Richard W. Beringer et David L. Ash, scientifiques applications, produits Thermo Scientific NanoDrop, d&#39;assistance technique et de tournage.

1. Quantification microvolume acide nucléique en utilisant une NanoDrop 2000c Spectrophotomètre <ol><li> Pour commencer, nettoyer les surfaces supérieures et inférieures optique du système de rétention spectrophotomètre microvolume échantillon par pipetage 2 à 3 uL d&#39;eau déminéralisée propre sur la surface inférieure optique. </li><li> Fermer le bras de levier, assurant que le piédestal supérieure vient en contact avec l&#39;eau déminéralisée. Soulever le bras de levier et essuyez les surfaces optiques avec un chiffon propre, sec, non pelucheux laboratoire essuyer. </li><li> Ouvrez le logiciel NanoDrop et sélectionnez l&#39;application des acides nucléiques. Utiliser un petit volume, pipette calibrée pour effectuer un essai à blanc en supprimant 1 ul de tampon sur la surface inférieure optique. Abaissez le bras de levier et sélectionnez &quot;vierge&quot; dans l&#39;application des acides nucléiques. </li><li> Une fois l&#39;essai à blanc est terminée, nettoyer les deux surfaces optiques avec un chiffon propre, sec, non pelucheux laboratoire essuyer. </li><li> Choisissez la constante appropriée de l&#39;échantillon qui doit être mesuré. <table border="1"><tbody><tr><td> Type d&#39;échantillon </td><td> Sélectionnez l&#39;option </td><td> Constante utilisée pour calculer la concentration </td></tr><tr><td> ADNdb </td><td> DNA-50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ADNss </td><td> DNA-33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> ARN </td><td> ARN-40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Oligo </td><td> Personnalisé </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Typiques nucléiques gammes de concentration d&#39;acide pour les mesures d&#39;absorbance A280 directe en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop microvolume, une cuvette traditionnelle basée spectrophotomètre utilisé avec une cuvette TrayCell Microcell, et un fluorospectrometer NanoDrop microvolume en conjonction avec le dosage PicoGreen. </li><li> Répartir 1 ul d&#39;échantillon d&#39;acides nucléiques sur la partie inférieure piédestal optique et fermer le bras de levier. Parce que la mesure est indépendant du volume, l&#39;échantillon a seulement besoin de combler le fossé entre les deux surfaces optiques pour une mesure à prendre. </li><li> Sélectionnez &quot;mesure&quot; dans le logiciel d&#39;application. Le logiciel calcule automatiquement le taux de concentration d&#39;acides nucléiques et de pureté. Suite à la mesure de l&#39;échantillon, l&#39;examen de la sortie spectrale. </li><li> Le logiciel calcule automatiquement le taux de concentration d&#39;acides nucléiques et de pureté. Suite à la mesure de l&#39;échantillon, l&#39;examen de l&#39;image spectrale pour évaluer la qualité de l&#39;échantillon. </li><li> Un échantillon d&#39;acide nucléique typiques ont un profil très caractéristique. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Un échantillon d&#39;acide nucléique typiques ont un profil très caractéristique. </li><li> Les sources communes de polluants associés à des techniques d&#39;isolement nucléiques acides comprennent l&#39;extraction phénol / Trizol et la colonne. Dans le cas de l&#39;extraction phénol / Trizol, la contamination réactif résiduel peut être indiquée par des spectres anormaux entre 220 à 240 nm ainsi que par des changements dans la région 260-280 nm. Inversement, la guanidine résiduelles provenant de l&#39;extraction de colonne peut contribuer à un pic de près de 230 nm et un changement dans le creux de 230 nm à environ 240 nm. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Les changements dans les pics et les creux des échantillons B et C par rapport à l&#39;échantillon A d&#39;illustrer comment les contaminants peuvent affecter les spectres des échantillons d&#39;acide nucléique. </li><li> Pour évaluer avec précision la qualité des échantillons, 260/280 ou 260/230 ratios doivent être analysés en combinaison avec la qualité spectrale globale. Pur acides nucléiques généralement un ratio de rendement des 260/280 ~ 1,8 et un ratio de 260/280 de ~ 2.0 pour l&#39;ADN et l&#39;ARN, respectivement. Ce ratio est dépendant du pH et la force ionique du tampon utilisé pour faire l&#39;ébauche et les mesures d&#39;échantillons. Des solutions acides seront sous-représenter le ratio de 0,2-0,3, tandis qu&#39;une solution de base sera sur-représenter le ratio de 0,2-0,3. Ratios significativement différents de pureté peut indiquer la présence de protéines, de contaminants de phénol ou d&#39;autres qui absorbent fortement à ou près 280 nm. Le ratio 260/230 pureté est une deuxième mesure de pureté de l&#39;ADN avec des valeurs pour un acide nucléique «pure» couramment de l&#39;ordre de 1.8 à 2.2. Ratios de pureté qui sont nettement inférieurs aux valeurs attendues peuvent indiquer la technique d&#39;isolement utilisées peuvent nécessiter une optimisation plus poussée. </li><li> Spectrophotomètres NanoDrop peut également être utilisé pour quantifier les protéines à l&#39;aide d&#39;absorbance directe ou par des analyses de protéines colorimétrique. Pour assurer la formation adéquate et une reproductibilité de colonne, 2-ul échantillons sont conseillés pour les échantillons de protéines. Se référer à la vidéo suivante JoVE: Détermination microvolume concentration de protéines utilisant le spectrophotomètre NanoDrop <a href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610</a> </li></ol><ol><li> Pour démontrer à haute sensibilité quantification microvolume acide nucléique en utilisant les 3300 NanoDrop, un kit PicoGreen fluorescence est utilisée. Pour commencer, à équilibrer le kit normes et tous les échantillons d&#39;acides nucléiques à température ambiante. Échantillons fluorescents sont sensibles à la lumière et doit être conservé dans l&#39;ambre ou des tubes enveloppés aluminium. </li><li> Préparez assez 1x tampon TE pour toutes les normes et les échantillons à mesurer, ainsi que pour la solution PicoGreen travail qui sera nécessaire. Préparer un tampon 1xTE en diluant le tampon TE 20x fourni avec une eau sans nucléase par le protocole du fabricant. Volumes de réaction peut varier de 200 uL d&#39;aussi peu que 10 ul. Dans cet exemple, 10 volumes de réaction uL sera préparé. </li><li> Préparer dilués en série de normes ADNdb à 2x la concentration finale souhaitée sans nucléase flacons ou des tubes. Transférer 5 ul de chacune des normes ADNdb dilué dans un individu étiqueté sans nucléase ambre ou de papier d&#39;aluminium couverte tube. </li><li> Aliquote de 5 ul de chaque échantillon ADNdb d&#39;intérêt dans dûment étiquetés sans nucléase ambre ou de papier d&#39;aluminium recouvert tubes. </li><li> Préparer la solution PicoGreen de travail selon le protocole du fabricant. Transfert d&#39;un volume égal de la solution PicoGreen de travail dans chaque tube contenant soit une norme ou un échantillon d&#39;intérêt (5 uL dans cet exemple). </li><li> Combiner des volumes égaux de 1x tampon TE et PicoGreen solution de travail pour préparer le contrôle négatif, qui sert de solution de référence. </li><li> Mélanger le contenu de chaque tube de réaction à fond par pipetage doux et incuber les réactions à la température ambiante pendant 5 minutes. Toutes les normes et les échantillons doivent être équilibrées à la même température avant la mesure en tant que signal de fluorescence est affectée par la température. </li><li> Pour préparer l&#39;instrument et effectuer des mesures, d&#39;abord nettoyer les surfaces inférieure et supérieure du système de rétention de l&#39;échantillon. Pipeter 2 à 3 uL d&#39;eau déminéralisée sur la surface inférieure d&#39;optique, à proximité, puis ouvrez le bras de levier, et éponger les piédestaux supérieure et inférieure avec un chiffon propre, non pelucheux, essuyez laboratoire. Assurez-vous que les surfaces sont libres de charpie avant de procéder comme charpie peuvent présenter fluorescence en présence d&#39;une source d&#39;excitation et peut interférer avec la mesure. </li><li> Ouvrez le logiciel de l&#39;instrument, sélectionnez l&#39;option &quot;Nucleic Acids&quot; application, et sélectionnez l&#39;option &quot;PicoGreen-ADNdb&quot; option. </li><li> Pour l&#39;instrument vierge, ajouter 2 ul de TE 1x à la baisse piédestal, fermer le bras, et sélectionnez &quot;vierge&quot; dans le domaine logiciel de l&#39;instrument. Une fois vide est complet, éponger hors de la solution à blanc par les deux surfaces du système de rétention de l&#39;échantillon. </li><li> Mélanger la solution de référence par pipetage doux. En utilisant des pointes faible rétention, pipette 2 uL sur la partie inférieure piédestal et fermer le bras. </li><li> Sélectionnez &quot;référence&quot; dans le type de mesure, et de sélectionner les unités désirées. Cliquez sur &quot;Mesure&quot; pour lancer le cycle de mesure. </li><li> Lorsque le cycle de mesure est terminée, ouvrez le bras et à fond blot sur les surfaces de l&#39;échantillon de rétention du système. Mesure jusqu&#39;à cinq répétitions de la référence, en utilisant une aliquote fraîche pour chaque réplique. </li><li> Répétez le processus pour les normes supplémentaires pour construire une courbe standard. Jusqu&#39;à sept normes peuvent être utilisés. Le logiciel est conçu pour stocker jusqu&#39;à cinq répétitions pour chaque norme. Réplique des normes sont en moyenne de générer une courbe standard à partir de laquelle les concentrations de l&#39;échantillon sont déterminés automatiquement. </li><li> Une fois la courbe standard est complète, sélectionnez l&#39;option &quot;échantillons&quot; onglet, entrez les informations de l&#39;échantillon respectifs ID et de mesurer chaque échantillon inconnu. </li></ol>

<ol>
	<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity.">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li><li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Quantification+of+Nucleic+Acids:+LabelGuard+enables+photometric+quantification+of+submicroliter+samples+using+a+standard+photometer.">Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer.</a> Implen Applications Note. , (2006).</li><li>Jr, I. n. g. l. e., D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spectrochemical analysis. , XV-590 (1988).</li><li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA.">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li></ol>

Philippe Desjardins et Debra Conklin sont employés par des produits Thermo Scientific NanoDrop, Inc qui produit des instruments utilisés dans cet article.

Les protocoles de quantification présentées ici sont basées sur les systèmes les plus largement acceptées microvolume. Ces systèmes fournissent des solutions de rechange pratique pour méthode traditionnelle d&#39;acide nucléiques quantification, qui reposent sur des volumes d&#39;échantillon plus grande et l&#39;utilisation d&#39;appareils de confinement. NanoDrop microvolume technologie utilise un système de rétention d&#39;échantillon qui s&#39;appuie sur les propriétés de tension superficielle de l&#39;échantillon mesuré pour former une colonne liquide. Il est essentiel que l&#39;échantillon est en contact avec les surfaces supérieures et inférieures de mesure optique pour la formation de la colonne appropriée. Si à tout moment les résultats de mesure semblent inexactes ou non reproductibles, il est probablement le résultat de l&#39;hétérogénéité de l&#39;échantillon ou le bris de colonne liquide. Détergents et d&#39;alcool isopropylique ne sont pas recommandés agents de nettoyage, car ils peuvent incondition les surfaces de mesure piédestal. Un piédestal inconditionnée se produit lorsque les propriétés de surface hydrophobe du piédestal a été compromise, ce qui entraîne un aplatissement de la goutte d&#39;échantillon. Socles Inconditionné peut conduire à la rupture de la colonne de liquide pendant le mesurage. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Surface de la figure 3. Inconditionné est caractérisée par un aplatissement d&#39;une goutte d&#39;eau. Surfaces piédestal Uncondtioned peut être reconditionné en utilisant le composé piédestal NanoDrop reconditionnement (PR-1, Thermo Scientific Products NanoDrop). Une fine couche de composé reconditionnement est appliqué sur les surfaces supérieures et inférieures piédestal, on laisse sécher pendant environ 30 secondes, puis déteint l&#39;aide d&#39;un endroit propre, sec, non pelucheux laboratoire essuyer. Un état avec succès reconditionnés est caractérisée par une gouttelette d&#39;eau perlant place lorsqu&#39;il est appliqué à la surface piédestal bas. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Une surface reconditionnés est caractérisée par un perlage d&#39;une goutte d&#39;eau. Systèmes de quantification microvolume réduire considérablement la consommation de l&#39;échantillon et augmenter considérablement la gamme de concentration par rapport aux systèmes quantification plus traditionnels. Bien que la quantification microvolume est souvent devenu une technologie habilitante pour des circonstances impliquant la masse cellulaire limitée tels que biopsies à l&#39;aiguille et le laser capture microdissection, l&#39;efficacité et la facilité d&#39;utilisation de cette méthodologie a fait largement accepté alternative aux méthodes de quantification d&#39;acides nucléiques, même lorsque l&#39;échantillon est abondante.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NanoDrop 2000c</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>ND-2000C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop 3300</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>ND-3300</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

nanodrop microvolume quantitation of nucleic acids

Dosages biomoléculaire sont continuellement développés qui utilisent des quantités progressivement plus petites de matériel, souvent obstacle à l&#39;utilisation de la cuvette conventionnelle basée sur des instruments de quantification d&#39;acides nucléiques pour ceux qui peuvent effectuer une quantification microvolume. Le système de rétention NanoDrop microvolume échantillon (Produits Thermo Scientific NanoDrop) en combinant les fonctions technologie des fibres optiques et les propriétés naturelles tension de surface pour capturer et retenir des quantités infimes d&#39;échantillon indépendant de l&#39;appareil de confinement traditionnels tels que les cuvettes ou capillaires. Par ailleurs, le système utilise la longueur des trajets plus courts, ce qui résulte dans une large gamme de mesures de concentration d&#39;acide nucléiques, éliminant la nécessité d&#39;effectuer des dilutions. Réduire le volume d&#39;échantillon requis pour l&#39;analyse spectroscopique facilite également l&#39;inclusion d&#39;autres étapes de contrôle qualité tout au long de nombreux flux moléculaire, augmentant l&#39;efficacité et conduisant finalement à une plus grande confiance dans les résultats en aval. La nécessité d&#39;une haute sensibilité d&#39;analyse de fluorescence de masse limitée est également apparu avec les récentes avancées expérimentales. Utilisant la même technologie microvolume de rétention de l&#39;échantillon, les mesures de fluorescence peut être réalisée avec 2 pi de matériel, permettant des dosages fluorescents exigences de volume pour être sensiblement réduits. Ces microréactions de 10 uL ou moins sont désormais possibles en utilisant une fluorospectrometer dédié microvolume. Deux protocoles de quantification microvolume nucléiques acide sera démontré que l&#39;utilisation de systèmes intégrés de conservation de l&#39;échantillon comme des alternatives aux pratiques traditionnelles cuvette des protocoles. D&#39;abord, une méthode directe A260 d&#39;absorbance avec un spectrophotomètre microvolume est décrite. Elle est suivie par une démonstration d&#39;une méthode de fluorescence qui permet aux volumes réduits réactions de fluorescence avec un fluorospectrometer microvolume. Ces nouvelles techniques permettent l&#39;évaluation des concentrations d&#39;acides nucléiques allant de 1 pg / uL à 15.000 ng / uL avec une consommation minimale de l&#39;échantillon.

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NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

L&#39;utilisation de systèmes microvolume NanoDrop comme des alternatives concrètes et efficaces pour méthode traditionnelle d&#39;acide nucléiques quantification est décrite à travers la démonstration de deux protocoles de quantification microvolume nucléiques acides.

NanoDrop microvolume quantification des acides nucléiques

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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Vidéo: NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Détermination microvolume concentration de protéines en utilisant le spectrophotomètre NanoDrop 2000c

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Recherche

Biologie

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

La quantification de γH2AX Foci dans les échantillons de tissus

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Détermination de la concentration des acides nucléiques et des protéines en utilisant le micro-volume Bio-spec Spectrophotomètre Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

Electricité-libre, l&#39;acide nucléique et séquentielle isolement des protéines

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

D&#39;analyser et de structures d&#39;acides nucléiques avec 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, and participate in various signaling pathways. Caenorhabditis elegans synthesizes all of the enzymes necessary to produce a range of omega-6 and omega-3 fatty acids. This, combined with the simple anatomy and range of available genetic tools, make it an attractive model to study fatty acid function. In order to investigate the genetic pathways that mediate the physiological effects of dietary fatty acids, we have developed a method to supplement the C. elegans diet with unsaturated fatty acids. Supplementation is an effective means to alter the fatty acid composition of worms and can also be used to rescue defects in fatty acid-deficient mutants. Our method uses nematode growth medium agar (NGM) supplemented with fatty acidsodium salts. The fatty acids in the supplemented plates become incorporated into the membranes of the bacterial food source, which is then taken up by the C. elegans that feed on the supplemented bacteria. We also describe a gas chromatography protocol to monitor the changes in fatty acid composition that occur in supplemented worms. This is an efficient way to supplement the diets of both large and small populations of C. elegans, allowing for a range of applications for this method.

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a useful model to explore the functions of polyunsaturated fatty acids in development and physiology. This protocol describes an efficient method of supplementing the C. elegans diet with polyunsaturated fatty acids.

La supplémentation alimentaire en acides gras polyinsaturés dans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Étiquetage spécifique de la séquence des acides nucléiques et des protéines avec Methyltransferases et le cofacteur Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

La ligature très efficace de petites molécules d&#39;ARN pour microARN quantification par séquençage à haut débit

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

La quantification des cellules endothéliales adhésivité<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Lecture simple de vrac numériques acide nucléique quantification dosages

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...