التعبير غير المتجانس عن connexins و innexins في بويضات Xenopus هو نهج قوي لتحليل الخصائص الفيزيائية الحيوية لتقاطعات الفجوة. الميزة الرئيسية لتقنيتنا هي استخدام نهج قياس التيار عالي الجانب المناسب لمشابك الجهد المزدوج الموقع. سيتم عرض الإجراء من قبل يوان شوي ، زميل ما بعد الدكتوراه من مختبري.
بمجرد إزالة أوراق 70 إلى 80٪ من البويضات ، قم بصب محلول الإنزيم عن طريق إمالة الأنبوب بلطف. اغسل البويضات خمس مرات عن طريق ملء الأنبوب بمحلول ND96 ثم صب المحلول. بعد الغسيل النهائي ، انقل البويضات إلى طبق بتري 60 ملم يحتوي على محلول ND96.
استخدم ماصة باستور الزجاجية النظيفة لاختيار ونقل البويضات الكبيرة ذات المظهر الصحي إلى طبق بتري بطول 60 ملم يحتوي على محلول ND96 مع بيروفات الصوديوم والبنسلين ستربتومايسين. قم بإعداد طبق حقن البويضات عن طريق لصق قطعة صغيرة من شبكة النايلون في الجزء السفلي من طبق بتري 35 ملم. املأ طبق حقن البويضات في منتصف الطريق تقريبا بمحلول ND96 المكمل بالبيروفات والستربتومايسين البنسلين.
ثم ضع 25 إلى 30 بويضة في صفوف داخل طبق بتري. قم بملء ماصة الحقن الدقيقة بزيت معدني خفيف الوزن وأدخلها في حامل الماصة الدقيقة للحاقن. انقل cRNA من أحد الأليكوتات المخزنة إلى السطح الداخلي لغطاء طبق بتري أو أسفله عن طريق السحب.
اضغط على زر التعبئة في وحدة التحكم في الحاقن لشفط قطرة cRNA في طرف الماصة الدقيقة. ثم اضغط على زر الحقن لحقن cRNA. انقل البويضات المحقونة إلى طبق بتري جديد يحتوي على محلول ND96 مكمل بالبيروفات والستربتومايسين البنسلين.
احتفظ بها داخل الغرفة البيئية عند 15 إلى 18 درجة مئوية لمدة يوم إلى ثلاثة أيام. استبدل المحلول يوميا عن طريق نقل البويضات إلى طبق بتري جديد. استخدمي ملاقط دقيقة لتقشير غشاء الزغب الشفاف الذي يلف البويضة بلطف.
ثم ضع بويضتين لكل بئر في غرفة اقتران البويضات التي تحتوي على محلول ND96. قم بتوصيل مسبار الجهد التفاضلي والكابلات الحالية بخلية النموذج. بعد ذلك ، قم بتوصيل المقابس الحمراء والسوداء بمسبار الجهد التفاضلي باستخدام الوصلة المضمنة وقم بتوصيل أي من ساقي الوصلة بأي من الدبوس في خلية الطراز.
قم بتوصيل السلك الأرضي في الخلية النموذجية بالكابل من مقبس الدائرة الأرضية للمضخم. أدر مقابض إزاحة VM و VE الإزاحة إلى صفر جهد الغشاء وعدادات تيار الغشاء. قم بتبديل المشبك من إيقاف التشغيل إلى سريع أو بطيء وقم بتشغيل قرص الكسب في اتجاه عقارب الساعة إلى مستوى يسمح لمشبك الجهد المناسب بتصفير قطب الجهد الكهربائي وعدادات قطب الحمام الخاصة بمكبر الصوت.
قم بتشغيل بروتوكول اكتساب بسيط يحتوي على بضع خطوات الجهد للتأكد من أن الجهد المعروض في مقياس الجهد الغشائي يتغير وفقا لبروتوكول الاستحواذ ، وأن آثار الجهد والتيار يتم عرضها بشكل صحيح في Clampex. ضع طبق بتري يحتوي على البويضات المقترنة في وعاء طبق بتري في منصة التسجيل. حدد زوجا من البويضات وقم بتدوير طبق بتري إذا لزم الأمر ، بحيث تكون البويضتان في الاتجاه الأيسر والأيمن.
قفل المرحلة في موضعها بواسطة قاعدتها المغناطيسية. ضع قطبا كهربائيا مرجعيا بالقرب من حافة طبق بتري باتجاه جانب المستخدم. بعد ذلك ، قم بتوصيل القطب المرجعي بالمقبس الأسود في واحد فقط من مسبارين الجهد التفاضلي.
خذ زوجا من الماصات الزجاجية الدقيقة ، واقطع قليلا من الطرف باستخدام ناسخ الماس ، وقم بتنعيم حافة الطرف عن طريق تلميع النار. امسك الماصة الدقيقة فوق لهب موقد الكحول وثنيها بزاوية ناعمة على بعد سنتيمتر واحد تقريبا من الطرف. املأ الماصة الزجاجية بالكامل بمحلول ND96 ثم أدخلها في حامل microelectrode مملوء مسبقا.
تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في النظام. أدخل الدبوس الذي يبلغ قطره مليمترين لحامل القطب الكهربائي الدقيق في المقبس ذي المليمترين لسلك توصيل قطب الجهد التفاضلي. قم بتثبيت المقبس الذي يبلغ قطره مليمترين على مشبك قائم على مغناطيسي ووجه طرف قطب الجهد التفاضلي نحو إحدى البويضتين.
أدخل دبوس واحد ملليمتر من سلك توصيل قطب الجهد التفاضلي في المقبس الأحمر لمسبار الجهد التفاضلي على نفس الجانب. تحضير الجهد والأقطاب الكهربائية الحالية من الشعيرات الدموية الزجاجية وتعبئتها مرة أخرى بمحلول كلوريد البوتاسيوم. ثم أدخل الأقطاب الكهربائية في حاملات الأقطاب الكهربائية المتوفرة مع مكبرات الصوت.
اخفض الأقطاب الكهربائية إلى محلول الحمام وأدر أقراص إزاحة VM و VE الإزاحة إلى صفر جهد الغشاء وعدادات تيار الغشاء. تحقق من مقاومة القطب الكهربائي عن طريق الضغط على اختبار القطب VM واختبار القطب VE الكهربائي. أدخل أقطاب التيار والجهد في البويضات وراقب إمكانات الغشاء السلبي.
بعد ذلك ، في قسم المشبك من مكبر الصوت ، تأكد من أن كسب التيار المستمر في الموضع الحالي. أدر مقبض الكسب في اتجاه عقارب الساعة إلى مستوى يسمح بمشبك الجهد المناسب وقم بتشغيل مفتاح المشبك من إيقاف التشغيل إلى السرعة. أخيرا ، قم بتشغيل بروتوكول استحواذ.
يظهر رسم تخطيطي لتجربة البويضة هنا. يتم تطبيق خطوات جهد الغشاء السلبية والإيجابية على البويضة 1 من جهد غشاء عقد يبلغ ناقص 30 مللي فولت ، في حين يتم الاحتفاظ بالبويضة 2 عند جهد غشاء ثابت يبلغ ناقص 30 مللي فولت. يعرف الجهد عبر التقاطع ، أو Vj ، بأنه الجهد الغشائي للبويضة 2 ناقص جهد الغشاء للبويضة 1.
تظهر الصور التمثيلية آثار Lj العينة وعلاقة الجهد عبر التوصيل المتقاطع الطبيعية الناتجة عن تقاطعات الفجوة المتجانسة UNC-9. يتم عرض آثار Lj النموذجية وعلاقة Gj-Vj الطبيعية الناتجة عن تقاطعات الفجوة المتجانسة UNC-7b هنا. تظهر النتائج أن هذين النوعين من Gjs يختلفان في معدل تعطيل Ij المعتمد على Vj ، واعتماد Vj ، وكمية Gj المتبقية.أثناء محاولة الإجراء ، من المهم جدا التأكد من أن نظام قطب الجهد التفاضلي لا يحتوي على أي فقاعات هوائية وأن طرفه موجه بالقرب من البويضة وأن الجهد والأقطاب الكهربائية الحالية لها مقاومة تبلغ ميكروأوم واحد تقريبا.
تقنيتنا سهلة التنفيذ. قد يكون من الأهمية بمكان لتلك المختبرات التي تهتم حديثا باستخدام بويضات Xenopus لدراسة تقاطعات الفجوة.
