ويتم تمويل هذا البحث من قبل لجنة نهر الميكونج والمنح BBSRC. نشكر أجاتا Zieba وPardalis كاترينا في مختبر أولف Landegren ، وجامعة أوبسالا عن المساعدة في إعداد وتقديم المشورة التقنية المفيدة. Olink Biosience للمساعدة التقنية والعرض.

1. طلي من الخلايا والمعاملة مع BMP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا Neuro2a في GMEM تستكمل مع FBS 10 ٪ ، 1X غير الأحماض الأمينية الأساسية (النعم) ، 1X البيروفات الصوديوم والجلوتامين L - 1X. انقسام الخلايا باستخدام التربسين (0.05 ٪ - EDTA) وصفيحة 15،000-20،000 الخلايا لكل بئر في شريحة 16 غرفة جيدا. ثقافة HEK293T أو خلايا Cos7 في DMEM تستكمل مع FBS 10 ٪ ، L - 1X الجلوتامين و1X البنسلين / الستبرتوميسين. تعقيم polysine الشرائح التي تخبط بها في الايثانول 70 ٪ واستخدام القلم Immedge التعادل 1 سم 2 الآبار. انقسام الخلايا باستخدام التربسين (0.05 ٪ - EDTA) وصفيحة 20،000-25،000 الخلايا لكل بئر في 50 ميكرولتر المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في ترطيب ، 5 ٪ CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة استبدال المتوسطة مع المصل الحرة GMEM (تستكمل مع 0.1 ٪ الزلال ، 1X النعم ، 1X البيروفات الصوديوم والجلوتامين L - 1X) لNeuro2a أو مع DMEM مجانا المصل (تستكمل مع الجلوتامين L - 1X والبنسلين / الستبرتوميسين) لHEK293T / Cos7 واحتضان خلايا لحاء 2-3 تبقي ثلاث آبار مع الخلايا في ظل ظروف طبيعية زراعة (أي 10 ٪ FBS) لاستخدام والضوابط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الخلايا مع dorsomorphin (مثبط للمسار BMP ، 2 ميكرومتر) أو BMP4 (25 نانوغرام / مل) للمرة المطلوب (مثلا ح 10 دقيقة - 1) 5. </li></ol> 2. التثبيت وPermeabilization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تثبيتي ، PFA 4 ٪. يزن 4 غراما من PFA لإعداد حل 4 ٪ في برنامج تلفزيوني 100 مل. الحل في الحارة 50 درجة مئوية حتى يصبح واضحا. مرشح الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. استخدام مثبت الطازجة (وليس تخزينها لأكثر من 2 أيام). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسط ​​من الآبار ، ويغسل مع 1xPBS. لا ماصة الحلول مباشرة على الخلايا لأن ذلك قد يؤدي إلى انفصال الخلايا. قبل الانتقال الى الخطوة التالية ، إذا كنت تستخدم شرائح غرفة إزالة الغرف ، ولكن ترك السيليكون حول الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر PFA 4 ٪ ، واحتضان ل10min ، على RT ، من دون الانفعالات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني لمدة 3 5 دقائق x في جرة Coplin مع التحريض على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الخلايا مع 0،5 ٪ تريتون X - 100 في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة دون التحريض على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع توين 0،05 ٪ في 20 TBS (TBS - T) لمدة 3 5 دقائق x في جرة Coplin مع التحريض على RT. </li></ol> 3. حظر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط قبالة TBS - T. إضافة قطرة واحدة من الحلول Duolink الحظر الثاني (1X) لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح في غرفة الرطوبة قبل ساخنة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. </li></ol> 4. الأجسام المضادة الأولية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط وتمييع aP-Smad1/5/8 (الأرنب النسائل المتعددة) في 1:100 ، وSmad4 (الماوس وحيدة النسيلة) في 1:100 في جسم Duolink مخفف الثاني (1X). أيضا بإعداد aP-Smad1/5/8 وحده ، Smad4 في تركيزات نفسه لاستخدامها في التحكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحنفية الحل الحظر من الشرائح. إزالة أكبر قدر ممكن حل حجب ، ولكن اتخاذ مزيد من الحذر على عدم السماح للخلايا الجافة قبل إضافة الأضداد. إضافة 40 ميكرولتر الحلول الضد إلى الآبار. في واحدة فقط مخفف جيدا إضافة إلى السيطرة على جسم سلبية إضافية. </li></ol> 5. تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع تحقيقين جيش التحرير الشعبى الصينى (Duolink الثاني المضادة للماوس والطرح الثاني Duolink المضادة للأرنب PLUS) 1:05 في جسم مخفف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحنفية الحل الأساسي الضد من الشرائح. تغسل الشرائح 2 إلى 5 مرات كل دقيقة مع Duolink 1X الاحتياطي اغسل ثانيا ألف في جرة Coplin مع التحريض على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحنفية الاحتياطي غسل من الشرائح وإضافة حل جيش التحرير الشعبى الصينى التحقيق (40 ميكرولتر / جيد). احتضان الشرائح في غرفة الرطوبة قبل ساخنة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. </li></ol> 6. رباط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة وربط الثاني Duolink الأسهم (5X) ، وتمييع 01:05 في المياه عالية النقاء والمزيج. عند حساب حجم المياه ، وتأخذ بعين الاعتبار حجم يغاز التي ستضاف في التخفيف النهائية ل01:40 قبل إضافة الخليط إلى الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحنفية الحل التحقيق جيش التحرير الشعبى الصينى من الشرائح. تغسل الشرائح في مخزن اغسل 1X A ل 2 إلى 5 مرات كل دقيقة في وعاء مع Coplin التحريض على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخراج يغاز من الفريزر باستخدام كتلة تجميد (-20 درجة مئوية). إضافة إلى الحل يغاز ربط (المعد في 6.1) في دوامة والتخفيف 01:40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحنفية الاحتياطي غسل من الشرائح وإضافة محلول الربط يغاز ، على كل جانب (40 ميكرولتر / جيد). احتضان الشرائح في غرفة الرطوبة قبل ساخنة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li></ol> 7. توسيع ملاحظة : الكواشف الحساسة للضوء. الحفاظ على الشرائح محمية من الضوء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع التضخيم الثاني Duolink الأسهم (5X) 01:05 في المياه عالية النقاء والمزيج. عند حساب حجم المياه تأخذ في الاعتبار حجم البلمرة التي ستضاف في التخفيف النهائي من 1:80 قبل إضافة الخليط إلى عشره الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحنفية الحل ربط - يغاز من الشرائح. تغسل الشرائح في مخزن اغسل 1X جواب مع 2 مرات عن 2 دقيقة في كل جرة Coplin مع التحريض على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخراج البلمرة من الفريزر باستخدام كتلة تجميد (-20 درجة مئوية). إضافة إلى الحل البلمرة التضخيم (المعد في 7.1) في تخفيف و1:80 الدوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحنفية الاحتياطي غسل من الشرائح وإضافة محلول البلمرة التضخيم ، إلى كل بئر (40 ميكرولتر / جيد). احتضان الشرائح في غرفة الرطوبة قبل ساخنة لمدة 100 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li></ol> 8. التحضير لتصوير ملاحظة : الكواشف الحساسة للضوء. الحفاظ على الشرائح محمية من الضوء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحنفية الحل التضخيم ، البلمرة من الشرائح ويغسل لمدة 2 مرة الثانية في كل 10min 1X Duolink B الاحتياطي اغسل في جرة Coplin مع التحريض على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع الشرائح في 0.1 X باء الاحتياطي اغسل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السيليكون من الشريحة 16 - جيدا تماما. إضافة ~ 40μl الثانية في Duolink تركيب متوسطة مع دابي على ساترة ومكان برفق على عينات من الضغط عليه قليلا بحيث لا توجد فقاعات الهواء تحت الغطاء زلة. الإصلاح وختم ساترة على الشريحة باستخدام طلاء الأظافر. انتظر على الأقل 15min قبل الشروع في التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل العينات باستخدام المجهر مبائر أو مضان. الحصول على الصور الرقمية. </li></ol> 9. الكمي ملاحظة : الكواشف الحساسة للضوء. الحفاظ على الشرائح محمية من الضوء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام Duolink ImageTool لحساب مؤشرات على الصور للحصول على قياس مستوى الإشارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقارنة القياسات وجعل الرسم البياني. </li></ol> 10. ممثل النتائج النتيجة من التجربة في جيش التحرير الشعبى الصينى الموضع يظهر بقع منفصلة كما الفلورسنت. موقع للإشارة يعتمد على بروتينات معينة دراستها. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/2631/2631fig1.jpg" /> الشكل 1. وفي الموضع على خلايا جيش التحرير الشعبى الصينى بعد Neuro2a BMP4 التحفيز. تم علاج الخلايا مع dorsomorphin ميكرومتر 2 (مثبط للمسار BMP) (A) أو 25 BMP4 نانوغرام / مل (B) لمدة 60 دقيقة أو تركت دون علاج (CE). استخدمت أجسام مضادة ضد P-Smad1/5/8 وSmad4 للكشف عن الأجسام المضادة النشطة في المجمعات وألف وباء وحدها aP-Smad1/5/8 الابتدائي (C) وحدها ، Smad4 (D) أو إغفال من جانب الأولية كانت تستخدم الأجسام المضادة (E) والضوابط. الزرقاء : دابي ؛ الأحمر : جيش التحرير الشعبى الصينى الإشارة. تم الحصول على الصور مع المجهر لايكا مبائر SP5. (F) احصيت إشارات جيش التحرير الشعبى الصينى مع برنامج ImageTool Duolink ويرد متوسط ​​عدد البقع في نواة كل خلية في الرسم البياني. (G) وترك الخلايا Neuro2a غير المعالجة أو المعالجة مع Dorsomorphin (2 ميكرون) أو BMP4 (25 نانوغرام / مل) لمدة 60 دقيقة. وlysed الخلايا والبروتينات تعرضوا لSDS - PAGE وتحليلها بواسطة immunoblotting مع aP-Smad1/5/8 وPCNA على النحو التحميل السيطرة. (*) غير محددة النطاق. لاحظ أن الأجسام المضادة aP-Smad1/5/8 لا يمكن التمييز بين مختلف البروتينات الموجودة في 3 معقدة مع Smad4.

<ol>
	<li>Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. o. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=morphogenetic+protein+receptors+and+signal+transduction.">morphogenetic protein receptors and signal transduction.</a> J Biochem. 147, 35-51 (2010).</li><li>Gustafsdottir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays+for+sensitive+and+specific+protein+analyses.">Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses.</a> Anal Biochem. 345, 2-9 (2005).</li><li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).</li><li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li><li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism.">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nat Chem Biol. 4, 33-41 (2008).</li><li>Baan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+proximity+ligation+detection+of+c-Jun/AP-1+dimers+reveals+increased+levels+of+c-Jun/Fra1+complexes+in+aggressive+breast+cancer+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo.">In situ proximity ligation detection of c-Jun/AP-1 dimers reveals increased levels of c-Jun/Fra1 complexes in aggressive breast cancer cell lines in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 1982-1990 .</li><li>Massinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interaction+of+DYX1C1+with+estrogen+receptors+suggests+involvement+of+hormonal+pathways+in+dyslexia.">Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia.</a> Hum Mol Genet. 18, 2802-2812 (2009).</li><li>Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+interactions+between+liver+X+receptor/retinoid+X+receptor+and+Sp1+modulate+the+transcriptional+induction+of+the+human+ATP+binding+cassette+transporter+A1+gene+by+oxysterols+and+retinoids.">Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids.</a> Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).</li></ol>

وقد رعت إنتاج هذه المادة عن طريق الفيديو OLINK الذي يجعل كاشف المستخدمة في الفحص الداخلي ربط القرب.

التصور المجمعات البروتين في الموقع هي في الطلب الكبير ، ولا سيما بالنسبة للدراسات في إشارة حيث التفاعل وتعديل البروتين البروتين هي الوسائل التي تستعملها الخلايا لارسال اشارة من سطحها إلى النواة. لم يكن من الممكن تصور وتحديد المجمعات بين اثنين من البروتينات الذاتية في الموقع مع المناعي من قبل. شارك في معارض توطين الأضداد القرار المنخفضة والتي لا يمكن استخدامها لتصور تفاعل حقيقي. جيش التحرير الشعبى الصينى هو الاسلوب الجديد الذي بدأت به الباحثون في نظم مختلفة مع النجاح الكبير 6 ، 7. هنا ، ونحن لشرح كيفية استخدام جيش التحرير الشعبي الصيني ، ليس فقط لتصور ولكن أيضا لتحديد المجمعات المحلية بين المستجيبات صماد تنشيط المصب من التحفيز BMP مع مرور الوقت. استخدمنا خلايا الأنسجة المختلفة بما في ذلك Neuro2a وتعتمد على الأجسام المضادة التي أثيرت في الأنواع التجارية المختلفة (الماوس ، والأرانب Smad4 aP-Smad1/5/8) لتحقيق هذا (الشكل 1). هذا الأسلوب يسمح لنا ، لأول مرة ، لمعرفة تفعيل المجمعات المستجيب - BMP مع مرور الوقت وليس فقط وجود Smad1/5/8 فسفرته ، والتي قد لا تكون في جميع المجمعات نشطة مع Smad4. أحصينا الاشارات (التين 1F) ومقارنة مع قياس الكمي التي تم الحصول عليها من طخة مناعية من نفس الخلايا 8 (الشكل 1G). استنتجنا أن عدد البقع توفر دقة القياس المقارن للإشارات المستويات مع مرور الوقت. كما تم تطبيق هذه التقنية على خطوط الخلايا الأخرى (HEK293T وCos7) مع نتائج مماثلة (لا تظهر البيانات). ويستند مبدأ التكنولوجيا على تحقيقين فريدة من نوعها تقدم مع عدة Duolink. كل مسبار جيش التحرير الشعبى الصينى يتكون من الأجسام المضادة الثانوية الملحقة قليل النوكليوتيد الاصطناعية فريدة من نوعها ، التي تعمل كمراسلة. على مقربة من التحقيقات يسمح ربط الحمض النووي في المكان المحدد حيث تعلق هذه التحقيقات في القرب. المسافة من [أليغنوكليوتيد] ، والذي يسمح التهجين الحمض النووي وربط صغيرة (&lt;40nm) ، وبالتالي ، لا يمكن إلا أن تتفاعل البروتينات تتيح ربط. ويمكن بعد ذلك أن الحمض النووي ligated تضخيمها والكشف عن تهجين مع المسمى [أليغنوكليوتيد] تسلسل تضخيمها. والتضخيم غير محددة لأنها تعتمد على مبادئ تهجين الحمض النووي DNA ، ويوفر أيضا حساسية عالية كما هو تضخيم الحمض النووي ligated عدة أضعاف مما أدى إلى تعزيز ربط الحدث الأولي. يتم الكشف عن الحمض النووي التي تضخمت التهجين مع [أليغنوكليوتيد] وصفت وتنتج بقعة واضحة وكبيرة نوعا ما. كما يمكن أن تحسب النقاط ، إشارة جيش التحرير الشعبى الصينى يوفر ليس فقط على المعلومات المكانية الدقيقة (موقع أحداث التفاعل) ، ولكن أيضا وسيلة قياس الهدف من هذه الأحداث 2-4. غيرها من التقنيات التي تستخدم للكشف عن البروتين التفاعلات منها العيش المشترك ، مناعي ، immunofluoresence ونيون نقل الطاقة الرنين (الحنق). وتستخدم على نطاق واسع شارك في مناعي المقايسات تمكين عزل بروتين المجمعات. ويرافق الطريقة التي immunoblotting مما يعني أنه يجب أن يتم التعبير عن البروتينات عند مستويات مرتفعة نسبيا ليتم الكشف. مشاكل خلفية عالية أو غير محددة وملزمة لبعض البروتينات لحبات في بعض الأحيان من الصعب التغلب عليها في مناعي المشترك. بالإضافة إلى ذلك ، شارك في مناعي المقايسات السماح للكشف عن البروتينات التي يمكن أن تكون جزءا من بروتين معقد ولكن لا يمكن التمييز بين تلك التي هي على مقربة جدا جسديا التفاعل مع بعضها البعض. وعلاوة على ذلك ، يمكن أن تشارك في immunoprecipitations لا توفر الكميات في قرار خلية واحدة أو معلومات عن توطين المجمعات البروتين في الخلية. ويستند الكشف التعايش مجمعات البروتين في الخلية أو حجرة خلية immunofluoresence على التداخل في إشارات تنتشر وبالتالي ، فإن القرار المكانية منخفضة ، ولا يمكن توفير معلومات دقيقة عن التفاعلات البروتينية. ويمكن أن يتم التحديد الكمي للإشارة immunofluoresence البصرية عن طريق تقدير إلا إذا كان الفرق هو أضعاف عدة ، ويمكن أن لا تكون دقيقة أو قابلة للقياس مثل البقع جيش التحرير الشعبى الصينى. الحنق يسمح التصور من المجمعات البروتين في الخلايا الحية ويتغلب على الحاجة إلى الأضداد ، وتعرض للحاتمة. لكن الحنق يعتمد عادة على overexpression من البروتينات تنصهر الاصطناعية ، والتي قد لا تعكس مجمعات البروتين الذاتية كما في جيش التحرير الشعبى الصينى. شروط حظر في بروتوكول جيش التحرير الشعبى الصينى حاسمة بأنها تجميع الأجسام المضادة وزيادة قد تحدث في الخلفية. ويمكن الاطلاع على شروط بديلة تسد في ورقة المنتج الأضداد. ضوابط ملائمة مع إغفال الضد الابتدائية والثانوية تقديم معلومات بشأن ما قد حصل من خطأ وأنها بحاجة إلى أن تدرج دائما. من المهم أن الشاشة الأضداد المختلفة التي من شأنها أن تعطي خلفية الأقل عندما تستخدم وحدها ، وأفضل إشارة عندما يكونان معا. التثبيت من سلأمر بالغ الأهمية ليرة سورية مع الافراط في تحديد المجمعات قد يسبب البروتين لتفسد تماما وتتحلل ، في حين أن التثبيت غير كاف قد يؤدي إلى فقدان البروتين المجمعات خلال خطوات الإجراء. يمكن التحكم بذلك عن طريق تخفيض تركيز تثبيتي إلى 3 ٪ أو عن طريق الحد من الوقت التثبيت. ومع ذلك ، فإن تثبيت يعتمد أيضا على ما إذا كانت الأجسام المضادة الأولية الاعتراف البروتينات المعطل أم لا. وهذا الاسلوب هو جيش التحرير الشعبى الصينى حساسة للغاية ، وهناك حاجة إلى رعاية خاصة للحفاظ على حضانة الأوقات والظروف الدقيقة المساواة بين عينات مختلفة. لا ينبغي أن تكون العينات تترك لتجف في أي حال قبل الخطوة النهائية. يمكن تجفيف العينات يؤدي إلى زيادة الخلفية. الإزالة الكاملة للعرقلة الحل أمر بالغ الأهمية أيضا من أجل تجنب الخلفية. يجب دائما غسل المخازن أن يقدموا إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام ، ودرجة حرارة منخفضة يبطئ التفاعلات الأنزيمية. لاستكشاف مزيد من الرجوع إلى دليل لكيت. ومن المفيد استخدام بقع للتأكد من الترجمة شبه الخلوية للإشارة جيش التحرير الشعبى الصينى (مثل دابي ، أكتين الخ). هنا استخدمنا دابي (في المتوسط ​​التركيب) لصمة النوى. جيش التحرير الشعبى الصينى متوافق مع استخدام المناعي مع أجسام مضادة لتحديد نوع الخلية أو مقصورة الخلوية (لا يظهر هنا). ويمكن أن يتم تقدير دقيق عن طريق عد الإشارات ، واستخدام برامج معينة (Duolink أداة الصور ، Olink Biosience). في الختام لقد أثبتنا في كيفية استخدام الموقع جيش التحرير الشعبى الصينى ، وذلك باستخدام عدة للكشف عن Duolink BMP يشير في الخلايا الثابتة وقدم مزاياه : سهل الاستخدام ، وحساسة للغاية ، الخلفية لا ، وقدرة فريدة لتحديد BMP نشط يشير في الموقع. الحد من تطبيق هذه التقنية لدراسة التفاعلات بين البروتينات المختلفة يعتمد على مدى توافر ونوعية الأجسام المضادة الأولية التي تعترف البروتينات قيد التحقيق.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>GMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21710025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21063029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AutogenBioclear</td>
<td>7.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11149068</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Pyruvate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11360070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin / Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25300-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>16-well chamber slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lab-Tek</td>
<td>178599</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polysine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0138</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>a-pSmad1/5/8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling</td>
<td>9511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>a-Smad4 (B8) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
<td>sc-7966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dorsomorphin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>171260-10MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Recombinant Mouse BMP-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D</td>
<td>5020-BP-010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton-X 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>H5151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Detection Reagents (Orange)</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OLINK</td>
<td>92007-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>92004-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>92002-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Mounting Medium with DAPI</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>82040-0005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Wash Buffers Fluorescence</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>82049</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using in situ pla, a proximity ligation assay

أفضل الممارسات الإدارية هي المسؤولة عن طائفة واسعة من الآثار التنموية والبيولوجية. تنشيط مستقبلات BMP (phosphorylate) والمستجيبات Smad1/5/8 ، التي بعد ذلك ، شكل مجمع ونقل من مكان لآخر مع Smad4 إلى النواة حيث تعمل بوصفها عوامل النسخ لبدء الآثار BMP المصب محددة 1. المناعية التقليدية مضان التقنيات مع أجسام مضادة ضد الفوسفات وصماد الببتيدات يحمل حساسية منخفضة ، وتقديم خلفية عالية الكمي الإجمالي لأنها تعتمد على كثافة إشارة الضد لا سيما إذا كان هذا هو حساس الفلورسنت. بالإضافة إلى ذلك ، قد الفوسفات وSmads لا تكون كلها في مجمع مع Smad4 وشارك في النسخ النشطة. جيش التحرير الشعبى الصينى في الموقع هي تكنولوجيا قادرة على اكتشاف بروتين تفاعلات مع خصوصية عالية وحساسية 2-4. هذه الأجسام المضادة الجديدة الأزواج الاعتراف التكنولوجيا مع التضخيم من الحمض النووي بديل للبروتين. فإنه يولد المترجمة ، إشارة منفصلة على شكل بقع الكشف عن الموضع الدقيق للحدث الاعتراف. ويمكن الاعتماد على عدد من الإشارات ومقارنتها توفير القياس. طبقنا في جيش التحرير الشعبى الصينى الموضع ، وذلك باستخدام عدة Duolink ، مع مجموعة من الأجسام المضادة التي تتيح الكشف عن المستجيبات يشير BMP phospho-Smad1/5/8 وSmad4 فقط عند هؤلاء في أي القرب في مجمع ، والذي يحدث فقط مع إشارات التنشيط. هذا يسمح للمرة الأولى ، تصور وقياس BMP الذاتية يشير مع خصوصية عالية وحساسية في زمن التجربة بالطبع تحت BMP4 التحفيز.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

هنا نبين كيفية استخدام القرب ربط الفحص (PLA) ، مع مجموعة من الأجسام المضادة لبروتين العظام تصور التخلق (BMP) يشير في خلايا محددة. سمحت لنا هذه التقنية لمتابعة تراكم النووية الذاتية BMP - المستجيب تنشيط المجمعات وتحديد مستوياتها على مر الزمن تحت BMP4 التحفيز.

كشف اشارة المستجيب - مجمعات التكرير والتسويق لاستخدام BMP4 في الموقع جيش التحرير الشعبى الصينى ، وربط الفحص القرب

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

detection-signaling-effector-complexes-downstream-bmp4-using-situ-pla

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

31.6K Views.  Imperial College, Hammersmith Hospital. هنا نبين كيفية استخدام القرب ربط الفحص (PLA) ، مع مجموعة من الأجسام المضادة لبروتين العظام تصور التخلق (BMP) يشير في خلايا محددة. سمحت لنا هذه التقنية لمتابعة تراكم النووية الذاتية BMP - المستجيب تنشيط المجمعات وتحديد مستوياتها على مر الزمن تحت BMP4 التحفيز.

Video: Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

متجانسة الكشف السريع عن طريق فحوصات البيولوجي المغناطيسي نظام Biosensing التحوير

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics: الكشف عن التغيرات العددية والهيكلية في جميع الكروموسومات 24 الإنسان وقت واحد باستخدام رواية الفحص FISH OctoChrome

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي بواسطة الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

قياس معدل الأيض في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; باستخدام قياس التنفس

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

كشف وتحليل الحمض النووي من التلف في العضلات الهيكلية ماوس<em&gt; في الموقع</em&gt; استخدام أسلوب TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

بروتوكول لLentiviral تنبيغ وتحليل المصب من المعوية Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

الكشف عن أهداف ميرنا في إنتاجية عالية باستخدام الفحص 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Here, we describe a procedure to visualize and quantify with high sensitivity the endogenous interactions between the endoplasmic reticulum and mitochondria in fixed cells. The protocol features an optimized in situ proximity ligation assay targeting the inositol 1,4,5-triphosphate receptor/glucose-regulated protein 75/voltage-dependent anion channel/cyclophilin D complex at the mitochondria-associated membrane interface.

دراسة اندوبلازمية شبكية والميتوكوندريا التفاعلات التي كتبها<em&gt; في الموقع</em&gt; القرب من ربط الفحص في خلايا ثابتة

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires careful and in-depth analyses and quantification to capture as much information about the underlying events as possible. Spatial, temporal and intensity parameters intrinsic to Ca2+ signals such as frequency, duration, propagation, velocity and amplitude may provide some biological information required for intracellular signalling. High-resolution Ca2+ imaging typically results in the acquisition of large data files that are time consuming to process in terms of translating the imaging information into quantifiable data, and this process can be susceptible to human error and bias. Analysis of Ca2+ signals from cells in situ typically relies on simple intensity measurements from arbitrarily selected regions of interest (ROI) within a field of view (FOV). This approach ignores much of the important signaling information contained in the FOV. Thus, in order to maximize recovery of information from such high-resolution recordings obtained with Ca2+dyes or optogenetic Ca2+ imaging, appropriate spatial and temporal analysis of the Ca2+ signals is required. The protocols outlined in this paper will describe how a high volume of data can be obtained from Ca2+ imaging recordings to facilitate more complete analysis and quantification of Ca2+ signals recorded from cells using a combination of spatiotemporal map (STM)-based analysis and particle-based analysis. The protocols also describe how different patterns of Ca2+ signaling observed in different cell populations in situ can be analyzed appropriately. For illustration, the method will examine Ca2+ signaling in a specialized population of cells in the small intestine, interstitial cells of Cajal (ICC), using GECIs.

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) have radically changed how in situ Ca2+ imaging is performed. To maximize data recovery from such recordings, appropriate analysis of Ca2+ signals is required. The protocols in this paper facilitate the quantification of Ca2+ signals recorded in situ using spatiotemporal mapping and particle-based analysis.

تطبيقات رسم الخرائط الزمانية وتقنيات تحليل الجسيمات للتحديد الكمي لداخل الخلية Ca2 + إشارات في الموقع

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female Anopheles mosquitoes are transmitted to humans via mosquito bites during blood feeding. The presence of sporozoites in the mosquito salivary glands thus defines mosquito infectiousness. To determine whether an Anopheles mosquito carries Plasmodium sporozoites, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method has been the standard tool to detect the Plasmodium circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of the sporozoites. In this method, the head along with the thorax of each mosquito is separated from the abdomen, homogenized, and subjected to a sandwich ELISA to detect the presence of CSP specific to Plasmodium falciparum and each of the two subtypes, VK210 and VK247, of Plasmodium vivax.This method has been used to study malaria transmission, including the seasonal dynamics of mosquito infection and the species of the major malaria vectors in the study sites.

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

This protocol describes a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect salivary gland sporozoites in mosquitoes. Using easily available monoclonal antibodies, the method enables cost-effective, high-throughput detection of mosquitoes carrying Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax. The method is suitable for malaria transmission research, including vector surveys.