승모판 07CVD04 :이 연구는 하트웰 재단, 미국 심장 협회 (과학자 개발 권한 부여 # 0830384N) 및 재단 Leducq에 의해 지원됩니다.

1. 준비 <ol><li> 비옥한 메추라기 또는 단계 14 닭 알을 품어 - 25 (2 일간) (4.5 일) 60 % 습도와 37 ° C.에 </li><li> 무균 얼 밸​​런스드 소금 솔루션을 준비 (EBSS) <ol><li> 600 ML 18 MΩ 물 100 ML 10X EBSS 추가 </li><li> 2.2 g의 나트륨 중탄산염 추가 </li><li> 7.2 솔루션의 산도를 조절 </li><li> 최대 1000 ML에 대한 해결책을 가지고 </li><li> 0.2 μm의 필터를 통과하여 솔루션을 소독 </li></ol></li><li> 무균 M199 문화 매체를 준비합니다. <ol><li> 700 ML 18 MΩ 물이 M199 분말 1 패키지를 추가합니다. </li><li> 2.2 g의 나트륨 중탄산염 추가 </li><li> 7.2 솔루션의 산도를 조정합니다. </li><li> 10 ML (1 %) 페니실린 - 스트렙토 마이신 추가 </li><li> 최대 1000 ML에 대한 해결책을 가지고 </li><li> 0.2 μm의 필터를 통과하여 솔루션을 소독 </li><li> 1 ML 무균 100X 인슐린 트랜스페린 - 셀레늄 - G 보충 추가 </li><li> 10 ML (1 %) 무균 닭 혈청 추가 </li></ol></li><li> 1.5 MG / ML의 콜라겐 농도에서 입체 콜라겐 젤을 준비합니다. 우리가 실험실에서 이전 작품보다 1.5 MG / ML의 콜라겐 농도는 세포가 이동할 수 있도록 너무 biomechanically 딱딱하게되는 매트릭스를 제공하는 것으로 나타났습니다. MG / ML은 세포 덩어리가 세포의 섬을 생산, 로컬 섬유는 분쇄기에 넣어 수 있도록 몇 가지 콜라겐 섬유가 1.5보다 콜라겐 겔 농도 낮아집니다. <ol><li> 위해서는 멸균 15 ML의 원심 관에 다음 얼음처럼 차가운 시약 추가 : <ul><li> 배 M199 : 볼륨 = 총 판매량 필요한 / 3 </li><li> 무균 18 MΩ 물 : 볼륨 필요 = 총 부피 (M199 볼륨 + 닭 혈청 볼륨 + 0.1 M NaOH 볼륨 + 콜라겐 볼륨) </li><li> 무균 닭 혈청 : 볼륨 = 총 볼륨 필요 * 0.01 </li><li> 쥐 꼬리 콜라겐 I : 볼륨 = (콜라겐 겔 농도가 * 총 판매량 필요) / 콜라겐 재고 농도 </li><li> 무균 0.1 M NaOH : 볼륨 = 콜라겐 볼륨 * 0.2 참고 : 물의 양을 0.1 M NaOH, 그리고 콜라겐은 콜라겐 주식 솔루션의 농도에 따라 달라집니다 밝혔다. </li></ul></li><li> 멸균 피펫 잘 콜라겐 솔루션을 섞는다. </li><li> 즉시 1.9 cm이 성장 지역 우물에 콜라겐 솔루션의 0.3 ML를 전송합니다. 이것은 완전히 우물을 충당하기 위해 약 3mm 두께 젤을 제공하기 위해 충분한 콜라겐 솔루션입니다. 적어도 250 μm의의 겔 두께 세포 침략 연구 필요합니다. </li><li> 37 최소한 1 시간 동안 젤로 콜라겐 솔루션을 허용 ° C 5 % CO 2, 100 % 습도. </li></ol></li></ol> 2. 사전 EMT Endocardial 전지 격리와 문화 <ol><li> 배아 절연 <ol><li> 계란의 큰 끝을 통해 실험실 테이프 중 하나 인치 긴 조각을 놓으십시오. 공기 전지가있는 곳입니다. 테이프는 깨지기 쉬운 퀘일 알 껍질을 안정화. </li><li> 부드럽게 찔린 멸균 곡선 가위 끝에있는 공기 세포에있는 계란의 녹화 영역입니다. </li><li> 노른자가 통과할 수 있도록 충분히 큰 계란의 녹화 부분에 구멍을 잘라 버릴거야. 찔린에 구멍을 시작하고 나선 모양으로 바깥쪽으로 했네요. 외부 세포막을 통해 상처지만, 노른자를 관통하지 않도록해야합니다. </li><li> 쉘에있는 구멍이 완료되면, 메추라기 배아를 시각화. 태아는 일반적으로 노른자의 상단 측면에 위치해 있습니다. </li><li> 한손으로 계란에있는 구멍을 삭감을 통해 노른자를 부어 시작합니다. 반면에 # 55 트위터 잡아. 난황의 상단 측면에있는 배 (胚)가 종료 계란으로 부드럽게 배아에서 # 55 핀셋을 슬라이드와 노른자에서 제거합니다. 참고 : 닭고기 계란은 배아 격리가 선명하고 깨끗한 표면에 닭 계란을 균열 및 100mm 페트리 접시에 계란을 깨는 포함됩니다. 배아는 노른자의 상단 측면에 위치해야합니다. 부드럽게 배아에 따라 # 55 핀셋을 슬라이드와 노른자에서 제거합니다. </li><li> 얼음처럼 차가운, 살균 EBSS를 포함 100mm 페트리 접시에 배아를 놓습니다. </li></ol></li><li> 햄버거와 해밀턴 1 기준에 따라 배아를 무대. 단계 14에서 태아가 - 과거 무대 13아르지만, 아직 20-21 somites와 꼬리 버드와 함께 단계 15에서. 단계 14 주요 특징 - 태아의 몸에 90 °보다 약간 큰 머리 각도입니다. </li><li> 단계 14에서 메추라기 배아의 마음을 제거 - # 55 핀셋으로 유명 운하와 OFT는 흉부 벽과의 접촉을 어디 transversely 절단하여. 페트리 접시 한쪽에 함께 마음을 놓으십시오. </li><li> 멸균 전송 피펫으로 격리 마음을 수집하고 살균, 얼음처럼 차가운 EBSS 가득한 새로운 100mm 페트리 접시에 그들을 놓으십시오. </li><html><li> # 55 핀셋으로 심실에서 transversely OFTs와 AV 운하 컷. </li><li> 섹션은 나머지 AV 운하 및 / 또는 길이 방향 유출 트렉츠 (OFTs). </li><li> 20 UL의 볼륨에 피펫을 설정합니다. AV 운하와 OFTs을 길이 방향 - 컷 여섯 대기음이 피펫을 사용합니다. </li><li> 콜라겐 젤로 유명 운하와 OFTs을 추방. 젤의 표면에서 초과 EBSS을 대기음. </li><li> 그들이 평평하므로 방향 explants에 # 55 핀셋을 사용하고 있으므로 루멘 사이드가 콜라겐 젤을 얼굴. 핀셋과 펑크 콜라겐 젤을하지보십시오. </li><li> 37 2 시간 후에 ° C와 5% CO 2, # 55 핀셋으로 explants에서 myocardium를 제거합니다. endocardial 세포는 콜라겐 젤의 표면에 남아 있어야합니다. 또는, myocardium가 explant에 남아있을 수 있습니다. myocardium 제거와 함께가 아닌 함께 endocardial 세포가 개입없이 EMT을 받고있다. myocardium 존재로 endocardial 세포의 일부가 mesenchyme로 변환되지만, 변화의 정도는 외부 요인과 변조된 수 있습니다. 참고 : 중간이 추가되기 전에 myocardium가에 남아있을 것입니다하더라도 explant 적어도 2 시간 겔에 첨부할 수 있어야합니다. </li><li> 각 잘 포함 explants 0.4 ML M199 매체를 추가합니다. </li><li> 문화 37 세포 ° C 5 % CO 2, 100 % 습도. </li></ol> 3. 포스트 EMT AV 쿠션 Mesenchymal 세포 분리 및 문화 <ol><li> 날카로운, 깨끗한 표면에 닭 계란을 깨서 100mm 페트리 접시에 계란을 깰. 배아는 노른자의 상단 측면에 위치해야합니다. 배아를 둘러싼 세포막을 잡아서 # 5 핀셋으로 배아를 선택하고 얼음처럼 차가운, 살균 EBSS 가득한 100mm 페트리 접시에 배아를 놓습니다. </li><li> 햄버거와 해밀턴 1 기준에 따라 배아를 무대. 무대 25 배 (胚)의 특징은 독특한 팔꿈치와 무릎 관절과 약간의 눈 착색되어 있습니다. </li><li> 모든 HH25 배아의 마음을 분리하여 배양 접시 한쪽에 함께 마음을 놓으십시오. </li><li> 멸균 전송 피펫으로 격리 마음을 수집하고 살균, 얼음처럼 차가운 EBSS 가득한 새로운 100mm 페트리 접시에 그들을 놓으십시오. </li><li> 한번에 모든 마음에서 유명 지역을 격리. 페트리 접시 한쪽에 함께 AVS를 놓​​습니다. 부드럽게 세포 생존에 영향을 미칠 수있는 모든 혈액을 제거하는 AV 지역을 선동하다. </li><li> 멸균 전송 피펫으로 격리 AVS를 수집하고 살균, 얼음처럼 차가운 EBSS 가득한 새로운 100mm 페트리 접시에 그들을 놓으십시오. </li><li> 순차적으로 AV에서 방석을 분리. AV 쿠션에는 myocardium 선물이 없습니다 있는지 확인합니다. </li><li> 멸균 전송 피펫으로 격리 방석을 수집하고 살균 15 ML의 원심 관에 넣어. </li><li> 3 분 15 XG에서 원심 분리기 튜브의 바닥에 방석을 스핀. </li><li> 쿠션을 방해하지 않고 가능한 한 EBSS 뜨는의 많은를 제거하는 살균 1,000 ML 팁을 사용합니다. </li><li> 37 미리 예열되어 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML ° C. 추가 그들이 완전히 해소되기 전까지는 쿠션이 트립신에 부화 허용하는 3-5 분 정도 정상적으로됩니다. </li><li> 트립신을 담금질하기 위해 원심 관에 닭 혈청 100 μL를 추가합니다. </li><li> 5 분 160 XG에 펠렛은 세포. 멸균, 1000 μL 팁으로 뜨는을 제거합니다. </li><li> M199 매체와 pipetting으로 혼합 2 ML에있는 세포를 Resuspend. hemocytometer 의지하고 고립되었습니다 세포의 총 수를 결정하기 위해 세포 현탁액 10 μL을 가지고 </li><li> 콜라겐 젤은 절연 세포의 수를 기반으로 이루어집니다 얼마나 많은 결정합니다. 세포 250 μL 젤 볼륨 2 × 10 5 세포 / ML의 밀도에 도금해야합니다. </li><li> 5 분 160 XG에 펠렛은 세포. 멸균, 1000 μL 팁으로 뜨는을 제거합니다. </li><li> 위에 나열된 프로토콜을 사용하여, 세포 펠렛으로, 그 순서에 배 M199, 물, 닭 혈청 주사, 콜라겐, 그리고 0.1 M NaOH를 추가합니다. 부드러운 pipetting하여 섞는다. </li><li> 물론 각각 1.9 cm이 성장 지역에 250 μL를 추가합니다. </li><li> 37 최소한 1 시간 동안 젤로 콜라겐 솔루션을 허용 ° C 5 % CO 2, 100 % 습도. </li><li> 문화 미디어 0.4 ML를 추가하고 밤새 품어. </li><li> 스트레스없는 조건에서 culturing 젤을 계속하려면, 잘 살균 200 μL 피펫 팁을 사용하여 문화의 측면에서 젤을 해방. 기계 제한된 문화가 잘 문화의 측면에 연결된 상태 젤 있습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 :. 배아의 예 (A) HH14 - 퀘일 배아, 그리고 (B) HH25 닭 배아가 여기에 표시됩니다. fig2.jpg &quot;고도 =&quot;그림 2 &quot;/&gt; 그림 2 : 문화의 2 시간 후에 HH14 밸브 endocardial explants (A) myocardium 선물로, 또는 (B) myocardium 제거와 함께.. <img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3 :. HH14 밸브 endocardial explants가 (A) myocardium 선물로 세포의 많은 mesenchymal 변화에 endocardial 받아야과 문화 48 시간 후 스핀들 모양, mesenchymal 표현형 있습니다. (B) myocardium가 세포의 제거되면 문화의 48 시간 후 조약돌 모양, endocardial 표현형를 유지합니다. <img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4 :. 콜라겐 젤의 HH25 밸브 mesenchymal 세포 세포 즉시 시딩 후 반올림됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig5.jpg" alt="그림 5"/> 그림 5 :. 문화 HH25 mesenchymal 세포 (A) 제약 콜라겐 젤 문화 48 시간 후 HH25 mesenchymal 세포가 확산 시작됩니다. (B) 칠일 해방 후 시딩 및 6 일 후에 스트레스없는 콜라겐 젤의 HH25 세포는 원래 면적의 약 50 % 젤 압축된있다.

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	<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J Morphol. 88, 49-92 (1951).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+A+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: A regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Developmental Biology. 95, 108-108 (1983).</li><li>Butcher, J. T., Norris, R. A., Hoffman, S., Mjaatvedt, C. H., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periostin+promotes+atrioventricular+mesenchyme+matrix+invasion+and+remodeling+mediated+by+integrin+signaling+through+Rho/PI+3-kinase.">Periostin promotes atrioventricular mesenchyme matrix invasion and remodeling mediated by integrin signaling through Rho/PI 3-kinase.</a> Developmental Biology. 302, 256-256 (2007).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

무대 HH14에서 endocardial 세포 분리를위한 방법 - 원래 런얀 및 Markwald 개발한 마음은 시작과 배아 EMT 2 조절 요인을 연구하기 위해 체외 환경에서 제어를 제공합니다. HH14 - myocardium하지 않고 교양 endocardial explants가 biomechanical 또는 생화 학적 개입없이 EMT를 받아야하지 않습니다. myocardium가 explant에 남아있다면 그것은 mesenchymal 변화를 받아야하는 endocardial 세포의 하위 ?...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Extra fine Bonn scissors, curved</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14085-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont tweezers #55</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>14099</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont tweezers #5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>14098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile transfer pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Samco Scientific </td>
<td>2041S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4-well culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>176740</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile disposable filter units, PES, 0.2 &mu;m pore size membrane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene</td>
<td>566-0020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile 15 mL centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430828</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International</td>
<td>25384-342</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laboratory tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International</td>
<td>89097-920</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat-tail collagen I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354236</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10X Earl's Balanced Salt Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Quality Biological, Inc.</td>
<td>119-064-131</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>M199 powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>31100-035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41400-045</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chicken serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16110-082</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25200-056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S5761</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium hydroxide solution, 1.0 N</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S2770</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fertile quail eggs (Coturnix coturnix)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lake Cumberland Game Bird Farm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fertile chicken eggs (Gallus gallus)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cornell University Poultry Farm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells

배아 심장 밸브의 올바른 형성과 기능은 개발 진행을 위해 중요합니다. 초기 배아 심장은 myocardium 둘러싸인 endocardium의 U - 모양의 튜브입니다. myocardium secretes 심장 젤리, 방실 (AV) 접합 및 유출 트랙트 (OFT) 루멘으로 hyaluronan 풍부한 젤라틴 매트릭스. 단계에서 HH14 valvulogenesis는 endocardial 세포의 일부가 mesenchymal 변환 (EMT)에 endocardial myocardium의 신호를 받아야 받게하고, 심장 젤리를 침공 때 시작됩니다. HH25 단계에서 밸브 모양의 쿠션을 완전히 mesenchymalized, 그리고 그것은 결국 심장의 밸브 모양의 장치와 septal을 형성하고이 mesenchyme집니다. EMT 및 세포 분화의 과정을 시작하고 조절하는 메커니즘을 이해하는 것은 심각한 선천성 심장 때문에 결함들의 연결 중요합니다. 본 연구에서는 우리는 prevalvular 쿠션의 두 가지 세포 phenotypes 아르 사전 EMT endocardial 및 사후 응급 mesenchymal 세포를 분리하는 방법을 제시한다. 사전 EMT endocardial 세포 또는 myocardium없이 교양 수 있습니다. 포스트 EMT 유명 쿠션 mesenchymal 세포 내부 기계 제약이나 스트레스없는 콜라겐 젤을 배양해 수 있습니다. 체외 모델에서 이러한 3D 주요 밸브 모양의 morphogenic 이벤트를 모방하고 초기 늦게 무대 valvulogenesis의 메커니즘을 deconstructing하는 데 유용합니다.

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Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

이 문서는 분리를위한 방법과 culturing 퀘일 또는 닭고기 HH14를 제공합니다<sup&gt; -</sup&gt; 밸브 endocardial 세포와 HH25 밸브 쿠션 mesenchymal 세포.

조류 배아 판막병 전구 세포의 분리 및 문화

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

isolation-and-culture-of-avian-embryonic-valvular-progenitor-cells

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10.1K 조회수.  Cornell University. 이 문서는 분리를위한 방법과 culturing 퀘일 또는 닭고기 HH14를 제공합니다 - 밸브 endocardial 세포와 HH25 밸브 쿠션 mesenchymal 세포.