Richard W. Beringer e David L. Ash, gli scienziati le applicazioni, prodotti Thermo NanoDrop scientifico, per l&#39;assistenza tecnica e le riprese.

1. Microvolumi Quantificazione degli acidi nucleici Utilizzando un NanoDrop 2000c Spettrofotometro <ol><li> Per iniziare, pulire le superfici superiori ed inferiori ottica del sistema di ritenzione spettrofotometro microvolumi campione pipettando 2-3 ml di acqua deionizzata pulita sulla superficie inferiore ottica. </li><li> Chiudere il braccio di leva, assicurandosi che il piedistallo superiore entra in contatto con l&#39;acqua deionizzata. Sollevare il braccio di leva e pulire entrambe le superfici ottiche con un panno pulito, asciutto e privo di laboratorio di pulire. </li><li> Aprire il software NanoDrop e selezionare l&#39;applicazione di acido nucleico. Utilizzare un piccolo volume, pipettatore calibrato per eseguire una misurazione vuoto dispensando 1 ml di tampone sulla superficie inferiore ottica. Abbassare il braccio di leva e selezionare &quot;vuoto&quot; nella domanda di acido nucleico. </li><li> Una volta che la misura è vuoto completo, pulire entrambe le superfici ottiche con un panno pulito, asciutto e privo di laboratorio di pulire. </li><li> Scegli la costante appropriata per il campione che deve essere misurato. <table border="1"><tbody><tr><td> Tipo di campione </td><td> Selezionare l&#39;opzione </td><td> Costante utilizzata per calcolare la concentrazione </td></tr><tr><td> dsDNA </td><td> DNA-50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ssDNA </td><td> DNA-33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> RNA-40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Oligo </td><td> Costume </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Tipici acidi nucleici gamme di concentramento diretto A280 misure assorbanza usando un NanoDrop microvolumi spettrofotometro, un tradizionale cuvetta a base di spettrofotometro usato con un Microcell TrayCell cuvetta, e un fluorospectrometer NanoDrop microvolumi in collaborazione con il saggio PicoGreen. </li><li> Dispensare 1 ml di campione di acido nucleico sul piedistallo più basso ottico e chiudere il braccio di leva. Poiché la misura è volume indipendente, il campione ha solo bisogno di colmare il divario tra le due superfici ottiche per una misura da effettuare. </li><li> Selezionare &quot;misura&quot; nel software applicativo. Il software calcola automaticamente l&#39;acido nucleico rapporti di concentrazione e purezza. A seguito di misura, controlla l&#39;emissione spettrale. </li><li> Il software calcola automaticamente l&#39;acido nucleico rapporti di concentrazione e purezza. A seguito di misura, controlla l&#39;immagine spettrale di valutare la qualità del campione. </li><li> Un esempio tipico di acidi nucleici avrà un profilo molto caratteristico. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Un esempio tipico di acidi nucleici avrà un profilo molto caratteristico. </li><li> Le fonti comuni di contaminanti associati a specifiche tecniche di acidi nucleici isolamento includono l&#39;estrazione fenolo / Trizol e colonna. Nel caso di estrazione fenolo / Trizol, la contaminazione dei reagenti residuo può essere indicato da spettri anomali tra 220-240 nm e dagli spostamenti nella regione 260-280 nm. Al contrario, guanidina residuo dall&#39;estrazione colonna possono contribuire a raggiungere un picco vicino a 230 nm e un cambiamento nella vasca da 230 nm a circa 240 nm. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. I cambiamenti nella alti e bassi dei campioni B e C rispetto al campione A illustrare come contaminanti possono influenzare gli spettri di campioni di acidi nucleici. </li><li> Per valutare accuratamente la qualità del campione, 260/280 o 260/230 rapporti devono essere analizzati in combinazione con la complessiva qualità spettrale. Pure acidi nucleici tipicamente produrre un rapporto di 260/280 ~ 1,8 e un rapporto di 260/280 ~ 2.0 per DNA e RNA, rispettivamente. Questo rapporto dipende dal pH e forza ionica del tampone usato per fare il vuoto e le misure del campione. Soluzioni acide sarà sotto-rappresentano il rapporto di 0,2-0,3, mentre una soluzione di base si sovra-rappresentare il rapporto di 0,2-0,3. Rapporti di purezza significativamente differenti possono indicare la presenza di proteine, fenolo o altri contaminanti che assorbono fortemente nei pressi o 280 nm. Il rapporto di 260/230 purezza è una seconda misura di purezza del DNA con i valori di un acido &quot;puro&quot; nucleici comunemente nel range di 1,8-2,2. Rapporti di purezza che sono significativamente inferiori ai valori attesi possono indicare la tecnica di isolamento utilizzato può richiedere un&#39;ulteriore ottimizzazione. </li><li> Spettrofotometri NanoDrop può anche essere utilizzato per quantificare le proteine ​​mediante assorbanza direttamente o tramite test colorimetrici proteine. Per garantire una corretta formazione della colonna e riproducibilità, 2-microlitri campioni si consiglia di campioni di proteine. Fare riferimento al seguente video jove: Determinazione delle proteine ​​microvolumi Concentrazione Utilizzando lo spettrofotometro NanoDrop <a href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610</a> </li></ol><ol><li> Per dimostrare ad alta sensibilità quantificazione degli acidi nucleici microvolumi utilizzando il NanoDrop 3300, un kit PicoGreen fluorescenza viene utilizzato. Per iniziare, equilibrare gli standard kit e tutti i campioni di acidi nucleici a temperatura ambiente. Campioni fluorescenti sono sensibili alla luce e deve essere conservato in ambra o tubi avvolti in alluminio. </li><li> Preparare abbastanza 1x tampone TE per tutti gli standard ed i campioni da misurare, nonché per la soluzione PicoGreen di lavoro che saranno necessarie. Preparare tampone 1xTE diluendo il fornita 20x TE buffer con acqua priva di nucleasi per protocollo del produttore. Volumi di reazione può variare da 200 ul a un minimo di 10 ul. In questo esempio, 10 volumi di reazione microlitri sarà preparato. </li><li> Preparare in serie standard diluita dsDNA a 2x la concentrazione finale desiderata nucleasi-free fiale o provette. Trasferire 5 ml di ciascuna soluzione standard di dsDNA diluito in un individuo etichettato nucleasi-free ambra o alluminio coperto di tubo. </li><li> Aliquota 5 ml di ogni campione dsDNA di interesse in adeguatamente etichettati nucleasi-free ambra o foglio coperto di tubi. </li><li> Preparare la soluzione PicoGreen di lavoro secondo il protocollo del produttore. Trasferire un volume uguale della soluzione PicoGreen di lavoro ad ogni provetta contenente sia uno standard o campione di interesse (5 microlitri in questo esempio). </li><li> Combina volumi uguali di 1x tampone TE e PicoGreen soluzione di lavoro per preparare il controllo negativo, che serve come soluzione di riferimento. </li><li> Mescolare il contenuto di ogni provetta accuratamente pipettando dolce e incubare le reazioni a temperatura ambiente per 5 minuti. Tutti gli standard ed i campioni devono essere equilibrati per la stessa temperatura prima della misurazione come segnale di fluorescenza è influenzata dalla temperatura. </li><li> Per preparare lo strumento e di eseguire le misurazioni, in primo luogo la pulizia delle superfici inferiore e superiore del sistema di ritenzione del campione. Pipettare 2-3 ml di acqua deionizzata sulla superficie inferiore ottica, chiudere quindi aprire il braccio di leva, e cancella i piedistalli superiore e inferiore con un panno pulito, privo di lanugine, pulire laboratorio. Assicurarsi che le superfici siano prive di lanugine prima di procedere come niente può esibire fluorescenza in presenza di una fonte di eccitazione e possono interferire con la misurazione. </li><li> Aprire il software dello strumento, selezionare l&#39;opzione &quot;Nucleic Acids&quot; applicazione e selezionare l&#39;opzione &quot;PicoGreen-dsDNA&quot;. </li><li> Al vuoto dello strumento, aggiungere 2 ml di TE 1x al piedistallo più basso, vicino al braccio, e selezionare &quot;Vuoto&quot; nel campo del software dello strumento. Una volta vuota è completo, macchia al largo della prova in bianco su entrambe le superfici del sistema di ritenzione del campione. </li><li> Mescolare la soluzione di riferimento pipettando gentile. Utilizzando punte bassa ritenzione, pipetta 2 microlitri sul piedistallo più basso e chiudere il braccio. </li><li> Selezionare &quot;di riferimento&quot; nel tipo di misura, e selezionare le unità desiderate. Fare clic su &quot;misura&quot; per avviare il ciclo di misurazione. </li><li> Quando il ciclo di misura, aprire completamente il braccio e macchia le superfici Sistema di ritenzione del campione. Misura fino a cinque repliche di riferimento, su una nuova aliquota per ogni replica. </li><li> Ripetere la procedura per gli standard aggiuntivi per costruire una curva standard. Fino a sette norme possono essere utilizzati. Il software è progettato per memorizzare fino a cinque repliche per ogni standard. Replica degli standard viene calcolata la media per generare una curva standard da cui concentrazioni del campione sono determinati automaticamente. </li><li> Una volta che la curva standard è completo, selezionare la scheda &quot;Campioni&quot;, inserire le rispettive informazioni ID campionamento e la misurazione di ogni campione sconosciuto. </li></ol>

<ol>
	<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity.">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li><li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Quantification+of+Nucleic+Acids:+LabelGuard+enables+photometric+quantification+of+submicroliter+samples+using+a+standard+photometer.">Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer.</a> Implen Applications Note. , (2006).</li><li>Jr, I. n. g. l. e., D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spectrochemical analysis. , XV-590 (1988).</li><li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA.">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li></ol>

Philippe Desjardins e Debra Conklin sono dipendenti di Thermo Scientific NanoDrop Products, Inc che produce gli strumenti utilizzati in questo articolo.

I protocolli di quantificazione qui presentati sono basati sul più diffuso dei sistemi microvolumi. Tali sistemi offrono alternative pratiche per la tradizionale metodologia di quantificazione acidi nucleici, che si basano su maggiori volumi di campione e l&#39;impiego di attrezzature di contenimento. NanoDrop microvolumi tecnologia si avvale di un sistema di ritenzione del campione che si basa sulle proprietà tensione della superficie del campione da misurare a formare una colonna di liquido. E &#39;essenziale che il campione entra in contatto con le superfici superiori ed inferiori misura ottica per la formazione di colonna corretta. Se in qualsiasi momento i risultati delle misurazioni sembrano imprecisi o non riproducibili, è probabilmente il risultato di eterogeneità del campione o la rottura della colonna liquida. Detergenti e alcool isopropilico non sono consigliati detergenti in quanto potrebbero uncondition le superfici piedistallo di misura. Un piedistallo incondizionata si verifica quando le proprietà di superficie idrofoba del piedistallo sono stati compromessi, con un conseguente appiattimento della goccia campione. Piedistalli incondizionato può portare alla rottura della colonna di liquido durante la misurazione. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Superficie Figura 3. Incondizionato è caratterizzata da un appiattimento di una goccia d&#39;acqua. Superfici piedistallo Uncondtioned possono essere revisionati con Compound NanoDrop piedistallo Ricondizionamento (PR-1, Thermo Scientific Prodotti NanoDrop). Un sottile strato di composto ricondizionamento viene applicata alle superfici piedistallo superiore e inferiore, lasciato asciugare per circa 30 secondi, poi strofinando con un panno pulito, asciutto e privo di laboratorio di pulire. Uno stato con successo ricondizionati è caratterizzato da una goccia d&#39;acqua perline quando applicato sulla superficie in basso piedistallo. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Ricondizionati Una superficie è caratterizzata da una bordatura di una goccia d&#39;acqua. Sistemi di quantificazione microvolumi ridurre notevolmente il consumo di campione e aumentare notevolmente il range di concentrazione rispetto ai più tradizionali sistemi di quantificazione. Anche se la quantificazione microvolumi è diventato spesso una tecnologia abilitante per le circostanze che coinvolgono la massa limitata di cellule, come le biopsie ago e laser-capture microdissezione, l&#39;efficienza e la facilità d&#39;uso di questa metodologia ha reso un ampiamente accettato alternativa ai tradizionali metodi di quantificazione acidi nucleici anche campione quando è abbondante.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NanoDrop 2000c</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>ND-2000C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop 3300</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>ND-3300</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

nanodrop microvolume quantitation of nucleic acids

Analisi biomolecolari sono in costante sviluppo che usano quantità sempre più piccoli di materiale, spesso precludendo l&#39;utilizzo di tradizionali strumenti basati cuvetta per la quantificazione degli acidi nucleici per coloro che possono eseguire quantificazione microvolumi. Il NanoDrop microvolumi Sistema di ritenzione del campione (Thermo Prodotti NanoDrop Scientifica) le funzioni unendo tecnologia delle fibre ottiche e le proprietà naturali della tensione superficiale di catturare e trattenere piccole quantità di campione indipendente di apparecchi di contenimento tradizionali come cuvette o capillari. Inoltre, il sistema impiega lunghezze di percorso più breve, che si traducono in una vasta gamma di misure di concentrazione di acidi nucleici, essenzialmente eliminando la necessità di eseguire diluizioni. Riduzione del volume di campione per l&#39;analisi spettroscopica facilita anche l&#39;inserimento di ulteriori passi di controllo di qualità in molti flussi di lavoro molecolare, aumentando l&#39;efficienza e, in definitiva portando ad una maggiore fiducia nei risultati a valle. La necessità di alta sensibilità di analisi a fluorescenza di massa limitata è anche emerso con i recenti progressi sperimentali. Utilizzando la stessa tecnologia di ritenzione del campione microvolumi, misure fluorescenti possono essere eseguite con 2 ml di materiale, permettendo fluorescente requisiti volume di saggi di essere significativamente ridotta. Microreactions tale di 10 L o meno sono ora possibili utilizzando un fluorospectrometer dedicato microvolumi. Due microvolumi acidi nucleici protocolli di quantificazione sarà dimostrato che l&#39;uso integrato di sistemi di ritenzione del campione come alternative alle tradizionali pratiche cuvetta protocolli basati su. In primo luogo, un metodo diretto A260 assorbanza con uno spettrofotometro microvolumi è descritto. Questa è seguita da una dimostrazione di un metodo basato fluorescenza, che consente le reazioni fluorescenza ridotto volume con un fluorospectrometer microvolumi. Queste nuove tecniche permettono la valutazione delle concentrazioni degli acidi nucleici che vanno da 1 pg / mL a 15.000 ng / mL con un consumo minimo di campione.

Watch this Scientific Journal Video about NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids at JoVE.com

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

L&#39;uso di sistemi NanoDrop microvolumi come alternativa pratica ed efficace ai tradizionali metodologia di quantificazione acidi nucleici è descritto attraverso la dimostrazione di due protocolli di acido nucleico quantificazione microvolumi.

NanoDrop microvolumi quantificazione degli acidi nucleici

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

<a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2891"> &#x4E2D;&#x6587; </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2892"> Deutsch </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2893"> Fran&#231;ais </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2894"> Espa&ntilde;ol </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/Details.stp?ID=2895"> &#x65E5;&#x672C;&#x8A9E; </a>

nanodrop-microvolume-quantitation-of-nucleic-acids

Research

JoVE Journal

Biology

198.8K Views.  Thermo Scientific NanoDrop Products.  中文 Deutsch Français 

Video: NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Microvolumi Concentrazione Determinazione delle proteine ​​con il NanoDrop 2000c Spettrofotometro

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Ricerca

Biologia

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

ΓH2AX quantificazione dei Foci, a campioni di tessuto

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Determinazione concentrazione di acidi nucleici e proteine ​​Utilizzando il Micro-volume Bio-spec Spettrofotometro Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

Elettricità-Free, Nucleic Acid sequenziale e isolamento delle proteine

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

Analisi e costruzione di strutture acidi nucleici con 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, and participate in various signaling pathways. Caenorhabditis elegans synthesizes all of the enzymes necessary to produce a range of omega-6 and omega-3 fatty acids. This, combined with the simple anatomy and range of available genetic tools, make it an attractive model to study fatty acid function. In order to investigate the genetic pathways that mediate the physiological effects of dietary fatty acids, we have developed a method to supplement the C. elegans diet with unsaturated fatty acids. Supplementation is an effective means to alter the fatty acid composition of worms and can also be used to rescue defects in fatty acid-deficient mutants. Our method uses nematode growth medium agar (NGM) supplemented with fatty acidsodium salts. The fatty acids in the supplemented plates become incorporated into the membranes of the bacterial food source, which is then taken up by the C. elegans that feed on the supplemented bacteria. We also describe a gas chromatography protocol to monitor the changes in fatty acid composition that occur in supplemented worms. This is an efficient way to supplement the diets of both large and small populations of C. elegans, allowing for a range of applications for this method.

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a useful model to explore the functions of polyunsaturated fatty acids in development and physiology. This protocol describes an efficient method of supplementing the C. elegans diet with polyunsaturated fatty acids.

La supplementazione alimentare di acidi grassi polinsaturi a<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Specifici Sequenza Etichettatura degli acidi nucleici e proteine ​​con metiltransferasi e cofattore Analoghi

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Legatura altamente efficiente delle piccole molecole di RNA per microRNA Quantificazione mediante sequenziamento High-Throughput

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

La quantificazione di adesività delle cellule endoteliali<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Semplice Lettura di massa di Digital acido nucleico quantificazione Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...