この研究は、MRCとBBSRCの助成金によって運営されている。我々は技術と有用な助言を設定すると助けるために、ウルフLandegrenの研究室でウプサラ大学の阿形ZiebaとカテリーナPardalisに感謝。技術的なヘルプとプレゼンテーションのためのBiosienceをOlink。

1。細胞のプレーティングとBMPによる治療<ol><li> GMEMの文化Neuro2a細胞は10％FBSを添加した、1 ×非必須アミノ酸（NEAM）、1Xピルビン酸ナトリウムとL -グルタミン1X。トリプシン（0.05％- EDTA）とプレート16ウェルチャンバースライドにウェル当たり15.000から20.000までの細胞を用いて細胞を分割する。 文化HEK293Tまたは10％FBS、1X L -グルタミンおよび1xペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMでCOS7細胞。 70％エタノールでそれらを浸漬し、1cm 2の井戸を描くImmedgeのペンを使用してpolysineスライドを滅菌する。 50μlの培地でトリプシン（0.05％- EDTA）とプレートウェルあたり20.000から25.000の細胞を用いて細胞を分割する。 </li><li> 37細胞をインキュベートします加湿、5％CO 2インキュベーターでC。 </li><li> 24時間後には、Neuro2aのための無血清GMEM（アルブミン0.1％、1 × NEAM、1Xピルビン酸ナトリウムおよび1x L -グルタミンを添加した）、またはHEK293Tための無血清DMEM（L -グルタミンおよび1xペニシリン/ストレプトマイシンを補充）で培地を交換してください/ COS7と2〜3時間細胞をインキュベートコントロールとして使用するために、通常の培養条件下で細胞（すなわち、10％FBS）で3つのウエルに保管してください。 </li><li>希望の時間のためのdorsomorphin（BMP経路の阻害剤、2μM）またはBMP4（25 ng / ml）を持つセル（10分1時間など）5を扱います。 </li></ol> 2。固定と透過処理<ol><li>固定、4％PFAを準備します。 100ミリリットルPBS中4％溶液を調製するPFAの4gを秤量する。 50で解決策を温める·それがクリアされているCまで。使用するまで4℃で0.22μmフィルターとストア° Cを介してソリューションをフィルタリングします。 （2日以上保管されていない）新鮮な固定剤を使用してください。 </li><li>井戸から培地を吸引除去し、1xPBSで洗浄する。これは、細胞の剥離に繋がる可能性があるので、細胞に直接ソリューションをピペッティングしないでください。チャンバースライドが使用されている場合、次のステップに進む前に、チャンバーを取り外しますが、井戸の周囲にシリコンを残す。 </li><li>攪拌することなく、室温で、10分間50μlを4％PFAとインキュベートする。 </li><li>室温で攪拌しながらコプリンジャーに3 × 5分間PBSで細胞を洗浄する。 </li><li> 0,5％トリトンPBSでX - 100を10分間室温で攪拌することなく細胞を扱う。 </li><li>室温で攪拌しながらコプリンジャーに3 × 5分間TBSに0.05％のTween 20（TBS - T）で細胞を洗浄する。 </li></ol> 3。ブロッキング<ol><li> TBS - Tをオフにタップします。ウェルあたりDuolink IIブロッキング溶液（1X）の一滴を追加。 </li><li> 37℃で1時間予備加熱湿度チャンバ内のスライドをインキュベート℃に</li></ol> 4。一次抗体<ol><li> 1:100でaP-Smad1/5/8（ウサギポリクローナル）およびDuolink IIの抗体希釈液で1:100（1 ×）で、であるSmad4を（マウスモノクローナル）混和し希釈する。コントロールに使用される同じ濃度でもaP-Smad1/5/8と単独で、であるSmad4を準備します。 </li><li>スライドからのブロッキング溶液をオフにタップします。できる限り多くのブロッキング溶液を除去しますが、抗体を加える前に細胞が乾燥させないよう細心の注意を払って。ウェルに抗体溶液40μlを添加する。つでも追加のネガティブコントロールとしてのみ抗体希釈液を加える。 </li></ol> 5。 PLAプローブ<ol><li>抗体希釈液で2つのPLAプローブ（Duolink II抗マウスMINUSとDuolink II抗ウサギPLUS）1:5に希釈する。 </li><li>スライドからの一次抗体溶液をオフにタップします。 5分× 1 Duolink IIでそれぞれ室温で攪拌しながらコプリンジャーに洗浄バッファーをスライドを2回洗浄する。 </li><li>スライドから洗浄バッファーをオフにタップして、PLAプローブ溶液（40μl/ウェル）を追加します。 37℃で1時間予備加熱湿度チャンバ内のスライドをインキュベート℃に</li></ol> 6。ライゲーション<ol><li>渦Duolink IIのライゲーションの株式（5倍）と高純度の水と混合で1:5に希釈する。水の体積を計算する場合、考慮にちょうど井戸のミックスの添加前1:40の最終希釈で追加されるリガーゼのボリュームを取る。 </li><li>スライドからのPLAのプローブ溶液をオフにタップします。 1 ×洗浄バッファーでスライドを室温で攪拌しながらコプリンジャーに2回、5分ごとに洗浄する。 </li><li>凍結ブロック（-20℃）を使用してフリーザーからリガーゼを取り出してください。 1時40分希釈と渦におけるライゲーション溶液（6.1で調製）にリガーゼを追加。 </li><li>スライドから洗浄バッファーをオフにタップして、各ウェルにライゲーション-リガーゼの溶液（40μl/ウェル）を追加します。 37℃で30分間予備加熱湿度チャンバ内のスライドをインキュベート℃に</li></ol> 7。増幅注：ライトセンシティブ試薬。遮光してスライドしてください。 <ol><li>高純度の水とミックスでDuolink II増幅株式（5x）を1:5に希釈する。水の体積を計算するとき考慮にちょうど目にミックスの添加前1:80の最終希釈で追加されるポリメラーゼの量を取る電子井戸。 </li><li>スライドからライゲーション-リガーゼのソリューションをオフにタップします。室温で攪拌しながらコプリンジャーに2回2分間ずつで1 ×洗浄バッファーでスライドを洗浄します。 </li><li>凍結ブロック（-20℃）を使用してフリーザーからポリメラーゼを取り出してください。 1:80希釈し、ボルテックスで増幅液（7.1で調製）にポリメラーゼを追加。 </li><li>スライドから洗浄バッファーをオフにタップして、各ウェルに増幅 - ポリメラーゼの溶液（40μl/ウェル）を追加します。 37℃で100分間予備加熱湿度チャンバ内のスライドをインキュベート℃に</li></ol> 8。イメージングのための準備注：ライトセンシティブ試薬。遮光してスライドしてください。 <ol><li>スライドから増幅 - ポリメラーゼのソリューションをオフ]をタップし、室温で攪拌しながらコプリンジャーに1X Duolink IIウォッシュバッファーBでそれぞれ2回10分間洗浄する。 </li><li> 0.1 × Wash BufferをBにスライドを浸し</li><li>完全に16ウェルスライドからシリコーンを削除します。カバースリップ上DAPIでミディアムを取り付けDuolink IIの〜40μlのを加え、穏やかにわずかにカバースリップの下に気泡がないこと、それを押すとサンプルの上に置きます。マニキュアを使用してスライド上にカバースリップを修正し、シールします。イメージングに進む前に、少なくとも15分間待ちます。 </li><li>共焦点または蛍光顕微鏡でサンプルを分析する。デジタル画像を取得します。 </li></ol> 9。定量化注：ライトセンシティブ試薬。遮光してスライドしてください。 <ol><li>信号レベルの測定値を得るために画像信号をカウントするDuolink imagetoolを使用してください。 </li><li>測定値を比較し、グラフを作る。 </li></ol> 10。代表的な結果 その場 PLAの実験での結果は離散蛍光スポットとして表示されます。信号の場所は調査特定のタンパク質に依存します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/2631/2631fig1.jpg" /> 図1 その場 PLA において BMP4刺激後のNeuro2a細胞で。細胞は60分または（CE）放置しておくために2μMdorsomorphin（BMP経路の阻害剤）（）または25 ng / mlのBMP4（B）で処理した。 P-Smad1/5/8とであるSmad4に対する抗体は、AとBの一次抗体単独でaP-Smad1/5/8（C）と - であるSmad4アローン（D）または一次の不作為に積極的に複合体を検出するために使用された抗体（E）をコントロールとして使用した。青：DAPI、赤：PLA信号。写真は、ライカSP5共焦点顕微鏡で得られた。 （F）PLA信号がDuolink imagetoolでソフトウェアを用いて計数し、細胞あたりの核のスポットの平均数をグラフで表示されます。 （G）Neuro2a細胞は未処理のままかDorsomorphin（2μM）または60分間BMP4（25 ng / ml）を処理した。細胞を溶解し、タンパク質をSDS - PAGEに供し、コントロールを読み込むとaP-Smad1/5/8と、PCNAを用いたイムノブロッティングにより分析した。 （*）非特異的バンド。 aP-Smad1/5/8抗体であるSmad4と複合体中に存在3種類のタンパク質を区別できないことに注意してください。

<ol>
	<li>Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. o. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=morphogenetic+protein+receptors+and+signal+transduction.">morphogenetic protein receptors and signal transduction.</a> J Biochem. 147, 35-51 (2010).</li><li>Gustafsdottir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays+for+sensitive+and+specific+protein+analyses.">Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses.</a> Anal Biochem. 345, 2-9 (2005).</li><li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).</li><li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li><li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism.">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nat Chem Biol. 4, 33-41 (2008).</li><li>Baan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+proximity+ligation+detection+of+c-Jun/AP-1+dimers+reveals+increased+levels+of+c-Jun/Fra1+complexes+in+aggressive+breast+cancer+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo.">In situ proximity ligation detection of c-Jun/AP-1 dimers reveals increased levels of c-Jun/Fra1 complexes in aggressive breast cancer cell lines in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 1982-1990 .</li><li>Massinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interaction+of+DYX1C1+with+estrogen+receptors+suggests+involvement+of+hormonal+pathways+in+dyslexia.">Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia.</a> Hum Mol Genet. 18, 2802-2812 (2009).</li><li>Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+interactions+between+liver+X+receptor/retinoid+X+receptor+and+Sp1+modulate+the+transcriptional+induction+of+the+human+ATP+binding+cassette+transporter+A1+gene+by+oxysterols+and+retinoids.">Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids.</a> Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).</li></ol>

このビデオ記事の生産は、近接ライゲーションアッセイの手順で使用される試薬を作るOLINKが後援した。

その場でのタンパク質複合体の可視化は、特に蛋白質の相互作用とタンパク質修飾は、細胞がその表面から核へシグナルを送るために使用することを意味している場所シグナリングにおける研究のために、大きな需要があります。それは前に免疫蛍光を用いたin situ の 2つの内在性タンパク質との間の複合体を可視化し定量化することは不可能であった。抗体の共局在は、低解像度を示し、真の相互作用を可視化するために使用することはできません。 PLAは、研究者は大成功6、7と異なるシステムでの使用を開始した新しい技術です。ここでは、PLAを使用するだけでなく、視覚化するだけでなく、時間をかけてBMPの刺激の下流で活性化Smadであるエフェクターの間に内在性の複合体を定量化する方法を示します。我々は、Neuro2aとこの（図1）を達成するために別の種（マウスA -であるSmad4とウサギaP-Smad1/5/8）で提起された商業抗体に依存していたなどの異なる組織培養細胞を使用していました。このメソッドは、すべてであるSmad4とのアクティブな複合体に従事されていない可能性がありますリン酸化Smad1/5/8の単なる存在ではなく、時間をかけてBMPエフェクター複合体の活性化を参照して、初めての、私達を許可。我々は、信号をカウントし（図1F）と同じセル8（図1G）の免疫から得られる定量化と測定比較した。私たちは、スポットの数は時間をかけて信号レベルの正確な比較測定を提供すると結論した。技術はまた、同様の結果と他の細胞株（HEK293TとCOS7）（データは示さず）に適用されました。 技術の原理は、Duolinkキットで提供されている2つのユニークなプローブに基づいています。各PLAのプローブは、レポーターとして機能するユニークな合成オリゴヌクレオチド、に接続された二次抗体で構成されています。プローブの近接は、これらのプローブが近接して接続されている正確な位置でDNAライゲーションすることができます。 DNAハイブリダイゼーションおよびライゲーションが小さく（&lt;40nmプロセス）、そのためであることができるオリゴヌクレオチド、の距離、相互作用するタンパク質だけがライゲーションを許可することができます。連結したDNAを増幅し、増幅された配列の標識されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって検出することができる。増幅は、DNA - DNAハイブリダイゼーションの原理に依存するように特有のものであり、連結したDNAは、初期のライゲーションのイベントの強化、その結果いくつかの倍に増幅されるとしても高感度を提供します。増幅されたDNAは、標識されたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって検出し、目に見えるとかなり大きなスポットを生成しています。スポットをカウントできるように、PLAの信号だけでなく、正確な空間情報（相互作用のイベントの位置）だけでなく、2月4日 、これらのイベントを定量化する客観的な方法を提供します。 タンパク質相互作用の検出のために雇用されている他の技術は共免疫沈降法、immunofluoresenceと蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を含める。共免疫沈降アッセイは、広くタンパク質複合体の分離を可能にするために使用されます。方法は、タンパク質が検出されるために比較的高いレベルで発現されなければならないことを意味する免疫ブロッティングを伴っている。高いバックグラウンドやビーズにいくつかのタンパク質の非特異的結合の問題は時々共免疫沈降法で克服することは困難です。さらに、共免疫沈降アッセイは、タンパク質複合体の一部にすることができますが、互いに物理的に相互作用が非常に近接しているものを区別することができないタンパク質の検出を可能にする。さらに、共同免疫沈降法は、細胞内のタンパク質複合体の局在上の単一のセルの解像度や情報の定量を提供することはできません。 immunofluoresenceでセルまたはセルコンパートメント内のタンパク質複合体の共存の検出は、拡散信号とそのための重複に基づいて、低空間分解能を持ち、タンパク質の相互作用について正確​​な情報を提供することはできません。差は数倍であり、かつ正確またはPLAのスポットとして測定することができない場合にのみ、immunofluoresence信号の定量化は、視覚的に推定することによって行うことができます。 FRETは、生きた細胞内のタンパク質複合体の可視化を可能にし、抗体の必要性とエピトープの露出を克服。しかし、FRETは、通常、PLAのような内因性のタンパク質複合体を反映していない可能性があります人工的な融合タンパク質の過剰発現に依存する。 PLAプロトコルのブロッキング状態は、抗体の凝集が発生するとバックグラウンドを増加させる可能性があるので重要です。代替、ブロッキング条件が抗体の製品シートに記載されています。一次および二次抗体の省略と適切なコントロールが間違っているかもしれないものについての情報を提供し、彼らは常に含める必要があります。彼らは一緒にいるとき、それらを単独で使用され、少なくとも背景と最高のシグナルを与える別の抗体をスクリーニングすることが重要です。セルの固定不十分な固定は、手順のステップ中に、タンパク質複合体の損失につながる可能性があります一方、過固定では、タンパク質複合体が完全に変性し、低下させる可能性があるため、lsは重要です。これを3％に固定液の濃度を低下させることによってまたは固定の時間を制限することによって制御することができます。しかし、固定では一次抗体は変性したタンパク質を認識するかどうかによっても異なります。 PLA法は非常に敏感なので、特別な注意はインキュベーション時間と異なるサンプル間で等しいマイクロ条件を維持するために必要です。 サンプルは、最後のステップの前にどのような場合で乾燥させるままにしないでください。サンプルの乾燥は、増加の背景につながることができます。ブロッキング溶液の完全な除去にも背景を回避するために重要です。低温では酵素反応を遅くするように洗浄バッファーは、常に、使用前に室温に戻してください。さらにトラブルシューティングを行うにはキットのマニュアルを参照してください。 それは、PLAの信号（例えばDAPI、アクチンなど）のサブ細胞内局在を確認するために汚れを使用すると便利です。ここでは、核を染色するためにDAPIを（封入剤で）使用している。 PLAは、細胞型または細胞区画（ここでは図示せず）を決定する抗体で免疫蛍光の使用と互換性があります。正確な定量化は、信号と特定のソフトウェア（Duolinkのイメージツール、Olink Biosience）の使用を数えることにより行うことができます。 結論として、我々は固定された細胞でのBMPシグナル伝達を検出するためにDuolinkキットを使用して、 その場 PLA で使用する方法を実証し、その利点提示している：高感度で使いやすい、、無背景、そしてその場でアクティブなBMPのシグナル伝達を定量化するユニークな能力を。 異なるタンパク質間相互作用を研究するためにこの手法を適用の制限は、調査中のタンパク質を認識する一次抗体の可用性と品質に依存します。

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>GMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21710025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21063029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AutogenBioclear</td>
<td>7.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11149068</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Pyruvate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11360070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin / Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25300-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>16-well chamber slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lab-Tek</td>
<td>178599</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polysine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0138</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>a-pSmad1/5/8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling</td>
<td>9511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>a-Smad4 (B8) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
<td>sc-7966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dorsomorphin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>171260-10MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Recombinant Mouse BMP-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D</td>
<td>5020-BP-010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton-X 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>H5151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Detection Reagents (Orange)</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OLINK</td>
<td>92007-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>92004-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>92002-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Mounting Medium with DAPI</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>82040-0005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Wash Buffers Fluorescence</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>82049</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using in situ pla, a proximity ligation assay

BMPは、発達と生物学的影響の広範な責任があります。 BMPの受容体が活性化（リン酸化）Smad1/5/8エフェクター、その次に、であるSmad4と複合体を形成し、彼らはBMP特定の下流効果1を開始する転写因子として機能する核内に移行。リン酸化のSmadペプチドに対する抗体を持つ伝統的な免疫蛍光技術は、低感度、高いバックグラウンドを示し、これは蛍光感光性である場合は、特に抗体のシグナルの強度に依存しているとして、総定量化を提供します。さらに、リン酸化されたSmadはすべてであるSmad4との複合体ではない可能性があり、アクティブな転写に従事。 その場で PLAは、高い特異性と感度が2から4と ​​タンパク質の相互作用を検出することができる技術です。タンパク質のDNAサロゲートの増幅と、この新しい技術のカップルの抗体の認識。それは認識イベントの正確な位置を明らかに斑点の形でローカライズされた、離散信号を生成する。信号の数をカウントし、測定を提供することと比較することができます。我々は、これらのシグナリングでのみ発生する、複雑で近接すなわち、内にあるときのみBMPシグナル伝達のエフェクターphospho-Smad1/5/8とSmad4の検出を可能にする抗体の組み合わせで、Duolinkキットを使用して、 その場 PLA の適用活性化。これは、BMP4刺激下のタイムコース実験で高い特異性と感度を持つ内因性BMPシグナル伝達の可視化と計測、初めて許可。

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Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

ここでは、骨形成タンパク質（BMP）固定された細胞のシグナル伝達を可視化する抗体の組み合わせで近接ライゲーションアッセイ（PLA）を、使用する方法を示します。このテクニックは、私たちは、内因性BMP活性化エフェクター複合体の核内蓄積を追跡し、BMP4刺激下で時間をかけて自分のレベルを定量することができました。

使用BMP4のエフェクター-錯体のダウンストリームシグナリングの検出その場で PLA、近接ライゲーションアッセイ

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

detection-signaling-effector-complexes-downstream-bmp4-using-situ-pla

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

31.6K ビュー.  Imperial College, Hammersmith Hospital. ここでは、骨形成タンパク質（BMP）固定された細胞のシグナル伝達を可視化する抗体の組み合わせで近接ライゲーションアッセイ（PLA）を、使用する方法を示します。このテクニックは、私たちは、内因性BMP活性化エフェクター複合体の核内蓄積を追跡し、BMP4刺激下で時間をかけて自分のレベルを定量することができました。

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Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

蛍光によるウイルスRNAの検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

生物学

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

代謝率の測定に<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;呼吸計測を使用した

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

マウス骨格筋におけるDNA損傷の検出と分析<em&gt;その場で</em&gt; TUNEL法を用いた

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

レンチウイルス形質導入と腸オルガノイドの下流分析のためのプロトコル

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

3&#39;LIFEアッセイを用いた高スループットにおけるmiRNA標的の検出

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Here, we describe a procedure to visualize and quantify with high sensitivity the endogenous interactions between the endoplasmic reticulum and mitochondria in fixed cells. The protocol features an optimized in situ proximity ligation assay targeting the inositol 1,4,5-triphosphate receptor/glucose-regulated protein 75/voltage-dependent anion channel/cyclophilin D complex at the mitochondria-associated membrane interface.

小胞体とミトコンドリアの相互作用の研究によって、<em&gt;その場で</em固定された細胞における&gt;近接ライゲーションアッセイ

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires careful and in-depth analyses and quantification to capture as much information about the underlying events as possible. Spatial, temporal and intensity parameters intrinsic to Ca2+ signals such as frequency, duration, propagation, velocity and amplitude may provide some biological information required for intracellular signalling. High-resolution Ca2+ imaging typically results in the acquisition of large data files that are time consuming to process in terms of translating the imaging information into quantifiable data, and this process can be susceptible to human error and bias. Analysis of Ca2+ signals from cells in situ typically relies on simple intensity measurements from arbitrarily selected regions of interest (ROI) within a field of view (FOV). This approach ignores much of the important signaling information contained in the FOV. Thus, in order to maximize recovery of information from such high-resolution recordings obtained with Ca2+dyes or optogenetic Ca2+ imaging, appropriate spatial and temporal analysis of the Ca2+ signals is required. The protocols outlined in this paper will describe how a high volume of data can be obtained from Ca2+ imaging recordings to facilitate more complete analysis and quantification of Ca2+ signals recorded from cells using a combination of spatiotemporal map (STM)-based analysis and particle-based analysis. The protocols also describe how different patterns of Ca2+ signaling observed in different cell populations in situ can be analyzed appropriately. For illustration, the method will examine Ca2+ signaling in a specialized population of cells in the small intestine, interstitial cells of Cajal (ICC), using GECIs.

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) have radically changed how in situ Ca2+ imaging is performed. To maximize data recovery from such recordings, appropriate analysis of Ca2+ signals is required. The protocols in this paper facilitate the quantification of Ca2+ signals recorded in situ using spatiotemporal mapping and particle-based analysis.

その場で細胞内 Ca2 +シグナル伝達を定量化する時空マッピングと粒子分析技術の応用

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female Anopheles mosquitoes are transmitted to humans via mosquito bites during blood feeding. The presence of sporozoites in the mosquito salivary glands thus defines mosquito infectiousness. To determine whether an Anopheles mosquito carries Plasmodium sporozoites, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method has been the standard tool to detect the Plasmodium circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of the sporozoites. In this method, the head along with the thorax of each mosquito is separated from the abdomen, homogenized, and subjected to a sandwich ELISA to detect the presence of CSP specific to Plasmodium falciparum and each of the two subtypes, VK210 and VK247, of Plasmodium vivax.This method has been used to study malaria transmission, including the seasonal dynamics of mosquito infection and the species of the major malaria vectors in the study sites.

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

This protocol describes a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect salivary gland sporozoites in mosquitoes. Using easily available monoclonal antibodies, the method enables cost-effective, high-throughput detection of mosquitoes carrying Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax. The method is suitable for malaria transmission research, including vector surveys.

酵素結合免疫吸着アッセイを用いたハマダラカ蚊におけるマラリア原虫スポロゾイトの検出

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female ...

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

The mammalian global response to sealing deep tissue wounds is through scar formation and tissue contraction, mediated by specialized fascia fibroblasts. Despite the clinical significance of scar formation and impaired wound healing, our understanding of fascia fibroblast dynamics in wound healing is cursory due to the lack of relevant assays that enable direct visualization of fibroblast choreography and dynamics in complex environments such as in skin wounds. This paper presents a protocol to generate ex- situ skin scars using SCAD or &#34;SCar-like tissue in A Dish&#34; that emulate the complex environment of skin wounds. In this assay, 2 mm full-thickness skin is excised and cultured upside down in media for 5 days, during which scars and skin contractures develop uniformly. This methodology, coupled with fibroblast-lineage specific transgenic mouse models, enables visualization of individual fibroblast lineages across the entire wound repair process. Overall, this protocol aids&#160;researchers in understanding fundamental processes and mechanisms of wound repair,&#160;directly exploring the effects of modulators on wound healing outcomes.

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

This protocol describes the generation of a skin-fascia explant termed "SCar like tissue in A Dish" or SCAD. This model allows unprecedented visualization of single fibroblasts during scar formation.

SCADアッセイを使用した瘢痕発生の可視化 - ex situ 皮膚瘢痕化アッセイ

The mammalian global response to sealing deep tissue wounds is through scar formation and tissue contraction, mediated by specialized fascia fibroblasts. ...

微生物叢マルチオミクスのための細菌細胞外小胞の単離の強化

Isolation and Purification of Bacterial Extracellular Vesicles from Human Feces Using Density Gradient Centrifugation

Bacterial extracellular vesicles (BEVs) are nanovesicles derived from bacteria that play an active role in bacteria-bacteria and bacteria-host communication, transferring bioactive molecules such as proteins, lipids, and nucleic acids inherited from the parent bacteria. BEVs derived from the gut microbiota have effects within the gastrointestinal tract and can reach distant organs, resulting in significant implications for physiology and pathology. Theoretical investigations that explore the types, quantities, and roles of BEVs derived from human feces are crucial for understanding the secretion and function of BEVs from the gut microbiota. These investigations also necessitate an improvement in the current strategy for isolating and purifying BEVs.
This study optimized the isolation and purification process of BEVs by establishing two density gradient centrifugation (DGC) modes: Top-down and Bottom-up. The enriched distribution of BEVs was determined in fractions 6 to 8 (F6-F8). The effectiveness of the approach was evaluated based on particle morphology, size, concentration, and protein content. The particle and protein recovery rates were calculated, and the presence of specific markers was analyzed to compare the recovery and purity of the two DGC modes. The results indicated that the Top-down centrifugation mode had lower contamination levels and achieved a recovery rate and purity similar to that of the Bottom-up mode. A centrifugation time of 7 h was sufficient to achieve a fecal BEV concentration of 108/mg.
Apart from feces, this method could be applied to other body fluid types with proper modification according to the differences in components and viscosity. In conclusion, this detailed and reliable protocol would facilitate the standardized isolation and purification of BEVs and thus, lay a foundation for subsequent multi-omics analysis and functional experiments.

著者スポットライト:細菌の細胞外小胞の分離と不均一性に関する研究の加速 

This study describes a method to isolate and purify bacterial extracellular vesicles (BEVs) enriched from human feces via density gradient centrifugation (DGC), identifies the physical characteristics of BEVs from morphology, particle size, and concentration, and discusses the potential applications of the DGC approach in clinical and scientific research.