجنين HH14 - السمان ، و (ب) الجنين الدجاج HH25 هنا. fig2.jpg &quot;بديل =&quot; الشكل 2 &quot;/&gt; الشكل 2 : HH14 صمام explants الشغاف بعد 2 ساعة من ثقافة (A) مع الحاضر عضلة القلب ، أو (ب) مع إزالة عضلة القلب. <img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3 : HH14 صمام explants الشغاف (A) مع الحاضر عضلة القلب ، والعديد من الخلايا الشغاف الخضوع لعملية التحول الوسيطة ويكون على شكل مغزلي ، النمط الظاهري الوسيطة بعد 48 ساعة من الثقافة. (ب) عند إزالة عضلة القلب كافة الخلايا الحفاظ على الحصوه الشكل ، النمط الظاهري الشغاف بعد 48 ساعة في الثقافة. <img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig4.jpg" alt="الشكل 4"/> يتم تقريب الخلايا خلايا اللحمة المتوسطة صمام HH25 في هلام الكولاجين مباشرة بعد الغرس : الشكل 4. <img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig5.jpg" alt="الشكل 5"/> الشكل 5 : HH25 خلايا اللحمة المتوسطة في الثقافة (A) بعد 48 ساعة من الثقافة في جل الكولاجين مقيدة الخلايا HH25 الوسيطة هي بداية لانتشار المرض. (B) وضغط HH25 خلايا الكولاجين في هلام خالية من التوتر بعد 7 أيام من البذر و 6 ايام بعد التحرير الجل إلى ما يقرب من 50 ٪ من المساحة الأصلية.

<ol>
	<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J Morphol. 88, 49-92 (1951).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+A+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: A regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Developmental Biology. 95, 108-108 (1983).</li><li>Butcher, J. T., Norris, R. A., Hoffman, S., Mjaatvedt, C. H., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periostin+promotes+atrioventricular+mesenchyme+matrix+invasion+and+remodeling+mediated+by+integrin+signaling+through+Rho/PI+3-kinase.">Periostin promotes atrioventricular mesenchyme matrix invasion and remodeling mediated by integrin signaling through Rho/PI 3-kinase.</a> Developmental Biology. 302, 256-256 (2007).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

طريقة لعزل خلايا الشغاف من مرحلة HH14 -- قلوب ضعت أصلا من قبل وRunyan Markwald يوفر للرقابة ، في بيئة المختبر لدراسة العوامل التي تشرع وتعدل EMT الجنينية 2. HH14 -- سوف explants الشغاف مثقف دون الخضوع لعضلة القلب لا EMT النشاط الحيوي دون تدخل أو البيوكيميائية. إ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Extra fine Bonn scissors, curved</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14085-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont tweezers #55</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>14099</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont tweezers #5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>14098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile transfer pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Samco Scientific </td>
<td>2041S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4-well culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>176740</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile disposable filter units, PES, 0.2 &mu;m pore size membrane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene</td>
<td>566-0020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile 15 mL centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430828</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International</td>
<td>25384-342</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laboratory tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International</td>
<td>89097-920</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat-tail collagen I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354236</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10X Earl's Balanced Salt Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Quality Biological, Inc.</td>
<td>119-064-131</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>M199 powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>31100-035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41400-045</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chicken serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16110-082</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25200-056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S5761</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium hydroxide solution, 1.0 N</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S2770</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fertile quail eggs (Coturnix coturnix)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lake Cumberland Game Bird Farm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fertile chicken eggs (Gallus gallus)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cornell University Poultry Farm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells

تشكيل السليم وظيفة صمامات القلب الجنينية أمر حاسم بالنسبة لتطور التنموي. قلب الجنين في وقت مبكر هو أنبوب على شكل حرف U من البطانة وتحيط بها عضلة القلب. وتفرز عضلة القلب القلب هلام ، ومصفوفة هلامي hyaluronan الغنية ، في مفترق الطرق (AV) والقناة الأذينية البطينية تدفق (OFT) التجويف. في هذه المرحلة تبدأ عندما HH14 valvulogenesis مجموعة فرعية من الخلايا الشغاف تلقي إشارات من عضلة القلب ، والخضوع لعملية التحول الشغاف الوسيطة (EMT) ، وغزو هلام القلب. في هذه المرحلة هي HH25 mesenchymalized بالكامل وسائد الصمامات ، وهذا هو اللحمة المتوسطة التي تشكل في نهاية المطاف الجهاز الصمامات والحاجز للقلب. فهم الآليات التي تعدل والشروع في عملية التمايز الخلوي وEMT مهمة بسبب علاقتهم خطيرة عيوب خلقية في القلب. في هذه الدراسة نقدم طرق لعزل قبل EMT الشغاف وبعد EMT خلايا اللحمة المتوسطة ، والتي هما الظواهر المختلفة للخلية وسادة prevalvular. يمكن تربيتها قبل EMT الخلايا الشغاف مع أو بدون عضلة القلب. يمكن تربيتها بعد EMT خلايا اللحمة المتوسطة وسادة AV المواد الهلامية الكولاجين داخل مقيدة ميكانيكيا أو خالية من الإجهاد. هذه النماذج في 3D المختبر تحاكي الأحداث الرئيسية morphogenic صمامي ومفيدة لتفكيك آليات valvulogenesis المرحلة المبكرة والمتأخرة.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells at JoVE.com

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

هذه المادة سوف توفر وسيلة لعزل وزراعة السمان أو الدجاج HH14<sup&gt; --</sup&gt; صمام الخلايا الشغاف وسادة HH25 خلايا صمام الوسيطة.

العزلة وثقافة الطيور الجنينية الخلايا الاصلية صمامي

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

isolation-and-culture-of-avian-embryonic-valvular-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K Views.  Cornell University. هذه المادة سوف توفر وسيلة لعزل وزراعة السمان أو الدجاج HH14 -- صمام الخلايا الشغاف وسادة HH25 خلايا صمام الوسيطة.

Video: Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the cerebellar neuronal types (granule cells, Purkinje cells and inhibitory interneurons), granule neurons are by far the most numerous and are the most abundant type of neurons in the mammalian brain. In rodents, cerebellar granule neurons are generated during the first two post-natal weeks from progenitor cells in the outermost layer of the cerebellar cortex, the external granule layer (EGL). The protocol presented here describes techniques to enrich and culture granule neurons and their progenitor cells from post-natal mouse cerebellum. We will describe procedures to obtain cultures of increasing purity3,4, which can be used to study the differentiation of proliferating progenitor cells into granule neurons5,6. Once the progenitor cells differentiate, the cultures also provide a homogenous population of granule neurons for experimental manipulation and characterization of phenomena such as synaptogenesis, glutamate receptor function7, interaction with other purified cerebellar cells8,9 or cell death7.

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Here we present a method to isolate and culture cerebellar granule neuron progenitor cells and cerebellar granule neurons from postnatal mouse.

العزلة وثقافة ما بعد الولادة ماوس مخيخي الخلايا الحبيبية السلف الخلية العصبية والخلايا العصبية

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

الثقافة والمحافظة على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

العزلة وتوقعات بنمو كبير من الكبار الإنسان خلايا غشائي السلف تشكيل مستعمرة

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

العزلة واشتقاق خلايا الفأر الجنينية بيرشوت

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

الكبار والعضلات والهيكل العظمي الجنينية Microexplant الثقافة وعزل خلايا جذعية عضلية هيكلية

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

عزل الخلايا البطانية صمامي

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

العزلة والثقافة في الخلايا البطانية الرئوي من الفئران حديثي الولادة

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

العزلة والثقافة في خلايا كلوية المنشأ من منطقة من الفأر الجنينية الكلى

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

عزلة الجنينية البطيني الخلايا البطانية

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...