Richard W. Beringer und David L. Ash, Applications Wissenschaftler, Thermo Scientific NanoDrop Produkte, für die technische Unterstützung und Filmen.

1. Mikrovolumen Nucleic Acid Quantifizierung Mit einem NanoDrop 2000c Spektrophotometer <ol><li> Um zu beginnen, reinigen Sie den oberen und unteren optischen Oberflächen der Mikrovolumens Spektralphotometer Probe Rückhaltesystem durch Pipettieren von 2 bis 3 ul von sauberem VE-Wasser auf die untere optische Oberfläche. </li><li> Schließen Sie den Hebelarm, sicherzustellen, dass die obere Podest in Kontakt mit dem VE-Wasser kommt. Heben Sie den Hebelarm und wischen Sie die beiden optischen Oberflächen mit einem sauberen, trockenen, fusselfreien Tuch Labor. </li><li> Öffnen Sie die NanoDrop Software und wählen Sie die Nukleinsäure-Anwendung. Verwenden Sie einen kleinvolumigen, kalibrierte Pipette, um eine leere Messung durch den Verzicht auf 1 ul des Puffers auf die untere optische Oberfläche durchzuführen. Senken Sie den Hebel, und wählen Sie &quot;Blank&quot; in der Nukleinsäure-Anwendung. </li><li> Sobald die Blank-Messung abgeschlossen ist, reinigen Sie beide optischen Oberflächen mit einem sauberen, trockenen, fusselfreien Tuch Labor. </li><li> Wählen Sie die entsprechende Konstante für die Probe, die gemessen werden soll. <table border="1"><tbody><tr><td> Sample Type </td><td> Wählen Sie die Option </td><td> Konstante, mit der Konzentration berechnen </td></tr><tr><td> dsDNA </td><td> DNA-50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ssDNA </td><td> DNA-33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> RNA-40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Oligo </td><td> Brauch </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Typische Nukleinsäure Konzentrationsbereiche für direkte A280 Absorptionsmessungen mit einem NanoDrop Mikrovolumens Spektralphotometer, einem traditionellen Küvette-based-Spektralphotometer mit einem TrayCell Mikrozelle Küvette verwendet, und ein Mikrovolumens NanoDrop fluorospectrometer in Verbindung mit dem PicoGreen Assay. </li><li> Dispense 1 ul der Nukleinsäure-Probe auf die geringere optische Sockel und schließen Sie den Hebelarm. Da die Messung Volumen unabhängig, die Probe muss nur die Kluft zwischen den beiden optischen Oberflächen für eine Messung vorgenommen werden überbrücken. </li><li> Wählen Sie &quot;Messen&quot; in der Anwendungssoftware. Die Software berechnet automatisch die Nukleinsäure-Konzentration und Reinheit Verhältnisse. Nach Probenmessung, überprüfen Sie die spektrale Leistung. </li><li> Die Software berechnet automatisch die Nukleinsäure-Konzentration und Reinheit Verhältnisse. Nach Probenmessung, überprüfen Sie die spektrale Bild auf Probe Qualität zu beurteilen. </li><li> Ein typisches Nukleinsäureprobe haben ein sehr charakteristisches Profil. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Ein typisches Nukleinsäureprobe haben ein sehr charakteristisches Profil. </li><li> Häufige Quellen von Verunreinigungen mit spezifischen Nukleinsäure-Isolierung-Verfahren sind die Phenol / Trizol und Spalte Extraktion. Im Falle von Phenol / Trizol-Extraktion, können Rest-Reagenz Kontamination durch abnorme Spektren zwischen 220 bis 240 nm sowie durch Verschiebungen in der 260-280 nm-Bereich angegeben werden. Umgekehrt kann Rest-Guanidin aus Spalte Extraktion auf einen Spitzenwert in der Nähe 230 nm und eine Verschiebung in den Trog von 230 nm bis etwa 240 nm beitragen. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Die Verschiebungen in den Höhen und Tiefen der Proben B und C im Vergleich zu Probe A zeigen, wie Verunreinigungen können die Spektren von Nukleinsäure-Proben beeinflussen. </li><li> Um genau zu beurteilen Probe Qualität, sollte 260/280 oder 260/230 Verhältnisse in Verbindung mit der tonalen Qualität analysiert werden. Reine Nukleinsäuren typischerweise ergeben eine 260/280 Ratio von etwa 1,8 und einem 260/280 Ratio von ~ 2,0 für DNA und RNA, bzw.. Dieses Verhältnis ist abhängig vom pH-Wert und Ionenstärke des Puffers verwendet, um den Leerwert und Probe-Messungen zu machen. Saure Lösungen werden unter-stellen das Verhältnis um 0,2-0,3, während einer basischen Lösung wird über-stellen das Verhältnis um 0,2-0,3. Signifikant verschieden Reinheit Verhältnisse können auf das Vorhandensein von Protein-, Phenol-oder andere Verunreinigungen, die stark absorbieren bei oder nahe bei 280 nm. Die 260/230 Reinheit Verhältnis ist eine zweite Maßnahme der DNA-Reinheit mit den Werten für eine &quot;reine&quot; Nukleinsäure üblicherweise im Bereich von 1,8-2,2. Purity-Verhältnisse, die deutlich niedriger als die erwarteten Werte sind möglicherweise für die Isolierung verwendete Technik kann weiter optimiert werden müssen. </li><li> NanoDrop Spektralphotometer kann auch verwendet werden, um Proteine ​​durch direkte Absorption oder durch Protein kolorimetrischen Assays quantifizieren. Um eine ordnungsgemäße Spalte Bildung und Reproduzierbarkeit, sind 2-ul-Proben für Protein-Proben empfohlen. Beachten Sie die folgenden JoVE Video: Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung Mit dem NanoDrop Spektralphotometer <a href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610</a> </li></ol><ol><li> Um zu demonstrieren, mit hoher Empfindlichkeit Mikrovolumens Nukleinsäure Quantifizierung mit dem NanoDrop 3300, ist ein PicoGreen Fluoreszenz-Kit verwendet. Um zu beginnen, äquilibrieren dem Kit-Standards und aller Nukleinsäure-Proben auf Raumtemperatur. Fluoreszierende Proben sind lichtempfindlich und sollte in Bernstein oder Aluminium verpackt Röhren gehalten werden. </li><li> Bereiten Sie genug 1x TE-Puffer für alle Standards und Proben sowie für die PicoGreen funktionierende Lösung, die benötigt werden, gemessen werden. Bereiten 1xTE Puffer durch Verdünnen der bereitgestellten 20x TE-Puffer mit Nuklease-freiem Wasser pro Protokoll des Herstellers. Reaction Volumes können aus 200 ul, so wenig wie 10 ul-Bereich. In diesem Beispiel werden 10 ul Reaktionsvolumen vorbereitet werden. </li><li> Bereiten seriell verdünnt dsDNA-Standards bei 2x die endgültige gewünschte Konzentration in Nuklease-freies Fläschchen oder Tuben. Transfer-5 ul der verdünnten dsDNA-Standards in einen einzelnen markierten Nuklease-freies Bernstein oder Folie abgedeckten Röhre. </li><li> Aliquot 5 ul jeder dsDNA Probe von Interesse in entsprechend gekennzeichneten Nuklease-freies Bernstein oder Folie abgedeckten Rohre. </li><li> Bereiten PicoGreen funktionierende Lösung nach dem Protokoll des Herstellers. Übertragung der gleichen Menge des PicoGreen funktionierende Lösung in jedes Röhrchen, die entweder eine Standard-oder Probe von Interesse (5 ul in diesem Beispiel). </li><li> Die gleiche Menge 1x TE-Puffer und PicoGreen funktionierende Lösung, die negative Kontrolle, die als Referenz-Lösung dient vorzubereiten. </li><li> Mischen Sie die Inhalte der einzelnen Reaktionsgefäß durch leichtes Pipettieren und inkubieren Sie die Reaktionen bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Alle Standards und Proben sollten äquilibriert auf die gleiche Temperatur vor der Messung der Fluoreszenz-Signal von der Temperatur beeinflusst wird. </li><li> Zur Vorbereitung der Instrumente und Messungen durchführen, zuerst reinigen Sie den unteren und oberen Flächen der Probe Rückhaltesystem. Pipettieren von 2 bis 3 ul entionisiertem Wasser auf die untere optische Oberfläche, in der Nähe öffnen Sie dann den Hebelarm, und tupfen Sie den oberen und unteren Sockel mit einem sauberen, fusselfreien, wischen Labor. Sicherstellen, dass die Oberflächen sind frei von Flusen, bevor Sie fortfahren wie Flusen weisen in Gegenwart von einer Anregungsquelle Fluoreszenz und kann die Messung stören. </li><li> Öffnen Sie den Geräte-Software, wählen Sie die &quot;Nukleinsäuren&quot; Anwendung, und wählen Sie die &quot;PicoGreen-dsDNA&quot;-Option. </li><li> Um leere das Instrument, fügen Sie 2 &amp;mgr; l 1x TE auf den unteren Sockel, in der Nähe der Arm, und wählen Sie &quot;Blank&quot; in das Instrument Software-Bereich. Einmal leer abgeschlossen ist, abtupfen der Blindprobelösung von beiden Oberflächen der Probe Rückhaltesystem. </li><li> Mix der Referenz-Lösung durch vorsichtiges Pipettieren. Mit geringer Retention, Pipette 2 ul auf den unteren Sockel und schließen Sie den Arm. </li><li> Wählen Sie &quot;Referenz&quot; in die Messung ein, und wählen Sie die gewünschten Einheiten. Klicken Sie auf &quot;Messen&quot; der Messzyklus zu initiieren. </li><li> Wenn der Messzyklus abgeschlossen ist, öffnen Sie den Arm und gründlich abtupfen der Probe Rückhaltesystem Oberflächen. Distanzen bis zu fünf Wiederholungen der Referenz, mit einem frischen Aliquot für jede Wiederholung. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang für die weiteren Standards, um eine Standardkurve zu erstellen. Bis zu sieben Standards verwendet werden. Die Software wurde entwickelt, um bis zu fünf Wiederholungen für jede Norm. Repliziert der Standards werden gemittelt, um eine Standardkurve aus dem die Probe Konzentrationen automatisch ermittelt werden zu generieren. </li><li> Sobald der Standard-Kurve abgeschlossen ist, wählen Sie die &quot;Samples&quot; Registerkarte, geben Sie die jeweilige Probe-ID-Informationen und messen jede unbekannte Probe. </li></ol>

<ol>
	<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity.">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li><li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Quantification+of+Nucleic+Acids:+LabelGuard+enables+photometric+quantification+of+submicroliter+samples+using+a+standard+photometer.">Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer.</a> Implen Applications Note. , (2006).</li><li>Jr, I. n. g. l. e., D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spectrochemical analysis. , XV-590 (1988).</li><li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA.">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li></ol>

Philippe Desjardins und Debra Conklin von Thermo Scientific NanoDrop Products, Inc, dass die Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert beschäftigt.

Die Quantifizierung Protokolle hier präsentiert werden, auf die am meisten akzeptierte Mikrovolumens Systemen. Derartige Systeme bieten eine praktische Alternative für traditionelle Nukleinsäure Quantifizierung Methodik, die auf größere Probenvolumina und den Einsatz von Containment-Apparat angewiesen. NanoDrop Mikrovolumens Technologie verwendet eine Probe Rückhaltesystem, das auf die Oberflächenspannung Eigenschaften der Probe gemessen, um eine Flüssigkeitssäule Form setzt. Es ist wichtig, dass die Probe Kontakt mit dem oberen und unteren optische Messung Flächen für die richtige Spalte Bildung. Wenn zu irgendeinem Zeitpunkt die Messergebnisse ungenau oder nicht reproduzierbar scheint, ist es sehr wahrscheinlich das Ergebnis der Probe Heterogenität oder Flüssigkeitssäule Bruch. Wasch-und Isopropylalkohol werden nicht empfohlen, Reinigungsmittel, da sie das Podest Messflächen kann bedingungslos. Eine unbedingte Podest tritt auf, wenn die hydrophobe Oberfläche Eigenschaften des Sockels kompromittiert wurden, was zu einer Abflachung der Probe Tropfen. Unconditioned Sockel kann zum Bruch der Flüssigkeitssäule während der Messung führen. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Unconditioned Oberfläche wird durch eine Abflachung eines Wassertropfens aus. Uncondtioned Sockel Oberflächen können überholt mit NanoDrop Pedestal Überholung Compound (PR-1, Thermo Scientific NanoDrop Products) werden. Eine dünne Schicht der Wiederaufbereitung Verbindung der oberen und unteren Sockel Oberflächen, dürfen für ~ 30 Sekunden trocken angewendet wird, dann abgerieben mit einem sauberen, trockenen, fusselfreien Tuch Labor. Ein erfolgreich überholt Zustand wird durch einen Wassertropfen Sicken auf, wenn auf den Boden Sockel Oberfläche aufgebracht wird. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Ein erneuerter Oberfläche wird durch eine Sicke bis eines Wassertropfens aus. Mikrovolumen Quantifizierung Systemen erheblich reduzieren Probe Verbrauch und einem dramatischen Anstieg der Konzentrationsbereich, wenn zu traditionellen Quantifizierung Systeme verglichen. Obwohl Mikrovolumens Quantifizierung ist oft eine grundlegende Technologie für bestimmte Umstände wie begrenzt Zellmasse wie Nadel-Biopsien und Laser-Mikrodissektion, die Effizienz und Einfachheit der Anwendung dieser Methode hat es eine weithin akzeptierte Alternative zu herkömmlichen Nukleinsäure Quantifizierung Methoden werden auch wenn Probe ist reichlich.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NanoDrop 2000c</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>ND-2000C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop 3300</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>ND-3300</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

nanodrop microvolume quantitation of nucleic acids

Biomolekulare Analysen werden kontinuierlich weiterentwickelt, dass die Verwendung immer kleiner Mengen von Material, oft entgegensteht, die Verwendung von konventionellen Küvette Instrumente für Nukleinsäure-Quantifizierung für diejenigen, die Mikrovolumens Quantifizierung durchführen können. Die NanoDrop Mikrovolumens Probenretention System (Thermo Scientific NanoDrop Products)-Funktionen durch die Kombination von LWL-Technik und natürliche Oberflächenspannung Eigenschaften zu erfassen und zu behalten winzige Mengen der Probe unabhängig von traditionellen Containment Geräte wie Küvetten oder Kapillaren. Darüber hinaus verwendet das System kürzere Weglängen, die sich in einer breiten Palette von Nukleinsäure-Konzentration Messungen im Wesentlichen entfällt die Notwendigkeit, Verdünnungen durchzuführen. Verringerung des Volumens der Probe für die spektroskopische Analyse erforderlich erleichtert auch die Aufnahme von zusätzlichen Qualitätskontrolle Schritten über viele molekulare Abläufe, Steigerung der Effizienz und letztlich zu mehr Vertrauen in nachgelagerten Ergebnisse. Die Notwendigkeit hoher Empfindlichkeit fluoreszierender Analyse der begrenzten Masse hat auch mit den jüngsten experimentellen Fortschritte hervor. Mit der gleichen Mikrovolumens Probenretention Technologie kann Fluoreszenz-Messungen mit 2 ul des Materials durchgeführt werden, so dass Fluoreszenzassays Volumen Anforderungen deutlich reduziert werden. Solche Mikroreaktionen von 10 ul oder weniger sind jetzt möglich mit einem dedizierten Mikrovolumens fluorospectrometer. Zwei Mikrovolumens Nukleinsäure Quantifizierung Protokolle zeigten, dass die Verwendung integrierter Probe Rückhaltesysteme als praktische Alternative zu herkömmlichen Küvetten-basierte Protokolle werden. Zunächst wird eine direkte A260 Absorption unter Verwendung eines Mikrovolumens Spektralphotometer beschrieben. Dies wird durch eine Demonstration eines Fluoreszenz-basierten Verfahren, das mit reduziertem Volumen Fluoreszenz Reaktionen ermöglicht mit einem Mikrovolumens fluorospectrometer gefolgt. Diese neuen Techniken ermöglichen die Beurteilung von Nukleinsäure-Konzentrationen von 1 pg / ul bis 15.000 ng / ul mit minimalem Verbrauch der Probe.

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NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Die Verwendung von NanoDrop Mikrovolumens Systeme als praktische und effiziente Alternative zu herkömmlichen Nukleinsäure Quantifizierung Methodik ist durch die Demonstration von zwei Mikrovolumens Nukleinsäure Quantifizierung Protokollen beschrieben.

NanoDrop Mikrovolumen Quantifizierung von Nukleinsäuren

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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Serie: NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem NanoDrop 2000c Spektrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Forschung

Biologie

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Gewebeproben

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen Mit dem Micro-Volumen Bio-spec Nano-Spektralphotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

Strom-Free, Sequential Nukleinsäure-und Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

Analysieren und Bauen Nukleinsäurestrukturen mit 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, and participate in various signaling pathways. Caenorhabditis elegans synthesizes all of the enzymes necessary to produce a range of omega-6 and omega-3 fatty acids. This, combined with the simple anatomy and range of available genetic tools, make it an attractive model to study fatty acid function. In order to investigate the genetic pathways that mediate the physiological effects of dietary fatty acids, we have developed a method to supplement the C. elegans diet with unsaturated fatty acids. Supplementation is an effective means to alter the fatty acid composition of worms and can also be used to rescue defects in fatty acid-deficient mutants. Our method uses nematode growth medium agar (NGM) supplemented with fatty acidsodium salts. The fatty acids in the supplemented plates become incorporated into the membranes of the bacterial food source, which is then taken up by the C. elegans that feed on the supplemented bacteria. We also describe a gas chromatography protocol to monitor the changes in fatty acid composition that occur in supplemented worms. This is an efficient way to supplement the diets of both large and small populations of C. elegans, allowing for a range of applications for this method.

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a useful model to explore the functions of polyunsaturated fatty acids in development and physiology. This protocol describes an efficient method of supplementing the C. elegans diet with polyunsaturated fatty acids.

Nahrungsergänzung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Sequenzspezifische Markierung von Nukleinsäuren und Proteinen mit Methyltransferasen und Cofaktor-Analoga

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Hoch effiziente Ligation kleine RNA-Moleküle für MicroRNA Quantifizierung von Hochdurchsatz-Sequenzierung

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Die Quantifizierung der Endothelial Cell Haftfähigkeit<em&gt; In-vitro-</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...