이 작품은 NIH (5U01CA137070)에서 부여와 미국 암 협회 (RSG - 09 - 070-01 - LIB), 암 연구소의 탐정 수상 (MK), 미국 심장 협회 사전 - 박사 화목 (KM) 및 지원했습니다 교육 과학 원정대 (APG)의 스페인어 부. 우리는 프로토콜에 도움이 제안에 대한 감사 닥터 니콜라스 Restifo 박사 Zhiya 유 (NIH / NCI)를하고 싶습니다.

1. Retroviral 구축 준비 <ol><li> retroviral 벡터에 관심있는 T - 세포 수용체 (TCR) 유전자 (그림 1, 7 pMSG 예를 들어 벡터, pMIGII 5,8, Cellbiolabs에서 pMXs)을 하위 클론. TCR α와 β 사슬 유전자가 같은 표현을 보장하기 위해 동일한 모터의 제어하에 동일한 벡터에해야합니다. 관심 TCR 인간있다면, 인간의 지속적인 도메인은 마우스를 지속적으로 도메인 9 대체해야합니다. 우리의 관측은 전체 길이가 인간의 TCRs가 안정적으로 마우스 T - 세포에 표현하지됩니다. </li><li> Qiagen 맥시 준비 키트 또는 유사한 제품을 사용 고품질의 플라스미드 DNA를 준비합니다. 플라스미드의 농도가 1 μg 주변 / μL에서해야합니다. </li></ol> 2. Transfection 및 T - 세포 절연 일 -1 (플레이트 포장 세포) <ol><li> 플래티넘 - E (플랫 - E, Cellbiolabs) 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)로 retroviral 포장 세포를 이동시키다과 DMEM 매체와 중화. </li><li> 5 분 1000 XG에서 세포를 원심 분리기. 뜨는을 기음과 DMEM 미디어 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 휴대폰 번호를 결정하고 0.6x10 6 / ML에서 세포를 희석. 플레이트 10 A 10mm 폴리 - 라이신 코팅 조직 문화 플레이트의 세포 현탁액의 ML 37에서 세포 배양기에서 하룻밤 성장 ° C 5 % CO 2. </li></ol> 데이 0 (Transfection) <ol start="4"><li> 다음날 아침, 가벼운 현미경으로 세포를 검사합니다. 세포는 약 80 % 합류한다. </li><li> 부드럽게 접시에서 미디어를 제거합니다. 1X PBS로 세포를 한 번 씻고 페니실린 - 스트렙토 마이신 (펜 / Strep)없이 10 ML 사전 예열 신선한 DMEM 미디어를 추가할 수 있습니다. (참고 : 펜 / Strep transfection를 방해할 수) </li><li> transfection 복합을 준비합니다. A와 B 아래와 같이 혼합 준비 : <table border="0"><tbody><tr><td> 플라스미드 DNA : A 믹스 </td><td> 9 μg </td></tr><tr><td> 플라스미드 PCL - 에코 도우미 </td><td> 6.3 μg </td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> 1.5 ML </td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td> 믹스 B : Lipopfectime 2000 </td><td> 60 μL </td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> 1.5 ML </td></tr></tbody></table> 상온에서 5 분 별도로 A와 B를 품어 부드럽게 A와 B 함께 믹스와 transfection 단지를 형성하기 위해 상온에서 20 분 동안 품어. </li><li> 천천히 플랫 - E 세포로 혼합 (총 3 ML) 똑. 부드럽게 골고루 transfection 혼합물을 배포하는 앞뒤 판 바위. </li><li> 37 세포를 품어 ° 세포 배양기에서 C / 5 % CO 2. </li><li> 6~8시간 후, 바이러스 생산을위한 신선한 DMEM 매체 10 ML (펜 / Strep와 함께)로 매체를 바꿉니다. </li></ol> 항체와 코트 플레이트 <ol start="10"><li> 마우스 T - 세포는 바이러스성 전달되기 전에 활성화해야합니다. T - 세포를 활성화하기 위해 다양한 방법이 있습니다. 여기 플레이트 바운드 안티 CD3e 및 안티 CD28 항체를 사용합니다. 1 μg / ML 방지 CD3e의 2 μg / 멸균 PBS에 항 CD28의 ML의 항체 혼합물을 준비합니다. </li><li> 24 잘 조직 문화 판의 각 잘하는 항체 혼합물 250 μL를 분배. 번호판이 37 4 ° C 또는 2 시간에 밤새 코팅 수 있습니다 ° C. </li></ol> 마우스 비장에서 단일 세포 현탁액의 준비 <ol start="12"><li> 수확 마우스 비장 및 RPMI 매체로 전송할 수 있습니다. </li><li> 셀 스트레이너에있는 비장를 놓습니다. 5cm 조직 문화 판에 주사기의 플런저와 매쉬은 비장. 멸균 PBS로 세포 스트레이너에서 세포를 씻어. </li><li> 1000 XG, 5 분 원심 분리기. </li><li> 뜨는 폐기하십시오. ACK lysing 버퍼에 Resuspend 세포 펠릿 (비장 당 2 ML). 상온에서 2-3 분 알을 품다. 20 ML에 RPMI 매체를 추가하고 5 분 1000 XG를 원심 분리기. </li><li> 뜨는 폐기하십시오. 멸균 PBS에서 Resuspend 세포 펠릿. 4 5 분 핸드폰 번호와 원심 분리기 1000 XG ° C.를 결정 T - 세포의 고립을 진행합니다. </li></ol> 마우스 T - 세포의 분리 및 활성화 <ol start="17"><li> 자기 (磁 气) 제품 설명서 (CD8 Miltenyi Biotec에서 + T - 세포 격리 키트)에 따라 세포를 라벨. </li><li> m의 LS 칼럼 (Miltenyi Biotec)를 플레이스agnetic 분야. 칼럼에 표시된 세포 현탁액을 적용합니다. (마우스 CD8 + T - 세포를 풍부)를 통해 흐름을 수집합니다. 제품 설명서에 따라 3 ML 버퍼로 열 세 번 씻고 흐름을 통해 이전과 결합. </li><li> 안티 CD3e 및 안티 CD8a 항체와 세포를 얼룩 및 유동세포계측법 (그림 2A)에 의해 분석할 수 있습니다. 전형적인 분리, 전체 세포의 ~ 80-10%는 격리 될 수 있습니다. ~ 고립된 세포의 90 %는 CD8 + T - 세포 수 있습니다. </li><li> 1000 XG, 5 분에서 세포를 원심 분리기. 뜨는 폐기하십시오. 재조합 인간 IL - 2 (rhIL2, 20 NG / ML) 1x10에서 6 / ML로 RPMI 매체에있는 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> 그냥 세포를 추가하기 전에, 접시 (2.11 이전에 준비)에서 항체 솔루션을 제거합니다. 무균 PBS 및 제거 PBS 각 잘 린스. </li><li> 각각 잘 수있는 세포 현탁액 1 ML을 추가합니다. 37 ° C / 5 % 나 세포 배양기의 CO 2의 접시를 넣어. </li></ol> 3. 활성의 (제 2 일 및 3 일) 감염 T - 세포 <ol><li> 바이러스 생산 2 일 후에, 플랫 - E 셀 플레이트의 매체가 노란색이 될 것입니다. 15 ML 원뿔 관에 바이러스 뜨는을 전송합니다. 추가로 바이러스 제작 (옵션)에 대한 판에 신선한 DMEM 매체 10 ML을 추가합니다. </li><li> 세포의 파편을 제거하는 5 분 1000 XG에 바이러스 뜨는을 원심 분리기. 새로운 튜브에 바이러스 뜨는을 신중하게 전송합니다. 튜브의 맨 아래에 몇 가지 액체를두고 세포의 파편을 방해하지 않습니다. </li><li> 수집은 접시에서 50 ML 원뿔 관에 T - 세포를 활성화. 휴대폰 번호를 확인합니다. 부정 (취소 - transduced) 제어로 사용하기 위해 별도의 튜브에 몇 가지 세포를 저장합니다. 5 분 1000 XG에 원심 분리기 및 뜨는 폐기. </li><li> 20 NG / ML rhIL2 10 μg / 프로타민 황산의 ML 1 ML 당 10 6 세포에 바이러스가 뜨는에서 세포 펠렛을 Resuspend. 24 잘 접시의 각 웰에 세포 현탁액 1 ML을 추가합니다. rhIL2과 프로타민 황산 같은 금액과 같은 세포 밀도에서 RPMI 매체에서 제어 튜브에 세포를 Resuspend. 같은 접시에 세포를 추가합니다. </li><li> 플라스틱 필름과 접시를 넣어. 없이 브레이크와 32 ° C에서 2000 년 XG에서 90 분 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후, 플라스틱 필름을 제거합니다. 각 물론 20 NG / ML rhIL2 신선한 RPMI 매체 1 ML을 추가합니다. 인큐베이터에 다시 접시를 넣어. </li><li> (선택 사항) TCR 높은 표현 수준은 바이러스 표면에 뜨는를 수집하고 3 일에 감염 절차를 반복하여 얻을 수 있습니다. </li></ol> 4. 셀 확장 및 전달의 효율성 평가 <ol><li> 검사 일일 T - 세포 transduced. 1시 3분 비율 필요한 경우 RPMI 배지 rhIL2에서에서 세포를 분리. 세포의 자라다를 (중간 노란색 전환)시키지 마십시오. </li><li> 일 6 일 7, 항체 및 T - 세포 표면에 TCR의 표현을 평가할 수있는 TCR 특정 MHC의 tetramer로 세포를 얼룩. 사용 제어와 같은 T - 세포 (그림 2C) UN - transduced. </li><li> T - 세포 transduced 추가 하류 어플 리케이션을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 그것은 splenocytes가 정화없이 transduced 수 있지만 전달하기 전에 T - 세포 집합을 정화하는 것이 유리합니다. 고순도 T - 세포 집합은 상업 자기 구슬을 (그림 2A)를 사용하여 얻을 수 있습니다. T - 세포에 TCRs의 표현 수준을 평가하기 위해, TCR 알파 또는 베타 체인에 대한 특정 항체를 사용할 수 있습니다. 일반적으로 세포의 30 % ~ 80 %가 표현할 수있는 TCR의 유전자 및 바이러스 titers에 따라 TCR (그림 2B)은 transduced. TCR에 대한 MHC tetramer의 특정도 더욱 TCRs의 기능 표현 (그림 2C)를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2307/2307fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. T - 세포 수용체 유전자의 예 구성 하위 복제 retroviral 벡터로. 전체 길이 알파 및 베타 사슬 유전자가 자체 cleavable 2A의 펩티드 링커 8 시까지 연결되어 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2307/2307fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 마우스 T - 세포의 성공적인 고립과 전달의 예. (A) CD8 T - 세포 CD8a + T 세포 격리 키트 (Miltenyi Biotec) 및 안티 CD3e 및 안티 CD8a 항체 물들일를 사용 splenocytes에서 고립되었다. 209 안티 인간 Vbeta 8 항체 (B)와 HLA - A2kb gp100 tetramer (C)와 -217 4 펩타이드와 스테인드 : CD8 T - 세포를 격리하는 것은 인간의 gp100에 대한 구체적인 R6C12 TCR과 transduced되었습니다.

<ol>
	<li>Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+T+cells+'see'+antigen.">How T cells 'see' antigen.</a> Nat. Immunol. 6, 239-245 (2005).</li><li>Berg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen/MHC-specific+T+cells+are+preferentially+exported+from+the+thymus+in+the+presence+of+their+MHC+ligand.">Antigen/MHC-specific T cells are preferentially exported from the thymus in the presence of their MHC ligand.</a> Cell. 58, 1035-1046 (1989).</li><li>Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection.">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76, 17-27 (1994).</li><li>Yu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poor+immunogenicity+of+a+self/tumor+antigen+derives+from+peptide-MHC-I+instability+and+is+independent+of+tolerance.">Poor immunogenicity of a self/tumor antigen derives from peptide-MHC-I instability and is independent of tolerance.</a> J. Clin. Invest. 114, 551-559 (2004).</li><li>Holst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice.">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).</li><li>Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+regression+in+patients+after+transfer+of+genetically+engineered+lymphocytes.">Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes.</a> Science. 314, 126-129 (2006).</li><li>Hawley, R. G., Lieu, F. H., Fong, A. Z., Hawley, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+retroviral+vectors+for+potential+use+in+gene+therapy.">Versatile retroviral vectors for potential use in gene therapy.</a> Gene Ther. 1, 136-138 (1994).</li><li>Szymczak, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+multi-gene+deficiency+in+vivo+using+a+single+'self-cleaving'+2A+peptide-based+retroviral+vector.">Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector.</a> Nat. Biotechnol. 22, 589-594 (2004).</li><li>Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antitumor+activity+of+murine-human+hybrid+T-cell+receptor+(TCR)+in+human+lymphocytes+is+associated+with+improved+pairing+and+TCR/CD3+stability.">Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability.</a> Cancer Res. 66, 8878-8886 (2006).</li><li>Letourneur, F., Malissen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+a+T+cell+hybridoma+variant+deprived+of+functional+T+cell+receptor+alpha+and+beta+chain+transcripts+reveals+a+nonfunctional+alpha-mRNA+of+BW5147+origin.">Derivation of a T cell hybridoma variant deprived of functional T cell receptor alpha and beta chain transcripts reveals a nonfunctional alpha-mRNA of BW5147 origin.</a> Eur. J. Immunol. 19, 2269-2274 (1989).</li><li>Bendle, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethal+graft-versus-host+disease+in+mouse+models+of+T+cell+receptor+gene+therapy.">Lethal graft-versus-host disease in mouse models of T cell receptor gene therapy.</a> Nat. Med. 16, 565-570 (2010).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

몇몇 단계는 최적의 결과를 달성하기 위해 중요하다. 플랫 - E 패키징 세포주는 건강한 상태로 보관해야합니다. 필요한 경우, 전지가 retroviral 구조 단백질 표현의 손실을 방지하기 위해 1 μg / ML puromycin, 10 μg / ML blasticidin과 DMEM 매체에 몇 번 passaged 수 있습니다. transfection의 날, 세포 ~ 80 %의 합류해야합니다. 너무 적거나 너무 많은 세포가 바이러스 titer를 줄일 수 있습니다. 바이러스 품질 쉽게 transduced 수있는 세포 라인에 대한 테스트하여 확인하실 수 있습니다. TCRs가 인 경우에는 3 번 CD에 들어 단지는 세포 표면에 표현되는 요구 때문에, 우리는 일상적으로 사용하는 58α-/β- 하이 브리 도마 세포 10 (내생 TCR α 또는 β 사슬을 표현하지만, 표현 인 경우에는 3 번 CD에 들어 복합을 수행하지 않는 세포주). 바이러스 뜨는 1 ML과 세포 transducing 때 우리는 하이 브리 도마 세포의 거의 100 % 전달 효율을 얻습니다. 마지막으로 T - 세포가 활성화되고 레트로 바이러스는 적극적으로 세포를 분리 감염될 수 있기 때문에 proliferating해야합니다. 방법은 항원에 특정한 T - 세포가 여러 가지 한계를 가지고 생산 보시려면 여기를 발표했다. 첫째, 기본 마우스 T - 세포에 대한 100 % 전달 효율에 도달하기가 어렵습니다. 세포의 부분은 관심의 TCR을 표현하지 않습니다. 둘째, TCR α를 transduced와 β 사슬 관심의 TCR 표현 수준을 줄일 수있는, 내생 TCRs와 9 mispair 수 있습니다. 또한, mispaired TCRs는 생체내 11 autoimmunity의 원인이 될 수 있습니다. 마지막으로, 단지 제한된 시간 프레임 T - 세포가 사용할 수 transduced있다. 일주 주변 후, 세포가 다시 자극하고 apoptosis 않는 받고있다. 그러나, 세포가 소진되어 다시 stimulations 반복과 기능을 잃을 수 있습니다.

미디어 : DMEM 배지 (DMEM 10% 열 inactivated FBS + 펜 / Strep + L - GLU + 나트륨 Pyruvate + 비 필수 아미노산). 펜 / Strep없이 DMEM 배지 (DMEM 매체와 동일하지만, 펜 / Strep를 추가하지 않고). RPMI 배지 (RPMI 10% 열 inactivated FBS + L - GLU + 비 필수 아미노산 + β - Mercaphoethanol + 펜 / Strep + 나트륨 Pyruvate).

retroviral transduction of t-cell receptors in mouse t-cells

T - 세포 수용체 (TCRs)는 면역 체계의 중심 역할을한다. T - 세포 표면에 TCRs 특별히 항원 제시 세포 (APCs) 1에 의해 제시 펩티드 항원을 인식할 수 있습니다. 이 인식은 T - 세포 (대상 세포의 살해 예 시토킨 생산) 기능 결과 일련의 활성화에 이르게한다. TCRs의 기능 역할을 이해하는 것은 면역학 관련 질병 (예 : 암 또는 autoimmunity)의 다양한 치료하는 면역 시스템의 능력을 활용하는 것이 중요합니다. 그것은 여러 가지 방법으로 수행할 수 있습니다 마우스 모델에 TCRs을 연구하기 편리합니다. 만들기 TCR 유전자 변형 마우스 모델은 비용과 시간이 많이 소요되고 현재 2-4 사용 가능한 그들의 단지 한정된 수가있다. 또는와 마우스 T - 세포 항원은 특정은 키메라 골수에 의해 생성하실 수 있습니다. 이 방법은 몇 주 정도 소요과 전문성 5 필요합니다. 체외 활성화 마우스에서 T - 세포에 TCRs의 Retroviral 전달 원하는 펩티드 - MHC 특이성의 T - 세포를 얻기 위해 신속하고 상대적으로 쉬운 방법입니다. 항원에 특정한 T - 세포는 일주일에 생성 및 다운 스트림 응용 프로그램에서 사용할 수 있습니다. T - 세포 transduced 공부하는 것이 아니라 인간의 immunotherapy에 직접 응용 프로그램을 가지고, 인간 T - 세포의 입양 전송과 같은 항원 특정 TCRs와 transduced 암 치료 6 새로운 전략이다. 여기 retrovirally 체외 활성화 마우스 T - 세포에로 TCRs를 transduce하는 프로토콜을 제시한다. 인간과 마우스 TCR의 유전자 모두 사용할 수 있습니다. 특정 TCR의 유전자를 갖고 Retroviruses가 생성 마우스 안티 인 경우에는 3 번 CD 및 안티 CD28 항체와 활성화된 T - 세포를 감염하는 데 사용됩니다. 체외 확장에 transduced 후 T - 세포 유동세포계측법에 의해 분석됩니다.

Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells at JoVE.com

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

우리는 retroviral 전달을 사용하여 항원 - 특정 마우스 T - 세포를 생산하는 프로토콜을 제시

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

retroviral-transduction-of-t-cell-receptors-in-mouse-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.8K 조회수.  New York University School of Medicine. 우리는 retroviral 전달을 사용하여 항원 - 특정 마우스 T - 세포를 생산하는 프로토콜을 제시

비디오: Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

기본 인적 나이브 및 메모리 T의 세포로부터 유도된 규제 T 세포의 생성

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

연구

면역학 및 감염병학

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

나이브 CD4의 아데노 바이러스 형질은 Treg의 분화를 연구하는 세포를 T

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

T 세포의 유도<em&gt; 체외</em&gt; 마우스 배아 줄기 세포에서

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 T 세포 수용체 Retrogenic 마우스를 생성하는

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

생성<em&gt; 드 노보</em&gt; 중심 Hemichain의 레트로 바이러스 형질 도입에 의해 항원 특이 적 인간 T 세포 수용체

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

공부하는 유전 적 접근으로 헬퍼 T 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 메커니즘 자신의 차별화 및 기능 제어

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 million IBD patients. It is generally accepted that a dysregulated immune response to gut bacteria initiates the disease and disrupts the mucosal epithelial barrier. We recently show that gut-homing regulatory T (Treg) cells are a promising therapy for IBD. Accordingly, this article presents a protocol for in vivo augmentation of gut-homing Treg cell induction. In this protocol, dendritic cells are engineered to produce locally high concentrations of two molecules de novo, active vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D or 1,25[OH]2D) and active vitamin A (retinoic acid or RA). We chose 1,25(OH)2D and RA based on previous findings showing that 1,25(OH)2D can induce the expression of regulatory molecules (e.g., forkhead box P3 and interleukin-10) and that RA can stimulate the expression of gut-homing receptors in T cells. To generate such engineered dendritic cells, we use a lentiviral vector to transduce dendritic cells to overexpress two genes. One gene is the cytochrome P450 family 27 subfamily B member 1 that encodes 25-hydroxyvitamin D 1&#945;-hydroxylase, which physiologically catalyzes the synthesis of 1,25(OH)2D. The other gene is the aldehyde dehydrogenase 1 family member A2 that encodes retinaldehyde dehydrogenase 2, which physiologically catalyzes the synthesis of RA. This protocol can be used for future investigation of gut-homing Treg cells in vivo.

Here we present a protocol for in vivo augmentation of gut-homing regulatory T cell induction. In this protocol, dendritic cells are engineered to locally produce high concentrations of the active vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D or 1,25[OH]2D) and the active vitamin A (retinoic acid or RA) de novo.

내장 호밍 규제 T 세포 유도의 생체 내 확대

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 CD8+ T 세포의 격리

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...