وأيد PHS غرانت (MH51393) هذا العمل. وتقدم بعض Aplysia نستخدمها من قبل الموارد الوطنية للAplysia من جامعة ميامي في إطار المنحة RR10294 من المركز الوطني للبحوث الموارد، NIH.

1. إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير عن طريق حقن الحيوان 75-100 مل كلوريد المغنيسيوم متساوي التوتر حل. وAplysia نستخدمها للتصوير عموما 150-200 غرام ويتم الحصول عليها من العلم مارينوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دبوس تخدير الحيوان إلى طبق الشمع مغطاة. حقنة الإبر تعمل بشكل جيد لهذا الغرض؛ التقنيات العقيمة ليست ضرورية. باستخدام ملقط ومقص الإجمالي القياسية إجراء شق في القدم الحيوان وفضح الشامل الشدق. تحديد موقع العقدة الشدق. باستخدام مقص وملقط الربيع الجميلة، مجانا بعناية العقدة عن طريق قطع جميع الأعصاب الشدق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العقدة ووضعها في طبق يحتوي على مياه البحر Sylgard المغلفة الاصطناعي. وضع دبابيس الحشرات قليلة من خلال الأعصاب الشدق لتحقيق الاستقرار في العقدة. Desheath العقدة باستخدام ملقط الشدق متناهية الصغر ومقص الربيع، وذلك لكشف الخلايا العصبية بين الخلايا للتسجيل. ثم إعادة دبوس العقدة باستخدام الحشرات حوالي 15 دقيقة (دقائقutien) الدبابيس. يجب أن تعقد عقدة راسخة في مكانها لأن أي حركة سوف يكون مشكلة أثناء التصوير. </li></ol> 2. إعداد أقطاب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب أسلاك باستخدام أنابيب الزجاج الشعرية مع خيوط (مثل WPI TW100F-4) ومجتذب أ. وينبغي تحديد الإعدادات بشكل فردي لخلق أقطاب المقاومة المطلوبة. عندما مليئة شركة الخطوط الجوية الكويتية M 3 (خلات البوتاسيوم) مقاومتنا الكهربائي بشكل عام حوالي 10 MOhms إذا الأقطاب هي أن مشطوف، أو حوالي 5 MOhms إذا تم حذف خطوة تجليف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء مجموعة واحدة من الأقطاب الكهربائية مع محلول يحتوي على 3 M ملي بوكل KAc/30 باستخدام المحاقن والإبر microfil. وسوف تستخدم هذه الأقطاب الكهربية ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء مجموعة ثانية من الأقطاب الكهربائية مع الكالسيوم صبغ المؤشر عن طريق غمس نهاية الخلفي من القطب في صبغ، أعادت سابقا مع تقريبا. 40 ميكرولتر الماء المقطر لصبغ 500μg. عندما غيض من القطب قد ملأت، وملء عودة حوالي 1/4 بوصةمن نهاية القطب مع 200 ملي بوكل لضمان الاتصال الكهربائية جيدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فإنه من المفيد أن شطبة الأقطاب، وهذا يسهل حقن صبغة ويقلل من الضرر الناجم عن الاختراقات غشاء متعددة. نستخدم beveler المخصصة التي تولد تيار من مسحوق التعليق المياه المالحة / الألومينا. هي التي شنت القطب في حامل وطرفها يدخل تيار بزاوية ° 45. ويتم رصد مستمر ومقاومة القطب إنهاء تجليف عندما تصل المقاومة على Mohm حوالي 5 لشركة الخطوط الجوية الكويتية أقطاب شغلها. ومشطوف الأقطاب صبغ شغلها عن مبلغ مساو من الوقت وعادة ما يكون من المقاومات على Mohm 15-20. </li></ol> 3. تحميل صبغ المؤشر الكالسيوم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع على منصة إعداد الكهربية وتحديد بصريا الخلايا العصبية قبل المشبكي في المصالح. تتم العديد من تجاربنا مع الخلايا العصبية الحسية لتحديد استخدام أثناء الرضاعة، B21 5، 6. وpositio ثابتة نسبيان، وحجم (~ 100 ميكرون)، وشكل مطول من سوما B21 تجعل من السهل العثور على. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خوزق الخلايا العصبية في المصالح مع إلكترود تحتوي على صبغة مؤشر الكالسيوم. يمكن التحقق من الهوية عن طريق B21 التخوزق ما بعد متشابك الخلايا العصبية B8. وإزالة الاستقطاب من B21 مع نا الحالي ~ 8 تؤدي المسامير ونتيجة في تسهيل بسبس في B8 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن صبغة في الخلايا العصبية قبل المشبكي من الفائدة عن طريق تمرير النبضات hyperpolarizing (عادة -15 نا، 1 هرتز و 75٪ لدورة العمل) لحوالي 30 دقيقة. إذا صبغ التحميل بنجاح، سوف سوما الخلايا العصبية في الحصول على اللون الوردي خافت. إزالة القطب الصبغة المحتوية بسحب ببطء من الخلايا العصبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الاستعدادات لحوالي 30 دقيقة للسماح للصبغة لنشر في عمليات الاتصال التي تجعل غرامة متشابك مع الخلايا العصبية تابعا. </li></ol> 4. التصوير الكالسيوم وتسجيل الكهربية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع على إعداد microsc التصويرمكتب مستشار رئيس الوزراء. يقام الطبق مع إعداد على منصة تبريد قطعة من الحبل مع الختم Permagum التي، على عكس الطين، لا يزال لزجة عندما تكون رطبة. المجهر المرحلة الثابتة من خلال نقل ويركز الهدف. المرحلة لا تزال ثابتة، والذي يسمح إرفاق المتلاعبين المغناطيس المحملة. كما تضخم عالية يجعل الاهتزازات (الحركة الجانبية خاصة) مشكلة، يجب وضع الإعداد التصوير بالكامل على منصة الاهتزاز العزلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خوزق الخلايا العصبية قبل المشبكي وبعد المشبكي مع الأقطاب الكهربائية العادية التي تحتوي على حل بالكهرباء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد كتلة مناسبة لتصفية الصورة الكالسيوم أورانج (549 نانومتر الإثارة، 576 نانومتر الانبعاثات) 8 وضبط الكاميرا. معظم الكاميرات CCD العلمية تسمح المحقق لاختيار مجموعة فرعية من الخلايا CCD التي يتم قراءتها خارج. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع بين الخلايا (اهمال). اختيار أصغر سرعة الزيادات فرعية، في حين يزيد الحساسية binning. هذه الإعدادات اثنين، جنبا إلى جنب مع زمن التعرض، وتحديدمعدل الإطار أي عدد الصور يمكن الحصول عليها في الثانية الواحدة. سوف الإعدادات المناسبة صورة مساحة من 580 ميكرون 350 × 500 بكسل 2 مع 300 × (باستخدام عدسة 10x ومحول كاميرا 0.5x). إضافة عوامل تصفية الكثافة محايدة لمسار الضوء لضبط شدة الإضاءة إلى الحد الأدنى الذي يوفر التعرض الصحيح مع زمن التعرض &lt;25 مللي. هذه الإعدادات يجب أن يؤدي إلى معدل الإطار من حوالي 30 هرتز - الذي هو في Aplysia بسرعة كافية لصورة واحدة أثار ارتفاع الكالسيوم التعديلات. وأخيرا، أغلق فتحة المجال بحيث يضيء فقط المنطقة المصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في برامج التصوير بمناسبة الخلايا العصبية في المناطق التي تريد قياسها. في البرنامج AR عناصر يتم ذلك في قسم &quot;وقت القياس&quot; من خلال وضع مناطق الاهتمام (رويس). B21 هو العصبون ثنائي القطب والأعمال السابقة قد أثبتت أن عملية اتصالاتها الجانبية بعد المشبكي الخلايا العصبية التي تهم 9. ونحن عموما الصورة الأولية، البرازيلي الثانوي، والتعليم العاليnches عملية الجانبية من خلال وضع ROI على كل جزء من الخلايا العصبية. يتم قياس عائد استثمار إضافي بجانب الخلايا العصبية صبغ شغلها لتوفير قيمة الخلفية التي يتم طرح في وقت لاحق من جميع نقاط البيانات الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليمات اكتساب الكهربية (سبايك في هذه التجارب II) لانتظار إشارة الزناد المقدمة من إشارة &quot;قراءات الإطار&quot; للكاميرا. بدء الحصول على الصور (AR عناصر)؛ سبايك II سوف تبدأ تلقائيا الآن تسجيل عندما تلتقط الكاميرا الإطار الأول. يمكنك أيضا استخدام الناتج TTL من السلطة لفترة وجيزة من 1401 إلى تحويل على LED التي تقام في ميناء الكاميرا المجهر ل. وهذا سيوفر إشارة لمزامنة البيانات في وقت لاحق والتصوير الكهربية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحفيز الخلايا العصبية قبل المشبكي عن طريق حقن سلسلة من نبضات قصيرة الحالي في إزالة إستقطاب التردد المطلوب. من المهم رصد كل نبضة (على سبيل المثال مع الذبذبات الناجمة التحفيز) لتحديد ما إذا كان العمل هو إمكانية successfولدت ully. بينما أورانج الكالسيوم جدا الصور مستقرة مقارنة مع الأصباغ الأخرى، انها فكرة جيدة لتسجيل محاكمة السيطرة دون التحفيز للتحقق من مدى صبغ التبييض يحدث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في التجارب التي يتم التلاعب تركيزات الكالسيوم داخل الخلايا، يتم إدخال المخدرات مثل EGTA في الخلايا العصبية قبل المشبكي ويتم تكرار الخطوات اقتناء التحفيز والبيانات المذكورة أعلاه. </li></ol> 5. تحليل البيانات الممثل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير البيانات التصوير (قائمة القيم المقاسة لكل شدة ROI) من خلال كتابة ذلك في ملف نصي. ويمكن لبرنامج نصي مخصص في الثاني سبايك ثم استيراد ملف نصي. هذا السيناريو أيضا تطبيع مع القيم منطقة التحقيق الفرد، وينقص من قيمة التحقيق الخلفية. ثم يتم رسم نقاط البيانات جنبا إلى جنب مع البيانات الكهربية باعتبارها &quot;افتراضية RealWave&quot; قناة. يتم استخدام &quot;قناة عملية / الوقت وظيفة التحول&quot; في الثاني سبايك لمحاذاة بالضبط بيانات التصوير البوياليلة، وذلك باستخدام إشارة LED كمرجع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على القيم والتغيير في المئة، وتحليل البيانات عن طريق حساب التصوير التغير النسبي في مضان ومدافع / O = F (FF س) / س F. F O يدل على مستوى مضان قبيل التحفيز وF مضان خلال التحفيز. </li></ol> 6. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. الخطة الشاملة للتجربة. وتجرى التجارب في إعداد العقدة من Aplysia. وتصوير التغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا مع صبغة الفلورسنت، والتي يتم تقديمها إلى الخلايا العصبية iontophoretically قبل المشبكي. ومخوزق ثم الخلايا العصبية قبل وبعد المشبكي مع أقطاب الحاد يمكن أن يتسبب ذلك أن انتقال متشابك ورصدها. <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> <strاونج&gt; الشكل 2. التصوير الكالسيوم داخل الخلايا وتسجيل من الخلايا العصبية التي تم تحديدها في العقدة من الشدق Aplysia. (A) الصورة الجانبية فرع المصورة من B21 الخلايا العصبية. يشير مربع في المنطقة المقاسة في المصالح. (B1) التحفيز داخل الخلايا B21 تثير إمكانات العمل (التتبع أسفل) وبعد المشبكي إمكانات تسهيل (بسبس) في الخلايا العصبية بعد المشبكي B8 أتباع (الشرق التتبع) الامر الذي ادى الى اطلاق النار أيضا إمكانات العمل. وتظهر زيادات في مضان الكالسيوم قبل المشبكي في تتبع أعلى. (B2) تأثير EGTA قبل المشبكي على تسهيل homosynaptic. تم حقن داخل خلوي في EGTA B21 ~ 15 دقيقة قبل التحفيز داخل الخلايا. ويعتقد أن EGTA هو بطيء خالب الكالسيوم التمثيل، الذي بتركيزات منخفضة ليست سريعة بما يكفي لقمع انتقال متشابك. لاحظ انخفاض في إشارة الكالسيوم على نطاق واسع وانخفاض مماثل في السعة PSP. (C) والسعة PSP يرتبط مع calciu قبل المشبكيم الإشارة. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3907/3907fig2large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> .

<ol>
	<li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+synaptic+plasticity.">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li><li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators:+Calcium+green,+calcium+orange+and+calcium+crimson.">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li><li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators:+rapid+transient+response+to+flash+photolysis.">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li><li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2++in+leech+heart+interneurons.">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li><li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia.">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li><li>Ludwar, B. C. h., Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission.">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li><li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h., Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation.">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li><li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Handbook. , (2005).</li><li>Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proprioceptive+role+for+an+exteroceptive+mechanoafferent+neuron+in+Aplysia.">A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia.</a> J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+38:+A+practical+guide:+Two-photon+calcium+imaging+of+spines+and+dendrites.">Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites.</a> Imaging in Neuroscience and Development. , (2005).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

علينا أن نبرهن التقنيات التي يمكن استخدامها في وقت واحد لمراقبة تركيز الكالسيوم داخل الخلايا وتقييم فعالية انتقال متشابك. هذه التقنيات مفيدة لتحديد كيفية توسط أشكال مختلفة من قصيرة الأجل اللدونة. ويتم التصوير بها مع مضان المجهر...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كاشف اسم </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليق </td></tr><tr><td> الكالسيوم أورانج </td><td> إينفيتروجن </td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> سيجما </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> مجموعة الكالسيوم المخزن المؤقت معايرة </td><td> إينفيتروجن </td><td> C-3008MP </td><td> مفيدة لاختبار الحساسية ومجموعة ديناميكية من الإشارة </td></tr><tr><td> المغنيسيوم كلوريد هيدرات </td><td> سيجما </td><td> M0250 </td><td> المستخدمة في حل M 0.33 و تخدير الحيوان </td></tr></tbody></table> الجدول 1. الكواشف المستخدمة. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم المعدات </td><td> شركة </td><td> تعليق </td></tr><tr><td> FN-1 مضان المجهر تستقيم </td><td> نيكون الآلات </td><td> مع Narishige ITS-FN1 المرحلة </td></tr><tr><td> NMN-21 المتلاعبين </td><td> Narishige </td><td> شنت على خشبة المسرح مع المغناطيس </td></tr><tr><td> CoolSNAP HQ كاميرا CCD 2 </td><td> Photometrics </td><td></td></tr><tr><td> NIS عناصر AR (الإصدار 3.22) </td><td> نيكون الآلات </td><td> تستخدم برامج التصوير للحصول على البيانات مضان </td></tr><tr><td> 10X/0.3w خطة فلور الهدف </td><td> نيكون الآلات </td><td> هذه العدسة الغمر بالماء لديها مسافة طويلة جدا من العمل 3.5 ملم </td></tr><tr><td> X-سايت 120 مصباح هاليد المعدنية PC </td><td> EXFO </td><td> تستخدم للتصوير مضان </td></tr><tr><td> LS-DWL مصباح الهالوجين </td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> ET-CY3 تصفية مجموعة </td><td> صفاء التكنولوجيا </td><td>؛ </td></tr><tr><td> السلطة 1401 A / D تحويل </td><td> كامبريدج الالكترونية التصميم </td><td> وقد تم أخذ العينات في 3 كيلو هرتز </td></tr><tr><td> ارتفاع II (الإصدار 7.07) </td><td> كامبريدج الالكترونية التصميم </td><td> استخدام البرمجيات للحصول على البيانات الكهربية </td></tr><tr><td> SEC-10 مكبر للصوت LX </td><td> NPI الالكترونيات </td><td> تستخدم مع headstage 10X </td></tr><tr><td> نموذج مكبر للصوت 410 </td><td> براونلي الدقة </td><td> تستخدم لتضخيم وتصفية الإشارات </td></tr><tr><td> WS-4 </td><td> ك ناقص التكنولوجيا </td><td> العزلة الاهتزاز للتصوير </td></tr><tr><td> التبريد منصة </td><td> والعرف </td><td> لوحة نحاسية من خلالها يتم ضخ الماء المثلج بمعدل متغير </td></tr></tbody></table> الجدول 2. استخدام معدات.

monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia

وقد اقترح أن التغييرات في الكالسيوم داخل الخلايا توسط في تحريض عدد من الأشكال الهامة من اللدونة متشابك (على سبيل المثال، وتيسير homosynaptic) 1. يمكن اختبار هذه الفرضيات من خلال رصد التغيرات في وقت واحد في الكالسيوم داخل الخلايا وإحداث تغييرات في فعالية متشابك. نحن توضح كيف يمكن تحقيق ذلك من خلال الجمع بين التصوير مع الكالسيوم داخل الخلايا تقنيات التسجيل. وتجرى التجارب لدينا في العقدة الشدق من californica Aplysia الرخويات. هذا المستحضر يحتوي على عدد من الميزات تجريبيا المفيد: يمكن إزالتها بسهولة من العقد والتجارب Aplysia استخدام الخلايا العصبية التي تجعل الكبار اتصالات متشابك العادية ويكون لها قناة ايون العادية التوزيع. نظرا لانخفاض معدل الأيض للحيوان ودرجات حرارة منخفضة نسبيا (14-16 ° C) التي هي طبيعية للAplysia .. يجري مستقرة لفترات طويلة من الزمن. الأنف والحنجرة &quot;&gt; للكشف عن تغيرات في الخلايا الكالسيوم الحرة سوف نستخدم النسخة المحمولة من impermeant أورانج الكالسيوم (2) الذي هو بسهولة &#39;تحميل&#39; إلى الخلايا العصبية عن طريق الرحلان الشاردي. هذه الصبغة عندما الطول الموجي الطويل الفلورسنت يربط الكالسيوم، ويزيد من كثافة مضان. أورانج الكالسيوم لديها خصائص الحركية بسرعة 3 و، على عكس الأصباغ ratiometric (على سبيل المثال، FURA 2)، لا يتطلب أي مرشح عجلة للتصوير، وهي الصورة إلى حد ما مستقرة وأقل من الأصباغ سمي ضيائي الأخرى (على سبيل المثال، فلوو-3) 2،4. مثل كل ratiometric غير الأصباغ، البرتقالية الكالسيوم يشير التغيرات النسبية في تركيز الكالسيوم، ولكن لأنه ليس من الممكن لحساب التغيرات في تركيز صبغة بسبب التحميل ونشرها، فإنه لا يمكن معايرتها لتوفير تركيزات الكالسيوم مطلقة. تم استخدام، ثابتة تستقيم المجهر المركب المرحلة، إلى الخلايا العصبية الصورة مع كاميرا CCD قادر على تسجيل نحو 30 لقطة في الثانية. في Aplysia هذا القرار الزمانيهي أكثر من كافية للكشف عن تغيير واحد حتى الناجم عن ارتفاع في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا. وتستخدم في وقت واحد أقطاب حادة للحث على نقل وتسجيل متشابك الخلايا العصبية التي تم تحديدها في مرحلة ما قبل وبعد المشبكي. في ختام كل محاكمة، برنامج نصي مخصص يجمع بين الكهربية وتصوير البيانات. لضمان التزامن المناسب نستخدم نبضة ضوء LED من تقام في ميناء الكاميرا من المجهر. التلاعب في مستويات الكالسيوم قبل المشبكي (على سبيل المثال عن طريق حقن الخلايا EGTA) يسمح لنا لاختبار الفرضيات محددة، فيما يتعلق بدور الكالسيوم داخل الخلايا في التوسط أشكال مختلفة من اللدونة.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia at JoVE.com

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

نبين كيف يمكن تغيير في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الحرة وفعالية متشابك رصد في وقت واحد في إعداد عقدة<em&gt; Aplysia</em&gt;. نحن صورة الكالسيوم داخل الخلايا باستخدام صبغة الفلورسنت، أورانج الكالسيوم، وحمل ومراقبة انتقال متشابك مع الأقطاب الكهربائية (داخل الخلايا) حادة.

رصد التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا وفعالية متشابك في الرخويات<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

monitoring-changes-intracellular-calcium-concentration-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

10.9K Views.  Mt. Sinai School of Medicine. نبين كيف يمكن تغيير في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الحرة وفعالية متشابك رصد في وقت واحد في إعداد عقدة Aplysia. نحن صورة الكالسيوم داخل الخلايا باستخدام صبغة الفلورسنت، أورانج الكالسيوم، وحمل ومراقبة انتقال متشابك مع الأقطاب الكهربائية (داخل الخلايا) حادة...

Video: Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

تصور في Proprioceptors<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات وشرانق

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Electroporation من الدماغ المؤخر لتتبع مسارات محور عصبي والأهداف متشابك في الجنين الفرخ

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

سريع الصغرى، الرحلان الشاردي من الغلوتامات وGABA: أداة مفيدة لبحث تكامل متشابك

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

على الموصل العصبي العضلي: قياس المشبك الحجم، التغييرات تجزئة ومتشابك الكثافة البروتين عن طريق متحد البؤر مضان المجهر

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

تسجيل درجة الحرارة التي يسببها العصبية آخر من خلال مراقبة التغيرات الكالسيوم في البصلة الشمية من<em&gt; القيطم المورق</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using calcium-sensitive fluorescent dyes that change their emission intensity or wavelength depending on the concentration of free calcium in the cell. There are several methods used to stain cells with calcium dyes. Most common are the processes of loading the dyes through a micropipette or pre-incubating with the acetoxymethyl ester forms of the dyes. However, these methods are not quite applicable to neuromuscular junctions (NMJs) due to methodological issues that arise. In this article, we present a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump of the frog nerve into the nerve endings. Since entry of external calcium into nerve terminals and the subsequent binding to the calcium dye occur within the millisecond time-scale, it is necessary to use a fast imaging system to record these interactions. Here, we describe a protocol for recording the calcium transient with a fast CCD camera.

Here, we describe a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump into the nerve endings. We also present a protocol for the recording and analysis of fast calcium transients in the peripheral nerve endings.

تحميل صبغ الكالسيوم إلى نهايات العصب الضفدع من خلال الجذع العصبي: تسجيل الكالسيوم العابر في الضفدع العصبي العضلي تقاطع

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

تسجيل اللدونة متشابك في شرائح هيبوكامبال الحاد تحتفظ في صغيرة الحجم-إعادة التدوير، ونضح-، وغمر من نوع نظام الدائرة

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

استزراع في فيفو--مثل مورين Astrocytes استخدام بروتوكول أوسام سريعة وبسيطة وغير مكلفة

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.