وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لمنح الصحة (CIHR) بحوث لاين S. Sossin. كارول ألف فرح وهو حاصل على زمالة ما بعد الدكتوراه من فون بحوث دي لا سانتي ان كيبيك (FRSQ) وزمالة هارينجتون كونراد. فإن الكتاب أود أن أشكر جوانا بوجي ، مارغريت هاستينغز واللبان مارغريت للمساعدة في تبادل لاطلاق النار الفيديو ومادلين ريتشموند حمام سباحة للحصول على مساعدة مع نظرة عامة على الرسم.

1. إعداد وصيانة Sf9 الثقافات المونولاير الخليوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنفيذ Sf9 خلية ثقافة والصيانة في نسيج الثقافة هود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتستمد Sf9 خلايا من خلايا المبيض Spodoptera frugiperda (Sf21 الخلايا) ويمكن شراؤها على شكل خلايا مجمدة في وسائل الإعلام من Invitrogen غريس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 8 مل من مكان المتوسطة غريس الحشرات ، على أن تستكمل (1X) ، والتي 30 ٪ الجنين مصل الأبقار (FBS) وقد أضيف في 75 سم 2 خلية قارورة الثقافة مع رقبة ميال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد أنبوب المجمدة للSf9 الخلايا بسرعة في حمام مائي 37 ° C بتحريك الأنبوب ذهابا وإيابا (حوالي 1-2 دقائق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sf9 نقل الخلايا إلى 75 سم 2 خلية قارورة الثقافة والصفيحة الصخرية بلطف باليد لتوزيع الخلايا بالتساوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 1-2 ساعات حتى 27 درجة مئوية حتى الخلايا قد المرفقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة القديمة واستبدالها مع 10 مل من الحشرات والمتوسطة freshGrace FBS مع 30 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان حتى 27 درجة مئوية حتى الخلايا متموجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحفاظ على الثقافات أحادي الطبقة ، وإزالة المتوسطة من العمر القارورة متموجة من Sf9 الخلايا وإضافة 5 مل من المتوسط ​​غريس الحشرات مع FBS 10 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بخفة على جانب القارورة عدة مرات لفصل Sf9 الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة 10 مل وpipettor أ ، ماصة وسائل الإعلام بلطف صعودا وهبوطا مرة واحدة ، في حين الرش جدار القارورة pipetting أسفل. نقل الخلايا إلى أنبوب العقيمة Polysterene 15 مليلتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل من تعليق خلية Sf9 إلى 8 مل من المتوسط ​​غريس الحشرات مع FBS 10 ٪ (1:5 تخفيف للحفاظ على سجل النمو المرحلة) في 75 سم 2 جديدة الخلية قارورة الثقافة والصفيحة الصخرية بلطف باليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان حتى 27 درجة مئوية حتى الخلايا متموجة. </li></ol> 2. التعبير عن الكلمات الدلالية PKCS Fluorescently في خلايا Sf9 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليعيش تجربة التصوير ، والثقافة Sf9 الخلايا على الزجاج 35 ملم ماتيك disheswith ثقافة أسفل سطح الزجاج من 14 ملم وسماكة ساترة من 0،16-0،19 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأعرب PKCS المفتاحية مع البروتينات الفلورية في Sf9 الخلايا باستخدام كاشف Cellfectin ترنسفكأيشن الثاني التوصية التالية من الشركة المصنعة مع التعديلات المفصلة أدناه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 1 : قبل طلاء الخلايا ، وعلاج كل طبق ماتيك المتوسطة مع غريس الحشرات مع FBS 10 ٪ على الأقل 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العد Sf9 الخلايا من الخطوة 11 (أعلاه) باستخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 0.05 × 10 6 خلايا في كل ساترة ماتيك الزجاج في حجم ما مجموعه 150 ميكرولتر. السماح للخلايا تعلق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل من وتستكمل مع غريس FBS 10 ٪ لكل 1 مل طبق في وقت ببطء لتجنب فصل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان حتى 27 درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من هذه النقطة ، واستخدام توصية الشركة المصنعة لترنسفكأيشن Sf9 من خلايا الحمض النووي مع البلازميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 2 : Transfect Sf9 الخلايا مع PKCS الموسومة fluorescently باستخدام كاشف Cellfectin ترنسفكأيشن الثاني. نحن غالبا ما يكون التعاون وأعرب في هذا النظام PKCS المفتاحية البروتين المعزز نيون الخضراء (eGFP) والبروتين موحودي نيون الأحمر (mRFP) (التفاصيل لبناء البلازميد وقد وصفت سابقا 2،5). التعبير عن بروتين واحد في وقت واحد الفلورسنت غلة حوالي 70-80 ٪ معربا عن خلايا في مرحلة ما بعد 72 ساعة ترنسفكأيشن. شارك في التعبير عن اثنين من البروتينات الفلورية انخفاض كفاءة ترنسفكأيشن إلى حوالي 30 ٪ شارك في التعبير عن الخلايا. عندما شاركت في التعبير عن eGFP الموسومة PKC وmRFP الموسومة PKC ، استخدم 2X DNA البلازميد لمزيد من البروتين mRFP الموسومة للتعبير البروتين الأمثل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء حية التصوير 48-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن (الأمثل للتعبير البروتين ، والانتظار 72 ساعة). </li></ol> 3. التعبير عن الكلمات الدلالية PKCS Fluorescently في الخلايا العصبية الحسية Aplysia <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد وصفت إعداد الثقافات Aplysia الخلية العصبية في مادة الفيديو و 4 تشاو الزملاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأعرب PKCS المفتاحية مع البروتينات الفلورية في الخلايا العصبية الحسية Aplysia باستخدام الإجراء microinjection المفصلة أدناه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل سريع الأسهم الخضراء 1 ٪ (FCF) في الماء المقطر ، والتصفية باستخدام حقنة وحقنة 28 ملم تصفية (0.20 ميكرون). قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا يمكن أن يؤديها Microinjection من الخلايا العصبية الحسية في يوم 1 أو 2 بعد يوم وعزل الخلايا العصبية لكننا نجد أن الانتظار 2 أيام يسمح للانضمام إلى خلية أفضل ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 2 بعد عزل الخلايا العصبية الحسية ، وأذاب an قسامة الخضراء سريعة وتصفية مرة أخرى باستخدام حقنة وحقنة تصفية 28 ملم (0.20 ميكرون). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل DNA البلازميد في الماء المقطر الخضراء التي تحتوي على السريع 0.5 ٪. ويمكن استخدام تركيزات DNA البلازميد تصل إلى 0.4 ميكروغرام / ميكرولتر ولكن ليس من المستحسن أن يذهب فوق هذه القيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية DNA البلازميد / حل سريع الخضراء باستخدام حقنة 1 مل 4 مم والمحاقن تصفية (0.20 ميكرون). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي ال DNA البلازميد / حل سريع الخضراء في XG 16110 لمدة 15 دقيقة باستخدام الميكروفونrocentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأقطاب حادة لmicroinjection من الخلايا العصبية باستخدام مجتذب microelectrode (سوتر يلهب / براون Micropipette بولير ، الموديل P - 97). باستخدام خيوط مربع ، وسحب microelectrodes الزجاج مع القطر الخارجي 1 مم ، 0.75 مم داخل القطر وطول 100 مم باستخدام رقيقة الجدار الزجاجي الشعيرات الدموية مع خيوط داخل (البنك الآلات الدقيقة TW100F - 4). لمزيد من المعلومات حول سحب أقطاب microinjection يرجى الرجوع إلى كتاب طبخ كهربائي سوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كل قطب كهربائي مع 2 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد / حل سريع الخضراء باستخدام ماصة microloader غيض (إيبندورف CA32950 - 050). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل أسفل الزجاج ماتيك صحن يحتوي على ثقافة الثقافات Aplysia العصبية إلى محطة microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محطة microinjection يتكون من التالي : منزل من صنع الزجاج كبيرة المرحلة لعقد الأطباق الثقافة على طاولة الاهتزاز العزلة (الحركية العزلة اهتزاز نظم محطة العمل) ، وستيريو النطاق مع إضاءة الهالوجين الخارجية ، micromanipulator ألف (سوتر نوع ستريت هكسلي Micromanipulator والذي يسمح لتحديد المواقع على حد سواء الخشنة وفائق النعومة في المحور الثالث) ، حامل microelectrode متصلة مضخة هوائية (الآلات الدقيقة العالم PV820 - مضخة هوائية بيكو). توصيل الإدخال ضغط المضخة الهوائية إلى خزان نيتروجين مضغوط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج microelectrode في حامل microelectrode. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض تحت المجهر ستيريو ، إدراج غيض من micropipette في نواة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل نبضات قصيرة من ضغط النيتروجين (10 إلى 100 ​​مللي ثانية في المدة ، و 20 رطل / في 2) حتى تصبح نواة uniformely الخضراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة والحفاظ على 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. لإزفاء PKC الأمثل ، وتنفيذ التجربة الحية التصوير 20-24 ساعة بعد الحقن. </li></ol> 4. تصور الحياة في إزفاء PKC Sf9 الخلايا في الخلايا العصبية والحسية Aplysia <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير ، ونستخدم LSM510 زايس مجهر مقلوب مبائر مع 200 Axiovert. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير البروتوكول هو نفسه لSf9 الخلايا العصبية والحسية Aplysia باستثناء ما يلي : يتم تصوير Sf9 الخلايا مع هدف النفط الغمر x63 بينما تصوير الخلايا العصبية الحسية Aplysia مع الغمر X40 الهدف النفط. يتم تصوير Sf9 الخلايا في غرفة التحكم في درجة حرارته درجة مئوية في الحفاظ على 26-27 في حين أن تصوير الخلايا العصبية الحسية Aplysia المحافظة على درجة حرارة الغرفة حوالي 18-20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحن نستخدم 30 ميغاواط الأرجون ليزر (الإثارة في 488nm) مع انتاج 50 ٪ ليزر PKC صورة المفتاحية مع بروتين eGFP والليزر HeNe (الإثارة في 543nm) لPKC صورة المفتاحية mRFP البروتين. والأرجون وخطوط HeNe الليزر هي الموهن إلى 4 ٪ ، ويتم ضبط 50 ٪ على التوالي قبل الانتقال الإخراج إلى التصوير والثقب وإلى واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فمن المهم أن يكون الطبق الثقافة استقرت على المسرح والتصوير وتجنب الحركة أو اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 1 مل من وسائل الإعلام الثقافة من صحن به برفق ماصة 10 مل ترك 1 مل حجم الكلي في الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صور في الجزء الأوسط من الخلايا التي يمكن أن ينظر إلى النواة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد سلسلة زمنية من 10-20 مبائر الصور التقاط صورة كل 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ السلسلة الزمنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أخذ الصور 2 (بعد الساعة 30 نقطة ثانية) ، إضافة 1 مل من المخدرات (2X تركيز) بلطف الانقطاع عن الإفلات من قبل في أعلى الخلايا باستخدام ماصة P1000. يضاف الدواء باستمرار لمدة 30 ثانية تقريبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعض الأدوية إحداث إزفاء السريعة التي يمكن أن تكون مرئية مباشرة بعد العلاج من تعاطي المخدرات (60 نقطة في الوقت ثانية) في حين أن آخرين إحداث إزفاء البطيء ، والذي يبعد دقائق فقط 50-10 بعد العلاج الأمثل (1 و الفيلم السينمائي 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان هذا الدواء يجب أن جرفت ، واستخدام 2 × 10 مل pipets للقيام يغسل ، pipetting المخزن يغسل برفق مع أحد ماصة على جانب واحد من صحن وpipeting حتى وسائل الإعلام على الجانب الآخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان قد تم غسل فعالة وإذا كان تأثير الدواء هو عكسها ، PKC يعود إلى العصارة الخلوية داخل 30-60 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ الفيلم كملف LSM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرمجيات NIH J صورة لفتح ملفات LSM وتحديد الصور قبل وبعد العلاج من تعاطي المخدرات. وقد وصفت في مكان آخر الكمي 1. </li></ol>

<ol>
	<li>Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+role+for+phosphatidic+acid+in+the+translocation+of+the+novel+protein+kinase+C+Apl+II+in+Aplysia+neurons.">Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons.</a> Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).</li><li>Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Klein, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M.Isoform+specificity+of+PKC+translocation+in+living+Aplysia+sensory+neurons+and+a+role+for+Ca2+-dependent+PKC+APL+I+in+the+induction+of+intermediate-term+facilitation.">M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation.</a> J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).</li><li>Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC+differentially+translocates+during+spaced+and+massed+training+in+Aplysia.">PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia.</a> J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).</li><li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures.">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-independent+PKC+Apl+II+mediates+the+serotonin+induced+facilitation+at+depressed+synapses+in+Aplysia.">Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia.</a> J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد وصفت لدينا التقنية لإزفاء صورة PKCS fluorescently المفتاحية في الوقت الحقيقي في Sf9 الخلايا والخلايا العصبية في Aplysia الحسية. Sf9 الخلايا توفير نظام بسيط لإزفاء صورة PKC منذ زراعة وtransfecting لهم هي جميلة على التوالي إلى الأمام. في المقابل ، microinjection من الخلايا العصبية الحسية <...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sf9 frozen cells</td>
<td>Spodoptera frugiperda ovarian cells</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>B825-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Grace&#x2019;s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>11605-094</td>
<td>Use to culture Sf9 cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Corning 75cm2 canted neck cell culture flask</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>430720</td>
<td>Use to culture Sf9 cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>CanSera</td>
<td>CS-C08-500</td>
<td>Supplement Grace's media with FBS prior to use</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe</td>
<td>Tool</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>309604</td>
<td>Use to filter Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe</td>
<td>Tool</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>309602</td>
<td>Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>431229</td>
<td>Use to filter Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>431212</td>
<td>Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass Bottom Dish</td>
<td>Tool</td>
<td>Mattek</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging</td>
</tr>
<tr>
<td>Cellfectin II Reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10362-100</td>
<td>Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Fast Green FCF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F-7252</td>
<td>Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons</td>
</tr>
<tr>
<td>Thin wall glass capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100F-4</td>
<td>Use to make microelectrodes for microinjection</td>
</tr>
<tr>
<td>Microloader pipette tip</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>CA32950-050</td>
<td>Autoclave before using to fill up the microelectrodes for microinjection</td>
</tr>
<tr>
<td>PV820 Pneumatic PicoPump </td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>SYS-PV820</td>
<td>Part of microinjection station</td>
</tr>
<tr>
<td>Microelectrode holder</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>MPH6S</td>
<td>Use to hold microelectrode </td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Tool</td>
<td>Sutter</td>
<td>MP-85</td>
<td>Use to position microelectrode in the three-axis</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live-imaging of pkc translocation in sf9 cells and in aplysia sensory neurons

بروتين كيناز جيم (PKCS) هي السيرين ثريونين كاينيسات التي تلعب دورا مركزيا في تنظيم مجموعة واسعة من العمليات الخلوية مثل نمو الخلايا والتعلم والذاكرة. هناك أربع عائلات معروفة من الأشكال الإسوية PKC في الفقاريات : PKCS الكلاسيكية (α ، βI ، وβII γ) ، اكتب رواية أنا PKCS (ε η و) ، رواية من النوع الثاني PKCS (δ وθ) ، وPKCS شاذة (وι ζ ). يتم تنشيط PKCS الكلاسيكية كا 2 + وdiacylclycerol (DAG) ، في حين يتم تنشيط PKCS رواية همرشولد ، ولكن كا 2 + مستقلة. يتم تنشيط PKCS شاذة التي لا كا 2 + ولا همرشولد. في californica Aplysia ، لدينا نظام نموذجي لدراسة تكوين الذاكرة ، وهناك ثلاثة نظام محدد العصبي الأشكال الإسوية PKC واحد من كل فئة رئيسية ، هي التقليدية PKC APL انا ، انا اكتب رواية PKC APL الثاني والثالث شاذة PKC الألغام المضادة للأفراد. PKCS والدهون تنشيط كاينيسات ، وبالتالي فقد تم تفعيل PKCS الرواية الكلاسيكية واستجابة لإشارات خارج الخلية مرتبطة بشكل متكرر مع إزفاء PKC من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما. ولذلك ، تصور إزفاء PKC في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية قد أصبحت أداة لا تقدر بثمن لتوضيح مسارات نقل الإشارة التي تؤدي إلى تفعيل PKC. على سبيل المثال ، سمحت هذه التقنية بالنسبة لنا لإثبات أن الأشكال الإسوية المختلفة من PKC نقل من مكان لآخر في ظل ظروف مختلفة للتوسط أنواع متميزة من اللدونة متشابك وأن السيروتونين (5HT) تفعيل PKC APL الثاني يتطلب إنتاج كل من حمض الفسفاتيديك همرشولد و(السلطة الفلسطينية) من أجل إزفاء 1-2. الأهم ، والقدرة على تصور الخلية العصبية نفسها مرارا وتكرارا وقد سمح لنا ، على سبيل المثال ، لقياس الحساسية للاستجابة PKC بالتفصيل رائعة 3. في هذا الفيديو ، ونظهر كل خطوة من إعداد الثقافات الخلية Sf9 ، وقد وصفت الثقافات من الخلايا العصبية الحسية Aplysia في مقال آخر فيديو 4 ، معربا عن PKCS الموسومة fluorescently Sf9 في الخلايا والخلايا العصبية في Aplysia الحسية والعيش التصوير من إزفاء PKC ردا على تفعيل مختلفة باستخدام الليزر المجهر.

Watch this Scientific Journal Video about Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons at JoVE.com

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

في هذا الفيديو ، ونظهر تصور إزفاء PKC في الخلايا الحية باستخدام PKCS الموسومة fluorescently.

تصوير الحية إزفاء PKC في Sf9 خلايا في الخلايا العصبية والحسية Aplysia

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

live-imaging-pkc-translocation-sf9-cells-aplysia-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K Views.  McGill University. في هذا الفيديو ، ونظهر تصور إزفاء PKC في الخلايا الحية باستخدام PKCS الموسومة fluorescently.

Video: Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

الوقت الفاصل بين التصوير حية من خلايا ذات صلة Clonally السلف العصبية في الدماغ المقدم اسماك الزرد النامية

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

تعديل العمليات العصبية والنقل الميتوكوندريا : تصوير مباشر في الخلايا العصبية الحصين خلال فترات طويلة

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

الفيروسة البطيئة بوساطة التلاعب الجيني والتخيل من العصبونات الحسية الشمية في الجسم الحي</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

فلاش التحلل الضوئي للمركبات محبوس في سيليا من العصبونات الحسية الشمية

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

تحديد الخلايا العصبية الحركية خارج الخلية لعضلة حمام سباحة للسيارات في<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

عزل الخلايا العصبية الحسية من<em&gt; Aplysia californica</em&gt; للحصول على التسجيلات المشبك التصحيح من التيارات الجلوتاميرجي

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

كله من جبل Immunolabeling الشم مستقبلات الخلايا العصبية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الهوائي

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of these afferent neurons are located within the sensory ganglia. Sensory ganglia innervate a specific organ or portion of the body. For instance, the dorsal root ganglia (DRG) are located in the vertebral column and extend processes throughout the body and limbs. The trigeminal ganglia are located in the skull and innervate the face, and upper airways. Vagal afferents of the nodose ganglia extend throughout the gut, heart, and lungs. The nodose neurons control a diverse array of functions such as: respiratory rate, airway irritation, and cough reflexes. Thus, to understand and manipulate their function, it is critical to identify and isolate airway specific neuronal sub-populations. In the mouse, the airways are exposed to a fluorescent tracer dye, Fast Blue, for retrograde tracing of airway-specific nodose neurons. The nodose ganglia are dissociated and fluorescence activated cell (FAC) sorting is used to collect dye positive cells. Next, high quality ribonucleic acid (RNA) is extracted from dye positive cells for next generation sequencing. Using this method airway specific neuronal gene expression is determined.

Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

طريقة لاستهداف وعزل مجرى الهواء-التعصيب الخلايا العصبية الحسية في الفئران

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...