Esta pesquisa é financiada pelo MRC e as subvenções BBSRC. Agradecemos a Agata Zieba e Katerina Pardalis no laboratório de Ulf Landegren, Uppsala University para ajudar com a criação da técnica e conselhos úteis. Olink Biosience para ajuda técnica e apresentação.

1. Chapeamento de Células e Tratamento com BMP <ol><li> Células de cultura em Neuro2a GMEM suplementado com 10% FBS, 1x Non-aminoácidos essenciais (NEAM), 1x piruvato de sódio e 1x L-glutamina. Dividir as células usando tripsina (0,05%-EDTA) e placa de 15,000-20,000 células por poço em um slide de câmara de 16 também. Cultura HEK293T ou Cos7 células em DMEM suplementado com 10% FBS, 1x L-glutamina e penicilina 1x / estreptomicina. Esterilizar slides polysine por imersão em etanol 70% e usando caneta Immedge empate 1 cm 2 poços. Dividir as células usando tripsina (0,05%-EDTA) e placa de 20,000-25,000 células por poço em 50 mL médio. </li><li> Incubar as células a 37 ° C em um umidificado, 5% CO 2 incubadora. </li><li> Após 24 h substituir o meio com soro livre GMEM (suplementado com 0,1% de albumina, NEAM 1x, 1x piruvato de sódio e 1x L-glutamina) para Neuro2a ou com soro livre DMEM (suplementada com L-Glutamina e penicilina 1x / estreptomicina) para HEK293T / Cos7 e incubar as células por 2-3 h. Manter três poços com células em condições de cultura normal (ou seja, 10% FBS) para uso como controles. </li><li> Tratar as células com dorsomorphin (inibidor da via BMP, 2 mM) ou BMP4 (25 ng / ml) para o tempo desejado (por exemplo, para h 10 min-1) 5. </li></ol> 2. Fixação e permeabilização <ol><li> Prepare o fixador, PFA 4%. Pesar 4 g de PFA para preparar uma solução de 4% em 100 ml PBS. Aquecer a solução a 50 ° C até que fique claro. Filtrar a solução através de um filtro 0,22 mm e armazenar a 4 ° C até o uso. Use fixador fresco (não armazenados por mais de 2 dias). </li><li> Aspirar o meio dos poços e lavar com 1xPBS. Não pipete as soluções diretamente sobre as células, pois isso pode resultar em descolamento das células. Antes de ir para a próxima etapa, se slides câmara são usados ​​remover as câmaras, mas deixar o silicone em torno dos poços. </li><li> Adicionar 50 ul PFA 4% e incubar por 10 minutos, à temperatura ambiente, sem agitação. </li><li> Lavar as células com PBS por 3 x 5 min em um frasco Coplin com agitação à temperatura ambiente. </li><li> Tratar as células com 0,5% Triton X-100 em PBS por 10 min, sem agitação à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as células com Tween 0,05% 20 em TBS (TBS-T) por 3 x 5 min em um frasco Coplin com agitação à temperatura ambiente. </li></ol> 3. Bloqueio <ol><li> Torneira da TBS-T. Adicione uma gota de solução de bloqueio Duolink II (1x) por poço. </li><li> Incubar as lâminas em câmara úmida pré-aquecido por 1 hora a 37 ° C. </li></ol> 4. Anticorpos primários <ol><li> Misturar e diluir aP-Smad1/5/8 (coelho policlonal) em 1:100 e a-Smad4 (mouse monoclonal) a 1:100 na II anticorpos Duolink Diluente (1x). Prepare também aP-Smad1/5/8 e-Smad4 sozinho nas mesmas concentrações para ser usado para controles. </li><li> Torneira a solução de bloqueio dos slides. Remover o bloqueio solução muito possível, mas tomar cuidado extra para não deixar que as células secas antes de adicionar o anticorpo. Adicionar 40 mL das soluções de anticorpos aos poços. Em um poço adicionar Diluente de anticorpos apenas como um controle negativo adicional. </li></ol> 5. Sondas PLA <ol><li> Diluir as duas sondas PLA (Duolink II anti-Mouse MINUS e Duolink II anti-coelho PLUS) 1:05 em diluente de anticorpo. </li><li> Torneira a solução anticorpo primário do slides. Lavar as lâminas duas vezes 5 min cada um com 1x Duolink tampão de lavagem II A em um frasco Coplin com agitação à temperatura ambiente. </li><li> Toque fora do tampão de lavagem A partir dos slides e adicionar a solução PLA sonda (40 mL / poço). Incubar as lâminas em câmara úmida pré-aquecido por 1 hora a 37 ° C. </li></ol> 6. Ligadura <ol><li> Vortex da Duolink estoque Ligadura II (5x) e diluir 1:5 em água de alta pureza e misturar. Ao calcular o volume de água, levar em conta o volume da Ligase que será adicionado a uma diluição final de 1:40, pouco antes da adição da mistura aos poços. </li><li> Torneira a solução sonda PLA do slides. Lavar as lâminas em tampão de lavagem 1x A por 2 vezes 5 minutos cada um em uma jarra de Coplin com agitação à temperatura ambiente. </li><li> Retire o Ligase do congelador usando um bloco de congelamento (-20 ° C). Adicione o Ligase à solução Ligadura (elaborado em 6.1), com uma diluição de 1:40 e vortex. </li><li> Toque fora do tampão de lavagem A partir dos slides e adicionar a solução Ligadura Ligase-a cada poço (40 mL / poço). Incubar as lâminas em câmara úmida pré-aquecido por 30 min a 37 ° C. </li></ol> 7. Amplificação Nota: Light reagentes sensíveis. Manter os slides protegido da luz. <ol><li> Diluir o Duolink estoque Amplificação II (5x) 1:5 em água de alta pureza e misturar. Ao calcular o volume de água ter em conta o volume do Polymerase que será adicionado a uma diluição final de 1:80, pouco antes da adição da mistura para poe poços. </li><li> Torneira a solução Ligadura Ligase a partir do slides. Lavar as lâminas em tampão de lavagem 1x A por 2 vezes com 2 min cada um em uma jarra de Coplin com agitação à temperatura ambiente. </li><li> Retire a polimerase do freezer usando um bloco de congelamento (-20 ° C). Adicione o Polimerase para a solução de amplificação (elaborado em 7.1) na diluição de 1:80 e vortex. </li><li> Toque fora do tampão de lavagem A partir dos slides e adicionar a solução de amplificação da Polimerase para cada poço (40 mL / poço). Incubar as lâminas em câmara úmida pré-aquecido para 100 min a 37 ° C. </li></ol> 8. Preparação para a imagem Nota: Light reagentes sensíveis. Manter os slides protegido da luz. <ol><li> Torneira a solução de amplificação da Polimerase a partir do slides e lavar por 2 vezes a cada 10min em 1x Duolink II Wash Buffer B em um frasco Coplin com agitação à temperatura ambiente. </li><li> Mergulhar as lâminas em 0,1 x Wash Buffer B. </li><li> Remover o silicone a partir do slide 16 bem completo. Adicionar ~ 40μl da II Duolink Meio de Montagem com DAPI na lamela e gentilmente coloque-o sobre as amostras pressionando-o ligeiramente de modo que não há bolhas de ar sob a lamínula. Fix e selar a lamela no slide utilizando unha polonês. Esperar pelo menos 15min antes de proceder à imagem. </li><li> Analisar as amostras com um microscópio confocal ou fluorescência. Obtenção de imagens digitais. </li></ol> 9. Quantificação Nota: Light reagentes sensíveis. Manter os slides protegido da luz. <ol><li> Use Duolink ImageTool para contar os sinais nas imagens para obter uma medição do nível de sinalização. </li><li> Compare as medidas e fazer um gráfico. </li></ol> 10. Resultados representante O resultado de um experimento em PLA situ mostra como discretos pontos fluorescentes. A localização do sinal depende das proteínas específicas estudadas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2631/2631fig1.jpg" /> Figura 1. PLA situ em células Neuro2a após a estimulação BMP4. Células foram tratadas com 2 mM dorsomorphin (inibidor da via BMP) (A) ou 25 ng / ml BMP4 (B) por 60 min ou não tratada (CE). Anticorpos contra P-Smad1/5/8 e Smad4 foram usados ​​para detectar os complexos ativos em A e B. Os anticorpos primários aP-Smad1/5/8 sozinho (C) e a-Smad4 sozinho (D) ou omissão do primário anticorpos (E) foram utilizados como controle. Azul: DAPI; Vermelho: sinal de PLA. Imagens foram obtidas com um microscópio confocal Leica SP5. (F) Os sinais de PLA foram contados com o software ImageTool Duolink eo número médio de manchas no núcleo por célula é apresentado no gráfico. (G) células Neuro2a foram deixados sem tratamento ou tratados com Dorsomorphin (2 mM) ou BMP4 (25 ng / ml) por 60 min. As células foram lisadas e as proteínas foram submetidas a SDS-PAGE e analisadas por immunoblotting com aP-Smad1/5/8 e PCNA-como o carregamento de controle. (*) Banda não específico. Note que o anticorpo aP-Smad1/5/8 não pode distinguir entre os 3 diferentes proteínas presentes no complexo com Smad4.

<ol>
	<li>Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. o. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=morphogenetic+protein+receptors+and+signal+transduction.">morphogenetic protein receptors and signal transduction.</a> J Biochem. 147, 35-51 (2010).</li><li>Gustafsdottir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays+for+sensitive+and+specific+protein+analyses.">Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses.</a> Anal Biochem. 345, 2-9 (2005).</li><li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).</li><li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li><li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism.">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nat Chem Biol. 4, 33-41 (2008).</li><li>Baan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+proximity+ligation+detection+of+c-Jun/AP-1+dimers+reveals+increased+levels+of+c-Jun/Fra1+complexes+in+aggressive+breast+cancer+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo.">In situ proximity ligation detection of c-Jun/AP-1 dimers reveals increased levels of c-Jun/Fra1 complexes in aggressive breast cancer cell lines in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 1982-1990 .</li><li>Massinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interaction+of+DYX1C1+with+estrogen+receptors+suggests+involvement+of+hormonal+pathways+in+dyslexia.">Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia.</a> Hum Mol Genet. 18, 2802-2812 (2009).</li><li>Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+interactions+between+liver+X+receptor/retinoid+X+receptor+and+Sp1+modulate+the+transcriptional+induction+of+the+human+ATP+binding+cassette+transporter+A1+gene+by+oxysterols+and+retinoids.">Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids.</a> Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).</li></ol>

A produção deste vídeo-artigo foi patrocinado pela OLINK que faz um reagente utilizado no procedimento de ensaio proximidade ligadura.

A visualização de complexos de proteínas in situ está em grande demanda, especialmente para estudos na sinalização onde a interação de proteínas e modificação de proteínas são os meios que as células usam para o envio de um sinal de sua superfície para o núcleo. Não foi possível visualizar e quantificar complexos entre duas proteínas endógenas in situ por imunofluorescência antes. Co-localização de anticorpos apresenta baixa resolução e não pode ser usado para visualizar verdadeira interação. PLA é uma nova técnica que os pesquisadores começaram a usar em diferentes sistemas com grande sucesso 6, 7. Aqui, demonstramos como usar PLA não só de visualizar, mas também para quantificar complexos endógenos entre effectors Smad ativada a jusante de estimulação BMP ao longo do tempo. Nós usamos células do tecido diferente de cultura, incluindo Neuro2a e contou com anticorpos comerciais levantadas em diferentes espécies (rato e coelho-Smad4 aP-Smad1/5/8) para alcançar este (fig. 1). Este método permitiu, pela primeira vez, para ver a ativação de BMP-efetoras complexos ao longo do tempo e não apenas a presença do Smad1/5/8 fosforilada, que não podem ser todos envolvidos em complexos ativos com Smad4. Nós contamos os sinais (fig. 1F) e comparou a medida com a quantificação obtida immunoblot das mesmas células 8 (figura 1G). Concluiu-se que o número de pontos fornecem uma medida exata comparativa dos níveis de sinalização ao longo do tempo. A técnica também foi aplicado em linhas de outra célula (HEK293T e Cos7) com resultados semelhantes (dados não mostrados). O princípio da tecnologia é baseada em duas sondas exclusivas fornecidas com o kit Duolink. Cada sonda PLA consiste de um anticorpo secundário ligado a um oligonucleotídeo sintético única, que atua como repórter. A proximidade das sondas de DNA permite a ligadura no local exato onde essas sondas encontram-se em proximidade. A distância do oligonucleotides, que permite a hibridização de DNA e ligadura é pequeno (40nm &lt;) e, portanto, apenas as proteínas que interagem pode permitir ligadura. O DNA ligado pode então ser amplificado e detectado com hibridização de oligonucleotídeos rotulado da seqüência amplificada. A amplificação é específico, uma vez que depende de princípios hibridização DNA-DNA e também fornece alta sensibilidade como o DNA é amplificado ligado várias vezes, resultando em melhoria do evento ligadura inicial. O DNA amplificado é detectado por hibridização com oligonucleotídeos marcados e produz um local visível e bastante grande. Como as manchas podem ser contados, o sinal PLA fornece não só a informação exata espacial (o local dos eventos de interação), mas também uma forma objetiva de quantificar esses eventos 2-4. Outras técnicas que são empregadas para a detecção de interações proteína incluem co-imunoprecipitação, imunofluorescência e transferência de energia fluorescente ressonância (FRET). Co-imunoprecipitação ensaios são amplamente utilizados permitindo o isolamento de complexos de proteínas. O método é acompanhado por immunoblotting o que significa que as proteínas devem ser expressas em níveis relativamente elevados, a fim de ser detectado. Problemas de fundo elevado ou ligação não específica de algumas proteínas que as contas são por vezes difíceis de superar, em co-imunoprecipitação. Além disso, co-imunoprecipitação ensaios permitem a detecção de proteínas que pode ser parte de um complexo de proteínas, mas não pode distinguir aqueles que estão muito próximas fisicamente interagindo uns com os outros. Além disso, co-immunoprecipitations não pode fornecer quantificação na resolução única célula ou informações sobre a localização dos complexos de proteína na célula. Detecção de co-existência de complexos de proteínas em uma célula ou um compartimento celular por imunofluorescência é baseado na sobreposição de sinais difusos e, portanto, tem baixa resolução espacial e não pode fornecer informações precisas sobre as interações proteína. Quantificação do sinal de imunofluorescência pode ser feito por estimativa visual apenas se a diferença é várias vezes, e não pode ser exato ou mensuráveis ​​como os pontos PLA. FRET permite a visualização de complexos de proteínas em células vivas e supera a necessidade de anticorpos e da exposição do epítopo. No entanto, FRET geralmente depende da superexpressão de proteínas fundidas artificial, que pode não refletir a complexos de proteína endógena como no PLA. Condições de bloqueio no protocolo de PLA são críticos como agregação de anticorpos pode ocorrer e aumentar o fundo. Alternativas condições de bloqueio pode ser encontrado em folhas de produtos de anticorpos. Controles apropriados com omissão do anticorpo primário e secundário fornecer informações sobre o que pode ter dado errado e eles precisam ser sempre incluído. É importante para a tela anticorpos diferentes que vai dar o mínimo de fundo quando eles são usados ​​sozinhos e o melhor sinal quando estão juntos. Fixação de cells é crítica como sobre a fixação de complexos de proteínas pode causar a total desnaturar e degradar, enquanto que a fixação insuficiente pode levar à perda de complexos de proteínas durante as etapas do procedimento. Isto pode ser controlado através da redução da concentração do fixador a 3% ou limitando o tempo de fixação. No entanto, a fixação depende também se os anticorpos primários reconhecer proteínas desnaturadas ou não. Como a técnica de PLA é muito sensível, cuidados especiais são necessários para manter os tempos de incubação e as condições micro iguais entre diferentes amostras. As amostras não devem ser deixadas para secar em qualquer caso, antes da etapa final. A secagem das amostras pode levar a aumento de fundo. A remoção completa da solução de bloqueio também é fundamental para evitar a fundo. Os buffers de lavagem deve sempre estar à temperatura ambiente antes do uso, como baixa temperatura retarda as reações enzimáticas. Para solucionar o problema, consulte o manual do Kit. É útil usar manchas para determinar a localização sub-celular do sinal de PLA (por exemplo, DAPI, actina etc). Aqui nós temos utilizado DAPI (no meio de montagem) para manchar os núcleos. PLA é compatível com o uso de imunofluorescência com anticorpos para determinar o tipo de célula ou compartimento celular (não mostrado aqui). Quantificação exata pode ser feito através da contagem de sinais eo uso de software específico (Image Tool Duolink, Olink Biosience). Em conclusão, demonstramos como usar no PLA situ, utilizando o kit para detectar Duolink BMP sinalização em células fixas e apresentou as suas vantagens: fácil de usar, altamente sensível, sem fundo, e uma capacidade única para quantificar ativos de sinalização BMP in situ. A limitação da aplicação desta técnica para estudar as interações proteína diferente depende da disponibilidade e qualidade dos anticorpos primários que reconhecem as proteínas sob investigação.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>GMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21710025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21063029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AutogenBioclear</td>
<td>7.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11149068</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Pyruvate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11360070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin / Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25300-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>16-well chamber slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lab-Tek</td>
<td>178599</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polysine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0138</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>a-pSmad1/5/8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling</td>
<td>9511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>a-Smad4 (B8) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
<td>sc-7966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dorsomorphin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>171260-10MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Recombinant Mouse BMP-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D</td>
<td>5020-BP-010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton-X 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>H5151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Detection Reagents (Orange)</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OLINK</td>
<td>92007-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>92004-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>92002-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Mounting Medium with DAPI</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>82040-0005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Wash Buffers Fluorescence</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>82049</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using in situ pla, a proximity ligation assay

BMPs são responsáveis ​​por uma grande variedade de efeitos no desenvolvimento e biológicas. Receptores de BMP ativar (fosforilar) o Smad1/5/8 efetores, que então, formam um complexo com Smad4 e translocar para o núcleo onde funcionam como fatores de transcrição para iniciar BMP efeitos específicos a jusante 1. Tradicionais imuno-fluorescência técnicas com anticorpos contra fosfo Smad-peptídeos apresentam baixa sensibilidade fundo, alta e oferecer quantificação bruta como eles dependem da intensidade do sinal de anticorpos particularmente se este é fotossensível fluorescente. Além disso, fosfo-Smads não podem ser todos em um complexo com Smad4 e engajados na transcrição ativa. In situ PLA é uma tecnologia capaz de detectar as interações de proteínas com alta especificidade e sensibilidade 2-4. Esta nova tecnologia de reconhecimento de casais de anticorpos com a amplificação de DNA substituto da proteína. Ele gera um sinal, localizada em uma discreta forma de spots revelando a posição exata do evento de reconhecimento. O número de sinais podem ser contados e comparados proporcionando uma medição. Nós aplicamos em PLA situ, utilizando o kit Duolink, com uma combinação de anticorpos que permite a detecção do effectors BMP e sinalização phospho-Smad1/5/8 Smad4 apenas quando estes estão em proximidade ou seja, em um complexo, que ocorre apenas com a sinalização ativação. Isto permitiu, pela primeira vez, a visualização e medição de BMP endógenos de sinalização com alta especificidade e sensibilidade em um experimento de curso de tempo sob estímulo BMP4.

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Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Aqui nós mostramos como usar Assay Proximidade Ligadura (PLA), com uma combinação de anticorpos para visualizar proteínas morfogenéticas ósseas (BMP) de sinalização em células fixas. Esta técnica permitiu-nos a seguir o acúmulo nuclear de BMP activada endógena efetoras complexos e quantificar os seus níveis ao longo do tempo sob BMP4 estimulação.

Detecção de Sinalização de Efeitos Complexos Downstream de BMP4 Usando In situ PLA, um Ensaio Ligadura Proximidade

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

detection-signaling-effector-complexes-downstream-bmp4-using-situ-pla

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

31.7K visualizações.  Imperial College, Hammersmith Hospital. Aqui nós mostramos como usar Assay Proximidade Ligadura (PLA), com uma combinação de anticorpos para visualizar proteínas morfogenéticas ósseas (BMP) de sinalização em células fixas. Esta técnica permitiu-nos a seguir o acúmulo nuclear de BMP activada endógena efetoras complexos e quantificar os seus níveis ao longo do tempo sob BMP4 estimulação.

Vídeo: Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologia

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Detecção rápida de Homogêneos Ensaios Biológicos Usando o sistema de modulação Biossensoriais Magnetic

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Detecção de RNA viral por fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Análise Genética rápida de epitelial-mesenquimal sinalização durante a regeneração do cabelo

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

A medição da taxa metabólica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Usando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Detecção e análise de danos no DNA em Rato Músculo Esquelético<em&gt; In Situ</em&gt; Usando o método TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Detecção de alvos miRNA em métodos de alta capacidade utilizando o ensaio 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Here, we describe a procedure to visualize and quantify with high sensitivity the endogenous interactions between the endoplasmic reticulum and mitochondria in fixed cells. The protocol features an optimized in situ proximity ligation assay targeting the inositol 1,4,5-triphosphate receptor/glucose-regulated protein 75/voltage-dependent anion channel/cyclophilin D complex at the mitochondria-associated membrane interface.

Estudo do retículo endoplasmático e mitocôndrias Interações por<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidade Ligadura Ensaio em células fixas

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires careful and in-depth analyses and quantification to capture as much information about the underlying events as possible. Spatial, temporal and intensity parameters intrinsic to Ca2+ signals such as frequency, duration, propagation, velocity and amplitude may provide some biological information required for intracellular signalling. High-resolution Ca2+ imaging typically results in the acquisition of large data files that are time consuming to process in terms of translating the imaging information into quantifiable data, and this process can be susceptible to human error and bias. Analysis of Ca2+ signals from cells in situ typically relies on simple intensity measurements from arbitrarily selected regions of interest (ROI) within a field of view (FOV). This approach ignores much of the important signaling information contained in the FOV. Thus, in order to maximize recovery of information from such high-resolution recordings obtained with Ca2+dyes or optogenetic Ca2+ imaging, appropriate spatial and temporal analysis of the Ca2+ signals is required. The protocols outlined in this paper will describe how a high volume of data can be obtained from Ca2+ imaging recordings to facilitate more complete analysis and quantification of Ca2+ signals recorded from cells using a combination of spatiotemporal map (STM)-based analysis and particle-based analysis. The protocols also describe how different patterns of Ca2+ signaling observed in different cell populations in situ can be analyzed appropriately. For illustration, the method will examine Ca2+ signaling in a specialized population of cells in the small intestine, interstitial cells of Cajal (ICC), using GECIs.

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) have radically changed how in situ Ca2+ imaging is performed. To maximize data recovery from such recordings, appropriate analysis of Ca2+ signals is required. The protocols in this paper facilitate the quantification of Ca2+ signals recorded in situ using spatiotemporal mapping and particle-based analysis.

Aplicações de mapeamento de espaço-temporal e técnicas de análise de partículas para quantificar intracelular Ca2 + sinalização em Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

Detecção de Sinalização de Efeitos Complexos Downstream de BMP4 Usando In situ PLA, um Ensaio Ligadura Proximidade

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Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides

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Aplicações de mapeamento de espaço-temporal e técnicas de análise de partículas para quantificar intracelular Ca^{2 +} sinalização em Situ