מחקר זה מומן על ידי MRC ואת מענקי BBSRC. אנו מודים אגתה Zieba וקתרינה Pardalis במעבדה של אולף Landegren, אופסלה על העזרה עם הקמת טכניקה ועצות שימושיות. Olink Biosience לעזרה טכנית את המצגת.

1. ציפוי של תאים וטיפול עם BMP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות תאים Neuro2a ב GMEM בתוספת 10% FBS, 1x שאינם חיוניים חומצות אמינו (NEAM), 1x pyruvate נתרן 1x-L-גלוטמין. פצל את התאים באמצעות טריפסין (0.05%, EDTA) ו 15.000-20.000 צלחת התאים היטב לכל שקופית 16-באר קאמרית. תרבות HEK293T או Cos7 תאים DMEM בתוספת 10% FBS, 1x-L-גלוטמין ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין. לעקר שקופיות polysine ידי שיקוע שלהם אתנול 70% באמצעות עט Immedge לשאוב מבארות 1 2 ס&quot;מ. פצל את התאים באמצעות טריפסין (0.05%, EDTA) ו 20.000-25.000 צלחת התאים לכל טוב בינוני 50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס humidified, 5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 24 שעות להחליף את מדיום עם סרום חינם GMEM (בתוספת 0.1% אלבומין, NEAM 1x, 1x pyruvate נתרן 1x-L-גלוטמין) עבור Neuro2a או עם סרום חינם DMEM (בתוספת L-גלוטמין ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין) עבור HEK293T / Cos7 ו דגירה התאים עבור 2-3 ח שמור שלוש בארות עם תאים בתנאים culturing נורמלי (כלומר 10% FBS) כדי להשתמש בהם שולטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את התאים dorsomorphin (מעכב של מסלול BMP, 2 מיקרומטר) או BMP4 (25 ng / ml) בפעם הרצוי (למשל עבור h 10 min-1) 5. </li></ol> 2. קיבוע ו Permeabilization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מקבע, PFA 4%. לשקול 4 גרם של PFA להכין פתרון 4% 100 מ&quot;ל PBS. חם הפתרון על 50 מעלות צלזיוס עד ברור. סנן את הפתרון דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 ° C עד השימוש. השתמש מקבע טרי (לא מאוחסן במשך יותר מ 2 ימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום מבארות ולשטוף עם 1xPBS. אל פיפטה פתרונות ישירות על התאים כמו זה עלול לגרום ניתוק של התאים. לפני שנמשיך לשלב הבא, אם שקופיות קאמרית משמשים להסרת תאים, אך להשאיר את סיליקון סביב הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl PFA 4% ו דגירה עבור 10min, ב RT, ללא תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS דקות 3 5 x בצנצנת Coplin בהתרגשות על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את התאים עם 0.5% Triton X-100 ב PBS במשך 10 דקות ללא תסיסה ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים Tween 0,05 20% TBS (TBS-T) עבור 3 דקות 5 x בצנצנת Coplin בהתרגשות ב RT. </li></ol> 3. חסימת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את TBS-T. הוסף טיפה אחת של פתרון Duolink חסימת II (1x) לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות בחדר מחומם מראש לחות עבור h 1 ב 37 ° C. </li></ol> 4. ראשי נוגדנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים לדלל aP-Smad1/5/8 (ארנב polyclonal) בשעה 1:100 ו-Smad4 (עכבר חד שבטיים) בשעה 1:100 ב II Duolink נוגדן diluent (1x). הכן גם aP-Smad1/5/8 ו-Smad4 לבד הריכוזים אותו לשמש שולטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את פתרון חסימת מן השקופיות. הסר כפתרון חסימת רב ​​ככל האפשר, אבל לטפל נוספת לא לתת התאים היבשים לפני הוספת נוגדנים. הוסף 40 μl של פתרונות נוגדנים הבארות. באחד גם להוסיף diluent נוגדן רק כפקד שליליות נוספות. </li></ol> 5. PLA בדיקות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את שתי חלליות PLA (Duolink II אנטי עכבר מינוס Duolink השנייה נגד ארנב PLUS) 01:05 ב diluent נוגדן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את הפתרון הנוגדן העיקרי מן השקופיות. שטפו את השקופיות 2 פעמים 5 דקות כל אחד עם הצפת 1x Duolink לשטוף II בצנצנת Coplin בהתרגשות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את הצפת לשטוף משקופיות ומוסיפים את הפתרון בדיקה PLA (40 μl / טוב). דגירה השקופיות בחדר מחומם מראש לחות עבור h 1 ב 37 ° C. </li></ol> 6. קשירת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המערבולת השנייה Duolink מניות קשירת (5x) ו 01:05 לדלל במים טוהר לערבב גבוהה. בעת חישוב נפח המים, לקחת בחשבון את נפח האנזים אשר יתווספו בדילול סופי של 1:40 בדיוק לפני תוספת של לערבב את הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את הפתרון בדיקה PLA מן השקופיות. שטפו את השקופיות הצפת לשטוף 1x עבור 2 פעמים 5 דקות כל אחד בצנצנת Coplin בהתרגשות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את האנזים מהמקפיא באמצעות לחסום הקפאה (-20 ° C). מוסיפים את האנזים לפתרון קשירת (שהוכנו 6.1) בשעה 1:40 דילול מערבולת ו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את הצפת לשטוף משקופיות ומוסיפים את הפתרון קשירת האנזים, זה טוב (40 μl / טוב). דגירה השקופיות בחדר מחומם מראש לחות למשך 30 דקות ב 37 ° C. </li></ol> 7. הגברה הערה: חומרים כימיים רגישים לאור. שמור את השקופיות מוגן מפני אור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את המניות השנייה Duolink הגברה (5x) 01:05 במים טוהר לערבב גבוהה. בעת חישוב נפח המים לקחת בחשבון את עוצמת הקול של פולימראז כי יתווספו בדילול סופי של 1:80 בדיוק לפני תוספת של לערבב כדי הדואר בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את הפתרון, קשירת האנזים מן השקופיות. שטפו את השקופיות הצפת לשטוף 1x עם עבור 2 פעמים 2 דקות כל אחד בצנצנת Coplin בהתרגשות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את פולימראז מהמקפיא באמצעות לחסום הקפאה (-20 ° C). מוסיפים את פולימראז לפתרון הגברה (שהוכנו 7.1) בשעה 1:80 דילול מערבולת ו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את הצפת לשטוף משקופיות ומוסיפים את פתרון הגברה-פולימראז זה טוב (40 μl / טוב). דגירה השקופיות בחדר מחומם מראש לחות עבור 100 דקות ב 37 ° C. </li></ol> 8. הכנה הדמיה הערה: חומרים כימיים רגישים לאור. שמור את השקופיות מוגן מפני אור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את פתרון הגברה-פולימראז משקופיות ולשטוף עבור 2 פעמים 10min כל 1x Duolink II לשטוף הצפת B בצנצנת Coplin בהתרגשות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את השקופיות 0.1 x לשטוף הצפת B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את סיליקון משקופית 16-הבאר לחלוטין. הוסף את ~ 40μl של השנייה Duolink הרכבה בינונית עם DAPI על coverslip ומניחים בעדינות על זה את דגימות לחיצה אותו מעט, כך אין בועות אוויר תחת להחליק את המכסה. תיקון ו לאטום את coverslip בשקופית באמצעות לק. חכו לפחות 15 דקות לפני שתמשיך הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות במיקרוסקופ confocal או פלואורסצנטי. השג תמונות דיגיטליות. </li></ol> 9. קביעת כמות הערה: חומרים כימיים רגישים לאור. שמור את השקופיות מוגן מפני אור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Duolink ImageTool לספור את האותות על התמונות כדי לקבל מדידה של רמת איתות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את המדידות ולעשות גרף. </li></ol> 10. נציג תוצאות התוצאה של הניסוי PLA באתרו מראה כתמים ניאון כמו בדידים. מיקומה של האות תלוי חלבונים ספציפיים למד. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/2631/2631fig1.jpg" /> איור 1. PLA באתרו על תאים Neuro2a לאחר גירוי BMP4. תאים שטופלו 2 מיקרומטר dorsomorphin (מעכב של מסלול BMP) (א) או 25 ng / ml BMP4 (ב) במשך 60 דקות או מטופל (CE). נוגדנים נגד P-Smad1/5/8 ו Smad4 שימשו כדי לאתר את מתחמי פעיל A ו-B נוגדנים העיקרי aP-Smad1/5/8 לבד (C) ו-Smad4 לבד (ד) או מחדל של הראשוני נוגדנים (E) שימשו שולטת. כחול: DAPI: אדום: אותות PLA. התמונות התקבלו עם מיקרוסקופ SP5 confocal לייקה. (F) האותות PLA נמנו עם התוכנה Duolink ImageTool ואת המספר הממוצע של כתמי בגרעין לכל תא מוצגת על הגרף. (ז) בתאים Neuro2a היו מטפלים או מטופלים עם Dorsomorphin (2 מיקרומטר) או BMP4 (25 ng / ml) עבור 60 דקות. התאים היו lysed ואת החלבונים היו נתונים SDS-PAGE ונותחו על ידי immunoblotting עם aP-Smad1/5/8 ו-PCNA כמו טעינה מלאה. (*) הלא ספציפית הלהקה. שים לב נוגדן aP-Smad1/5/8 לא ניתן להבחין בין 3 חלבונים שונים נוכח מורכבות עם Smad4.

<ol>
	<li>Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. o. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=morphogenetic+protein+receptors+and+signal+transduction.">morphogenetic protein receptors and signal transduction.</a> J Biochem. 147, 35-51 (2010).</li><li>Gustafsdottir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays+for+sensitive+and+specific+protein+analyses.">Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses.</a> Anal Biochem. 345, 2-9 (2005).</li><li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).</li><li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li><li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism.">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nat Chem Biol. 4, 33-41 (2008).</li><li>Baan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+proximity+ligation+detection+of+c-Jun/AP-1+dimers+reveals+increased+levels+of+c-Jun/Fra1+complexes+in+aggressive+breast+cancer+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo.">In situ proximity ligation detection of c-Jun/AP-1 dimers reveals increased levels of c-Jun/Fra1 complexes in aggressive breast cancer cell lines in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 1982-1990 .</li><li>Massinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interaction+of+DYX1C1+with+estrogen+receptors+suggests+involvement+of+hormonal+pathways+in+dyslexia.">Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia.</a> Hum Mol Genet. 18, 2802-2812 (2009).</li><li>Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+interactions+between+liver+X+receptor/retinoid+X+receptor+and+Sp1+modulate+the+transcriptional+induction+of+the+human+ATP+binding+cassette+transporter+A1+gene+by+oxysterols+and+retinoids.">Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids.</a> Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).</li></ol>

ההפקה של המאמר וידאו זה היה בחסות OLINK שעושה מגיב המשמשים את ההליך קשירת הקרבה assay.

ויזואליזציה של קומפלקסים חלבונים באתרו הוא ביקוש רב, במיוחד ללימודי איתות שבו אינטראקציה חלבון חלבון שינוי הם האמצעים כי התאים לשימוש שולח איתות מפני השטח שלהם לגרעין. זה לא היה ניתן לחזות ולכמת קומפלקסים בין שני חלבונים אנדוגניים באתרו עם immunofluorescence לפני. Co-לוקליזציה של נוגדנים מוצגים ברזולוציה נמוכה ולא ניתן להשתמש בהם כדי לחזות אינטראקציה אמיתית. PLA היא טכניקה חדשה כי החוקרים התחילו להשתמש במערכות שונות בהצלחה רבה 6, 7. כאן, אנו מדגימים כיצד להשתמש PLA לא רק לדמיין אלא גם לכמת מתחמי אנדוגני בין effectors Smad מופעל הזרם לאורך זמן של גירוי BMP. השתמשנו שונים כולל תאים בתרבית רקמה Neuro2a ו הסתמכה על נוגדנים מסחרי וגדל מינים שונים (עכבר ו-Smad4 ארנב aP-Smad1/5/8) כדי להשיג את זה (איור 1). שיטה זו אפשרה לנו, בפעם הראשונה, כדי לראות את ההפעלה של BMP-מתחמי מפעיל לאורך זמן ולא רק את נוכחותם של Smad1/5/8 פוספורילציה, אשר לא יכול להיות כל העוסקים מתחמי פעיל עם Smad4. ספרנו את האותות (תאנה 1F) והשווה את המדידה עם כימות המתקבל immunoblot של תאים באותו 8 (דמות 1G). הגענו למסקנה כי מספר המקומות מספקים מדידה השוואתית מדויקת של איתות רמות לאורך זמן. השיטה יושמה גם על שורות תאים אחרים (HEK293T ו Cos7) עם תוצאות דומות (מידע לא מוצג). העיקרון של הטכנולוגיה מבוססת על שתי בדיקות ייחודי המסופק עם ערכת Duolink. כל בדיקה PLA מכיל נוגדנים משני המחובר oligonucleotide סינתטי ייחודי, אשר משמש ככתב. קרבתו של בדיקות ה-DNA מאפשר קשירת על המיקום המדויק שבו אלו בדיקות מחוברים בסמיכות. המרחק של oligonucleotides, המאפשר הכלאה דנ&quot;א קשירת קטן (40nm &lt;) ולכן, חלבונים רק כי אינטראקציה יכולה להרשות קשירת. הדנ&quot;א ligated אז יכול להיות מוגבר מזוהה עם הכלאה של oligonucleotides שכותרתו רצף מוגבר. הגברה הוא ספציפי כמו זה תלוי DNA-DNA עקרונות ההכלאה וגם מספק רגישות גבוהה כמו ה-DNA ligated מוגבר פי כמה וכתוצאה מכך שיפור של האירוע קשירת הראשונית. דנ&quot;א מוגבר הוא זוהה על ידי הכלאה עם oligonucleotides שכותרתו ומייצרת מקום גלוי גדול למדי. כמו כתמים ניתן לספור, את האות PLA מספק לא רק את המידע המרחבי המדויק (את המיקום של האירועים אינטראקציה), אלא גם דרך לכימות אובייקטיבי של האירועים הללו 2-4. טכניקות אחרות, כי הם מועסקים לצורך זיהוי של אינטראקציות חלבון כוללים שיתוף immunoprecipitation, immunofluoresence ו תהודה פלורסנט העברת אנרגיה (סריג). Co-immunoprecipitation מבחני נמצאים בשימוש נרחב המאפשר בידוד של קומפלקסים חלבונים. השיטה מלווה immunoblotting כלומר חלבונים חייב לבוא לידי ביטוי ברמות גבוהות יחסית כדי להיות מזוהה. בעיות רקע גבוה או שאינו ספציפי המחייב של חלבונים מסוימים החרוזים הם לפעמים קשה להתגבר immunoprecipitation שיתוף. בנוסף, שיתוף immunoprecipitation מבחני לאפשר זיהוי של חלבונים יכולה להיות חלק ממכלול חלבון אך אינה יכולה להבחין אלה נמצאים בסמיכות פיזית מאוד באינטראקציה אחד עם השני. יתר על כן, שיתוף immunoprecipitations לא יכול לספק quantitation ברזולוציה תא יחיד או מידע על לוקליזציה של קומפלקסים חלבונים בתא. איתור של דו קיום של קומפלקסים חלבונים בתא או תא תא על ידי immunofluoresence מבוססת על חפיפה של אותות מתפזרת ולכן, יש ברזולוציה מרחבית נמוכה, לא יכול לספק מידע מדויק על אינטראקציות חלבון. כימות האות immunofluoresence יכול להיעשות על ידי הערכה ויזואלית רק אם ההבדל הוא פי כמה וכמה, ולא ניתן למדידה מדויקת או כמו כתמים PLA. סריג מאפשר הדמיה של קומפלקסים חלבונים בתאים חיים מתגבר הצורך נוגדנים חשיפת epitope. עם זאת, סריג בדרך כלל תלוי overexpression של חלבונים התמזגו מלאכותיים, אשר לא תשקף את קומפלקסים חלבונים אנדוגניים כפי PLA. התנאים חסימת את פרוטוקול PLA הם קריטיים כמו צבירה נוגדנים עלולה להתרחש ולהגדיל את הרקע. התנאים חסימת אלטרנטיבית ניתן למצוא גיליונות מוצר נוגדן. בקרות מתאימות עם השמטה הנוגדן הראשוני והמשני לספק מידע על מה אולי השתבש והם צריכים להיכלל תמיד. חשוב מסך נוגדנים שונים שייתן את הרקע לפחות כאשר הם משמשים לבד את האות הטוב ביותר כאשר הם ביחד. קיבוע של cells הוא קריטי כמו מעל לתקן עלול לגרום קומפלקסים חלבונים באופן מלא לפגל ו לבזות, ואילו קיבעון מספיק עלול להוביל לאובדן של קומפלקסים חלבונים במהלך השלבים של ההליך. זה יכול להיות נשלט על ידי הפחתת הריכוז של מקבע כדי 3% או על ידי הגבלת זמן קיבעון. עם זאת, קיבעון תלוי גם בשאלה האם נוגדנים העיקרית לזהות חלבונים מפוגל או לא. כמו טכניקה PLA רגיש מאוד, טיפול מיוחד נדרש כדי לשמור על פי הדגירה ותנאי המיקרו שווה בין מדגמים שונים. דוגמאות לא צריך להשאיר לייבוש על מקרה לפני השלב הסופי. ייבוש של הדגימות יכול להוביל רקע מוגבר. הסרה מלאה של פתרון חסימת חיוני גם כדי למנוע רקע. מאגרים לשטוף צריך תמיד להביא לטמפרטורת החדר לפני השימוש, כמו טמפרטורה נמוכה מאטה את תגובות אנזימטיות. עבור פתרון בעיות נוסף עיין במדריך של קיט. כדאי להשתמש כתמים לברר את לוקליזציה המשנה הסלולר של האות PLA (למשל DAPI, אקטין וכו &#39;). כאן השתמשנו DAPI (במדיום הרכבה) להכתים את הגרעינים. PLA תואם השימוש immunofluorescence עם נוגדנים כדי לקבוע את סוג התא או תא סלולרי (לא מוצג כאן). כימות מדויק יכול להיעשות על ידי ספירת אותות שימוש בתוכנות מסוימות (כלי Duolink תמונה, Olink Biosience). לסיכום אנו הדגימו כיצד להשתמש ב-PLA באתרו, באמצעות ערכת Duolink לזהות BMP איתות בתאי קבוע והציגו יתרונות: קל לשימוש, רגיש מאוד, לא רקע, יכולת ייחודית לכמת BMP פעיל איתות באתרם. המגבלה של החלת בטכניקה זו כדי ללמוד אינטראקציות חלבון שונה תלוי בזמינות ובאיכות של נוגדנים העיקרי לזהות את החלבונים תחת חקירה.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>GMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21710025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21063029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AutogenBioclear</td>
<td>7.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11149068</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Pyruvate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11360070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin / Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25300-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>16-well chamber slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lab-Tek</td>
<td>178599</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polysine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0138</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>a-pSmad1/5/8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling</td>
<td>9511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>a-Smad4 (B8) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
<td>sc-7966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dorsomorphin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>171260-10MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Recombinant Mouse BMP-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D</td>
<td>5020-BP-010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton-X 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>H5151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Detection Reagents (Orange)</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OLINK</td>
<td>92007-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>92004-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>92002-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Mounting Medium with DAPI</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>82040-0005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Wash Buffers Fluorescence</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>82049</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using in situ pla, a proximity ligation assay

BMPs אחראים מגוון רחב של השפעות ביולוגיות התפתחותיים. קולטנים BMP להפעיל (phosphorylate) Smad1/5/8 effectors, אשר לאחר מכן, בצורה מורכבת עם Smad4 ו translocate לגרעין שם הם מתפקדים גורמי תעתוק ליזום השפעות BMP במורד ספציפי 1. מסורתית חיסונית הקרינה טכניקות עם נוגדנים נגד phospho-Smad פפטידים התערוכה רגישות נמוכה, רקע גבוה להציע כימות ברוטו כפי שהם מסתמכים על עוצמת האות נוגדן במיוחד אם זה רגיש לאור ניאון. בנוסף, phospho-Smads לא יכול כל להיות מורכב עם Smad4 ועסק שעתוק פעיל. באתרו PLA היא טכנולוגיה מסוגל לאתר אינטראקציות חלבון עם סגוליות גבוהה ורגישות 2-4. זו טכנולוגיה חדשה לזוגות נוגדן הכרה עם הגברה של פונדקאית DNA של החלבון. זה יוצר אות מקומי, דיסקרטי בצורה של כתמים לחשוף את המיקום המדויק של האירוע הכרה. מספר אותות ניתן לספור והשוו מתן המדידה. אנו ליישם PLA באתרו, באמצעות ערכת Duolink, עם שילוב של נוגדנים המאפשר זיהוי של effectors איתות BMP ו phospho-Smad1/5/8 Smad4 רק כאשר אלה נמצאים בסמיכות כלומר במתחם, אשר מתרחשת רק עם איתות ההפעלה. זו אפשרה, לראשונה, את להדמיה ומדידה של BMP אנדוגני איתות עם ייחוד רגישות גבוהה בניסוי הזמן כמובן תחת גירוי BMP4.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

כאן אנו מראים כיצד להשתמש קשירת הסמיכות Assay (PLA), עם שילוב של נוגדנים לדמיין המוךפו&quot;גנטי שהולך עצם חלבון (BMP) איתות תאים קבוע. טכניקה זו אפשרה לנו לעקוב אחר הצטברות הגרעין של BMP אנדוגני מופעל מפעיל, מתחמי ולכמת רמות שלהם לאורך זמן תחת גירוי BMP4.

איתור של מפעיל איתות, מתחמי Downstream של BMP4 שימוש באתרו PLA, Assay קשירת הסמיכות

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

detection-signaling-effector-complexes-downstream-bmp4-using-situ-pla

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

31.7K Views.  Imperial College, Hammersmith Hospital. כאן אנו מראים כיצד להשתמש קשירת הסמיכות Assay (PLA), עם שילוב של נוגדנים לדמיין המוךפו"גנטי שהולך עצם חלבון (BMP) איתות תאים קבוע. טכניקה זו אפשרה לנו לעקוב אחר הצטברות הגרעין של BMP אנדוגני מופעל מפעיל, מתחמי ולכמת רמות שלהם לאורך זמן תחת גירוי BMP4.

Video: Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

מדידה של קצב חילוף החומרים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; באמצעות Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

זיהוי וניתוח של נזק לדנ&quot;א בשרירי שלד עכבר<em&gt; באתר</em&gt; שימוש בשיטת TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

פרוטוקול לlentiviral התמרה וניתוח במורד הזרם של המעיים Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

זיהוי של מטרות מירנה בתפוקה גבוהה באמצעות assay 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Here, we describe a procedure to visualize and quantify with high sensitivity the endogenous interactions between the endoplasmic reticulum and mitochondria in fixed cells. The protocol features an optimized in situ proximity ligation assay targeting the inositol 1,4,5-triphosphate receptor/glucose-regulated protein 75/voltage-dependent anion channel/cyclophilin D complex at the mitochondria-associated membrane interface.

לחקר endoplasmic reticulum ואת המיטוכונדריה אינטראקציות על ידי<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות בתאים קבועים

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires careful and in-depth analyses and quantification to capture as much information about the underlying events as possible. Spatial, temporal and intensity parameters intrinsic to Ca2+ signals such as frequency, duration, propagation, velocity and amplitude may provide some biological information required for intracellular signalling. High-resolution Ca2+ imaging typically results in the acquisition of large data files that are time consuming to process in terms of translating the imaging information into quantifiable data, and this process can be susceptible to human error and bias. Analysis of Ca2+ signals from cells in situ typically relies on simple intensity measurements from arbitrarily selected regions of interest (ROI) within a field of view (FOV). This approach ignores much of the important signaling information contained in the FOV. Thus, in order to maximize recovery of information from such high-resolution recordings obtained with Ca2+dyes or optogenetic Ca2+ imaging, appropriate spatial and temporal analysis of the Ca2+ signals is required. The protocols outlined in this paper will describe how a high volume of data can be obtained from Ca2+ imaging recordings to facilitate more complete analysis and quantification of Ca2+ signals recorded from cells using a combination of spatiotemporal map (STM)-based analysis and particle-based analysis. The protocols also describe how different patterns of Ca2+ signaling observed in different cell populations in situ can be analyzed appropriately. For illustration, the method will examine Ca2+ signaling in a specialized population of cells in the small intestine, interstitial cells of Cajal (ICC), using GECIs.

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) have radically changed how in situ Ca2+ imaging is performed. To maximize data recovery from such recordings, appropriate analysis of Ca2+ signals is required. The protocols in this paper facilitate the quantification of Ca2+ signals recorded in situ using spatiotemporal mapping and particle-based analysis.

יישומים של מיפוי-עתיים, טכניקות ניתוח חלקיקים לכמת Ca תאיים2 + איתות בחיי עיר

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female Anopheles mosquitoes are transmitted to humans via mosquito bites during blood feeding. The presence of sporozoites in the mosquito salivary glands thus defines mosquito infectiousness. To determine whether an Anopheles mosquito carries Plasmodium sporozoites, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method has been the standard tool to detect the Plasmodium circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of the sporozoites. In this method, the head along with the thorax of each mosquito is separated from the abdomen, homogenized, and subjected to a sandwich ELISA to detect the presence of CSP specific to Plasmodium falciparum and each of the two subtypes, VK210 and VK247, of Plasmodium vivax.This method has been used to study malaria transmission, including the seasonal dynamics of mosquito infection and the species of the major malaria vectors in the study sites.

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

This protocol describes a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect salivary gland sporozoites in mosquitoes. Using easily available monoclonal antibodies, the method enables cost-effective, high-throughput detection of mosquitoes carrying Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax. The method is suitable for malaria transmission research, including vector surveys.

איתור פלסמודיום ספורוזואיטים ביתושי אנופלס באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female ...

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

The mammalian global response to sealing deep tissue wounds is through scar formation and tissue contraction, mediated by specialized fascia fibroblasts. Despite the clinical significance of scar formation and impaired wound healing, our understanding of fascia fibroblast dynamics in wound healing is cursory due to the lack of relevant assays that enable direct visualization of fibroblast choreography and dynamics in complex environments such as in skin wounds. This paper presents a protocol to generate ex- situ skin scars using SCAD or &#34;SCar-like tissue in A Dish&#34; that emulate the complex environment of skin wounds. In this assay, 2 mm full-thickness skin is excised and cultured upside down in media for 5 days, during which scars and skin contractures develop uniformly. This methodology, coupled with fibroblast-lineage specific transgenic mouse models, enables visualization of individual fibroblast lineages across the entire wound repair process. Overall, this protocol aids&#160;researchers in understanding fundamental processes and mechanisms of wound repair,&#160;directly exploring the effects of modulators on wound healing outcomes.

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

This protocol describes the generation of a skin-fascia explant termed "SCar like tissue in A Dish" or SCAD. This model allows unprecedented visualization of single fibroblasts during scar formation.

הדמיה של התפתחות צלקות באמצעות בדיקת SCAD - בדיקה של צלקות עור לשעבר-situ

The mammalian global response to sealing deep tissue wounds is through scar formation and tissue contraction, mediated by specialized fascia fibroblasts. ...

בידוד משופר של בועיות חוץ-תאיות חיידקיות עבור מיקרוביוטה רב-אומית

Isolation and Purification of Bacterial Extracellular Vesicles from Human Feces Using Density Gradient Centrifugation

Bacterial extracellular vesicles (BEVs) are nanovesicles derived from bacteria that play an active role in bacteria-bacteria and bacteria-host communication, transferring bioactive molecules such as proteins, lipids, and nucleic acids inherited from the parent bacteria. BEVs derived from the gut microbiota have effects within the gastrointestinal tract and can reach distant organs, resulting in significant implications for physiology and pathology. Theoretical investigations that explore the types, quantities, and roles of BEVs derived from human feces are crucial for understanding the secretion and function of BEVs from the gut microbiota. These investigations also necessitate an improvement in the current strategy for isolating and purifying BEVs.
This study optimized the isolation and purification process of BEVs by establishing two density gradient centrifugation (DGC) modes: Top-down and Bottom-up. The enriched distribution of BEVs was determined in fractions 6 to 8 (F6-F8). The effectiveness of the approach was evaluated based on particle morphology, size, concentration, and protein content. The particle and protein recovery rates were calculated, and the presence of specific markers was analyzed to compare the recovery and purity of the two DGC modes. The results indicated that the Top-down centrifugation mode had lower contamination levels and achieved a recovery rate and purity similar to that of the Bottom-up mode. A centrifugation time of 7 h was sufficient to achieve a fecal BEV concentration of 108/mg.
Apart from feces, this method could be applied to other body fluid types with proper modification according to the differences in components and viscosity. In conclusion, this detailed and reliable protocol would facilitate the standardized isolation and purification of BEVs and thus, lay a foundation for subsequent multi-omics analysis and functional experiments.

מחבר זרקור: האצת המחקר על הפרדת שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות והטרוגניות 

This study describes a method to isolate and purify bacterial extracellular vesicles (BEVs) enriched from human feces via density gradient centrifugation (DGC), identifies the physical characteristics of BEVs from morphology, particle size, and concentration, and discusses the potential applications of the DGC approach in clinical and scientific research.