Bu araştırma, MRC ve BBSRC hibe tarafından finanse edilmektedir. Biz teknik ve faydalı öneri kurma yardımcı olmak için, Uppsala Üniversitesi Agata Ulf Landegren Lab Zieba ve Katerina Pardalis teşekkür ederiz. Teknik yardım ve sunum için Olink Biosience.

1. Hücre Kaplama ve BMP ile tedavi <ol><li> GMEM Kültür Neuro2a hücrelerin% 10 FBS ile desteklenmiş, 1x Sigara Esansiyel amino asitler (NEAM), 1x sodyum piruvat ve L-glutamin 1x. 16-kuyu oda slayt tripsin (% 0.05-EDTA) ve de her plaka 15,000-20,000 hücreleri kullanarak hücrelerin Böl. DMEM Kültür HEK293T veya Cos7 hücrelerin% 10 FBS, 1x L-glutamin ve 1x Penisilin / Streptomisin ile desteklenmiştir. % 70 etanol onları çeker ve 1 cm 2 kuyu çizmek Immedge kalem kullanarak polysine slaytlar sterilize edin. 50 inoküle tripsin (% 0.05-EDTA) ve de her plaka 20,000-25,000 hücreleri kullanarak hücrelerin Böl. </li><li> 37 ° hücreleri inkübe ° C nemlendirilmiş,% 5 CO2 inkübatör. </li><li> 24 saat sonra saat Neuro2a serum serbest GMEM (albümin% 0.1, 1x NEAM, 1x sodyum piruvat ve L-glutamin 1x ile desteklenmiş) ile veya HEK293T serum serbest DMEM (L-Glutamine ve 1x Penisilin / Streptomisin ile desteklenmiş) ile orta yerine / Cos7 ve hücreleri 2-3 saat süreyle inkübe Hücreleri kontrol grubu olarak kullanmak için, normal culturing koşullar altında (yani% 10 FBS) ile üç kuyu tutun. </li><li> Istenilen zaman için dorsomorphin (BMP yolun, 2 mcM inhibitörü) veya BMP4 (25 ng / ml) hücreleri (örneğin 10 dakika-1 saat) 5 davranın. </li></ol> 2. Fiksasyon ve Permeabilization <ol><li> Sabitleştirici,% 4 PFA hazırlayın. 100 ml PBS içinde% 4 çözelti hazırlamak için 4 g PFA tartılır. Çözüm Sıcak 50 ° C &#39;ye kadar açıktır. Kullanana kadar 4 0.22 mikron filtre ve mağaza ° C ile çözüm Filtresi. Taze fiksatif (en fazla 2 gün boyunca saklanan) kullanın. </li><li> Aspire kuyulardan orta ve 1xPBS bol suyla yıkayın. Bu hücrelerin ayrılması sonucu olarak hücreler üzerine doğrudan çözümler pipetle etmeyin. Odasının slaytlar kullanılması halinde, bir sonraki adıma geçmeden önce, odaları kaldırmak, ancak kuyuları etrafında silikon bırakın. </li><li> Ajitasyon olmadan, RT, 10 dakika süreyle 50 ul% 4 PFA ve inkübe ekle. </li><li> RT ajitasyon ile bir Coplin kavanoza 3 x 5 dakika hücreler PBS ile yıkayın. </li><li> PBS içinde% 0,5 &#39;lik Triton X-100 RT ajitasyon olmadan 10 dakika ile hücreleri davranın. </li><li> TBS içinde% 0.05 Tween 20 (TBS-T) ile hücrelerin RT ajitasyon ile bir Coplin kavanoza 3 x 5 dakika yıkayınız. </li></ol> 3. Engelleme <ol><li> TBS-T dokunun. De ortalama Duolink II Engelleme Çözüm (1x) bir damla ekleyin. </li><li> 37 1 saat önceden ısıtılmış nem kabini ° C slaytlar inkübe </li></ol> 4. Primer Antikorlar <ol><li> Mix ve 1:100 aP-Smad1/5/8 (tavşan poliklonal) sulandırmak ve Duolink II Antikor Dilüent (1x) 1:100 bir Smad4 (fare monoklonal). Kontrolleri için kullanılmak üzere aynı konsantrasyonlarda da aP-Smad1/5/8 hazırlayın ve bir Smad4 yalnız. </li><li> Slaytları Engelleme Çözüm dokunun. Mümkün olduğunca engelleme çözüm çıkarın, ancak hücrelerin antikor eklemeden önce kuruması için ekstra özen. Kuyular için antikor çözümleri 40 ul ekleyin. Birinde sadece ek bir negatif kontrol olarak Antikor Diluent ekleyin. </li></ol> 5. PLA probları <ol><li> Antikor Seyreltici iki PLA sondalar (Duolink II anti-Mouse EKSİ ve Duolink II anti-Tavşan PLUS) 01:05 sulandırınız. </li><li> Slaytlar birincil antikor çözüm dokunun. 1x Duolink II Yıkama Tamponu her slaytları 2 kez 5 dakika yıkayın RT ajitasyon ile Coplin kavanoza. </li><li> A slaytlar Yıkama Tamponu dokunun ve PLA prob çözümü eklemek (40 ul / iyi). 37 1 saat önceden ısıtılmış nem kabini ° C slaytlar inkübe </li></ol> 6. Ligasyonu <ol><li> Vortex Duolink II ligasyon stoku (5x) ve yüksek saflıkta su eklenir ve karıştırılır 01:05 sulandırmak. Su hacmi hesaplarken sadece kuyulardan karışımı ilave önce 01:40 son bir seyreltme eklenecektir ligaz hacmi dikkate alır. </li><li> Slaytlar PLA prob çözüm dokunun. 1x Yıkama Tamponu slaytlar RT ajitasyon ile bir Coplin kavanoz 2 kez için her biri 5 dakika yıkayınız. </li><li> Ligaz donma blok kullanarak derin dondurucuda (-20 ° C) dışarı atın. Ligaz 1:40 seyreltme ve vorteks ligasyon solüsyonu (6.1 hazırlanan) ekleyin. </li><li> A slaytlar Yıkama Tamponu dokunun ve ligasyon ligaz çözüm ekleyin her iyi (40 ul / iyi). 37 az 30 dakika önceden ısıtılmış nem kabini ° C slaytlar inkübe </li></ol> 7. Amplifikasyon Not: Açık duyarlı reaktifler. Işıktan koruyarak slaytları tutun. <ol><li> Yüksek saflıkta su eklenir ve karıştırılır Duolink II Amplifikasyon stok (5x) 01:05 sulandırınız. Su hacmi dikkate 1:80 inci karışımı yanı sıra daha önce nihai bir seyreltme eklenecektir Polimeraz hacmi hesaplanırkene kuyular. </li><li> Slaytları ligasyon ligaz çözüm dokunun. 1x Yıkama Tamponu slaytlar RT ajitasyon ile bir Coplin kavanoza 2 kez her biri 2 dakika yıkayın. </li><li> Bir dondurma blok kullanarak derin dondurucuda (-20 ° C) Polimeraz çıkarın. Polimeraz 1:80 seyreltme ve vorteks Amplifikasyon solüsyonu (7.1 &#39;de hazırlanan) ekleyin. </li><li> A slaytlar Yıkama Tamponu dokunun ve Amplifikasyon Polimeraz çözüm ekleyin her iyi (40 ul / iyi). 37 100 dk önceden ısıtılmış nem kabini ° C slaytlar inkübe </li></ol> 8. Görüntüleme için hazırlanması Not: Açık duyarlı reaktifler. Işıktan koruyarak slaytları tutun. <ol><li> Slaytları Amplifikasyon Polimeraz çözüm dokunun ve RT ajitasyon 1x Duolink II Yıkama Tamponu B ile bir Coplin kavanoza her 2 kez 10dk yıkayın. </li><li> 0,1 x Yıkama Tamponu B. slaytlar Dip </li><li> 16-iyi slayt tamamen silikon çıkarın. Lamel DAPI ile Orta Montaj Duolink II ~ 40μl ekleyin ve hafifçe bastırarak biraz bu yüzden kapak kayma altında hiç hava kabarcığı kalmamasına dikkat örnekleri üzerine yerleştirin. Düzeltme ve tırnak cilası kullanarak slayt lamel mühür. Görüntülemeye devam etmeden önce en az 15 dakika bekleyin. </li><li> Konfokal veya floresan mikroskobu ile numunelerin analiz edin. Dijital görüntü elde edin. </li></ol> 9 - Niceleme Not: Açık duyarlı reaktifler. Işıktan koruyarak slaytları tutun. <ol><li> Duolink ImageTool sinyal seviyesi ölçümü, görüntü sinyalleri saymak için kullanın. </li><li> Ölçümlerini karşılaştırın ve bir grafik yapmak. </li></ol> 10 Temsilcisi Sonuçlar Bir yerinde PLA deney sonucu olarak ayrık floresan noktalar gösterir. Sinyal konumu çalışılan spesifik proteinlerin bağlıdır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2631/2631fig1.jpg" /> Şekil 1 in situ PLA BMP4 stimülasyon sonrasında Neuro2a hücreleri üzerinde. Hücreler 2 mcM dorsomorphin (BMP yolun inhibitörü) (A) veya 25 ng / ml BMP4 ile tedavi edilen (B) için tedavi edilmeyen 60 dakika veya sol (CE). P-Smad1/5/8 ve Smad4 karşı antikorlar, A ve B tek başına aP-Smad1/5/8 (C) primer antikor ve Smad4 tek başına (D) veya primer ihmal aktif kompleksleri tespit etmek için kullanılan antikorlar (E), kontrol grubu olarak kullanılmıştır. Mavi: DAPI Kırmızı: PLA sinyal. Resimler Leica SP5 konfokal mikroskop ile elde edildi. (F) PLA sinyalleri Duolink ImageTool yazılımı ile sayıldı ve hücre başına çekirdeğinde noktalar ortalama sayısı grafikte sunulmuştur. (G) Neuro2a hücrelerinin tedavi edilmezse veya Dorsomorphin (2 mcM) ya da 60 dakika için BMP4 (25 ng / ml) ile tedavi edildi. Hücreler parçalanmış ve proteinleri SDS-PAGE ve yükleme gibi kontrolü aP-Smad1/5/8 ve a-PCNA immün analiz edildi. (*) Non-spesifik bir grup. AP-Smad1/5/8 antikor 3 farklı proteinler arasındaki farkı ayırt edemezsiniz Not Smad4 karmaşık mevcut.

<ol>
	<li>Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. o. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=morphogenetic+protein+receptors+and+signal+transduction.">morphogenetic protein receptors and signal transduction.</a> J Biochem. 147, 35-51 (2010).</li><li>Gustafsdottir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays+for+sensitive+and+specific+protein+analyses.">Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses.</a> Anal Biochem. 345, 2-9 (2005).</li><li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).</li><li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li><li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism.">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nat Chem Biol. 4, 33-41 (2008).</li><li>Baan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+proximity+ligation+detection+of+c-Jun/AP-1+dimers+reveals+increased+levels+of+c-Jun/Fra1+complexes+in+aggressive+breast+cancer+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo.">In situ proximity ligation detection of c-Jun/AP-1 dimers reveals increased levels of c-Jun/Fra1 complexes in aggressive breast cancer cell lines in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 1982-1990 .</li><li>Massinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interaction+of+DYX1C1+with+estrogen+receptors+suggests+involvement+of+hormonal+pathways+in+dyslexia.">Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia.</a> Hum Mol Genet. 18, 2802-2812 (2009).</li><li>Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+interactions+between+liver+X+receptor/retinoid+X+receptor+and+Sp1+modulate+the+transcriptional+induction+of+the+human+ATP+binding+cassette+transporter+A1+gene+by+oxysterols+and+retinoids.">Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids.</a> Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).</li></ol>

Bu video-makale üretimi yakınlığı ligasyonu deneyi prosedürü kullanılan bir reaktif kimin OLINK tarafından sponsor oldu.

In situ protein kompleksleri görselleştirme özellikle protein etkileşimleri ve protein modifikasyonu hücrelerin kendi yüzeyinden çekirdeğine bir sinyal göndermek için kullandıkları araçlardır sinyalizasyon çalışmaları için büyük bir talep. Önce immünofloresan in situ iki endojen proteinler arasındaki kompleksleri görselleştirmek ve ölçmek için mümkün olmamıştır. Co-antikor lokalizasyonu düşük çözünürlükte sergileyen ve gerçek etkileşim görselleştirmek için kullanılamaz. PLA araştırmacılar büyük bir başarı 6, 7 farklı sistemler kullanarak başladı yeni bir tekniktir. Burada, zamanla alt-BMP stimülasyon aktif smad etkileyiciler arasında endojen kompleksleri görselleştirmek için değil, aynı zamanda ölçmek için yalnızca PLA nasıl kullanılacağını göstermektedir. Biz Neuro2a ve (Şekil 1) elde etmek için farklı türler (fare bir Smad4 ve tavşan aP-Smad1/5/8) yükseltilmiş ticari antikorlar dayanıyordu de dahil olmak üzere farklı doku kültürü hücreleri kullanıldı. Bu yöntem tüm Smad4 ile aktif kompleksleri yapan olmayabilir fosforile Smad1/5/8 sadece varlığı değil, zaman içinde BMP efektör komplekslerinin aktivasyon ve ilk kez, bize izin verdi. Biz sinyalleri (Şekil 1F) sayılır ve aynı hücreler 8 (şekil 1G), immunoblotting elde miktarının ölçüm karşılaştırıldı. Biz noktaların sayısı zamanla seviyesini sinyal doğru bir karşılaştırmalı ölçme sağladığı sonucuna vardı. Tekniği de benzer sonuçlar veren diğer hücre hatları (HEK293T ve Cos7) (veriler gösterilmemiştir) uygulandı. Teknoloji ilkesi Duolink kiti ile sağlanan iki eşsiz probları dayanmaktadır. Her PLA prob, bir muhabir gibi davranan eşsiz bir sentetik oligonükleotid, bağlı ikincil bir antikor oluşur. Probların yakınlık tam yerde bu problar yakınlık bağlı olan DNA ligasyonu sağlar. DNA hibridizasyon ve ligasyon küçük (&lt;40 nm) ve bu nedenle sağlar oligonükleotidler, mesafe, etkileşim, yalnızca proteinlerin ligasyonu izin verebilirsiniz. Bağlandı DNA amplifiye ve güçlendirilmiş dizisi etiketli oligonükleotidler hibridizasyon ile tespit edilebilir. Amplifikasyonu DNA-DNA hibridizasyon prensipleri bağlı olarak özel ve bağlandı DNA ilk ligasyonu olay geliştirme birkaç kat amplifiye olarak da yüksek hassasiyet sağlar. Çoğaltılan DNA etiketli oligonükleotidler hibridizasyon tarafından algılanır ve görünür ve oldukça geniş bir nokta üretir. Gibi noktalar sayılabilir, PLA tam uzamsal bilgiyi (etkileşim olayların yerini) 2-4 bu olayların nicel değil, aynı zamanda objektif bir şekilde sadece sinyal sağlar. Protein etkileşimlerinin tespiti için istihdam edilen diğer teknikler co-immunoprecipitation, immunofluoresence ve Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) sayılabilir. Protein komplekslerinin izolasyon sağlayan Co-immunoprecipitation testlerin yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntem proteinleri tespit etmek için nispeten yüksek düzeyde ifade edilmesi gerektiği anlamına gelir immün eşlik ediyor. Yüksek arka plan veya boncuk bazı proteinlerin non-spesifik bağlanma Sorunları ortak immunoprecipitation aşmak için bazen zor. Buna ek olarak, ortak-immunoprecipitation deneyleri proteinlerin bir protein kompleksinin bir parçası olabilir algılama izin verir ancak birbirleri ile fiziksel olarak etkileşim çok yakın olduğunu ayırt edemez. Ayrıca, tek bir hücre, hücre içinde protein kompleksleri lokalizasyonu çözünürlük veya bilgi co-immunoprecipitations kantitatif sağlamak değildir. Immunofluoresence bir hücre veya bir hücre bölmesi protein kompleksleri, eş-varlık tespiti, bu nedenle üst üste yayılmış sinyalleri dayalı ve düşük uzaysal çözünürlüğe sahiptir ve protein etkileşimleri hakkında doğru bilgi sağlayamaz. Birkaç kat fark olduğunu ve sadece doğru veya PLA lekeler olarak ölçülebilir olamaz immunofluoresence sinyali sayısal görsel tahmini yapılabilir. FRET canlı hücrelerde protein kompleksleri görselleştirme sağlar ve antikorları için, epitopunun ihtiyaç ve pozlama üstesinden gelir. Ancak, genellikle FRET PLA gibi endojen protein kompleksleri yansıtmıyor olabilir yapay erimiş proteinler, aşırı ekspresyonu bağlıdır. PLA protokolü Engelleme koşulları antikor agregasyonu oluşur ve arka plan artırabilir kritik öneme sahiptir. Alternatif engelleme koşulları antikor ürün sayfaları bulunabilir. Primer ve sekonder antikor ihmal Uygun kontroller yanlış gitmiş olabilir bilgi vermek ve her zaman dahil edilmesi gerekir. Bunların bir arada olduğu zaman, bunlar tek başına kullanıldığında en az arka plan ve en iyi sinyal verecek farklı antikorları ekrana önemlidir. Cel, fiksasyonuprosedürün adımları sırasında yetersiz fiksasyon protein kompleksleri kaybına yol açabilir ise aşırı sabitleme, protein kompleksleri tam doğasını ve düşmeye neden olabilir ls kritik öneme sahiptir. Bu% 3 fiksatif konsantrasyonunu düşürerek veya fiksasyonun süresinin kısaltılması, kontrol edilebilir. Ancak, fiksasyon olmadığını primer antikorlar denatüre proteinler ya da farkındayız de bağlıdır. PLA tekniği çok hassas olduğu için, özel bakım kuluçka süreleri ve mikro koşulları farklı örnekleri arasında eşit tutmak için gereklidir. Örnekleri son adım önce herhangi bir durumda kuru bırakılmamalıdır. Numunelerin kurutulması artan arka yol açabilir. Engelleme çözümünün tümüyle kaldırılmasını da arka plan önlemek için kritik öneme sahiptir. , Düşük sıcaklıkta enzimatik reaksiyonları yavaşlatır yıkama tamponlar her zaman kullanmadan önce oda sıcaklığına getirilmiş olmalıdır. Daha fazla sorun giderme için Kit kılavuzuna başvurun. PLA sinyali (örneğin DAPI, aktin vb) alt hücresel yerleşimi tespit etmek için boyaların kullanımı için faydalıdır. Burada çekirdeklerin leke DAPI (montaj orta) kullandık. PLA, hücre tipi veya cep bölmesi (burada gösterilmemiştir) belirlemek için antikorlar ile immünofloresan kullanımı ile uyumludur. Doğru kantifikasyon sinyalleri ve özel bir yazılım kullanımı (Duolink Görüntü Aracı, Olink Biosience) sayım yapılabilir. Son derece hassas, kullanımı kolay, arka plan ve aktif BMP yerinde sinyal ölçmek için eşsiz bir yetenek: Sonuç olarak, BMP sabit hücrelerinde sinyalizasyon ve avantajları sundu algılamak için Duolink kiti kullanılarak, yerinde PLA nasıl kullanılacağını göstermiştir. Farklı protein etkileşimleri çalışmak için bu tekniği uygulayarak sınırlama soruşturma altında proteinleri tanıyan birincil antikor erişilebilirliği ve kalitesi bağlıdır.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>GMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21710025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21063029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AutogenBioclear</td>
<td>7.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11149068</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Pyruvate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11360070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin / Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25300-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>16-well chamber slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lab-Tek</td>
<td>178599</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polysine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0138</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>a-pSmad1/5/8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling</td>
<td>9511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>a-Smad4 (B8) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
<td>sc-7966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dorsomorphin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>171260-10MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Recombinant Mouse BMP-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D</td>
<td>5020-BP-010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton-X 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>H5151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Detection Reagents (Orange)</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OLINK</td>
<td>92007-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>92004-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>92002-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Mounting Medium with DAPI</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>82040-0005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Wash Buffers Fluorescence</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>82049</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using in situ pla, a proximity ligation assay

BMP, gelişimsel ve biyolojik etkileri geniş bir yelpazede sorumludur. BMP reseptörleri (phosphorylate) Smad4 ile karmaşık bir form ve BMP özel mansap etkileri 1 başlatmak için transkripsiyon faktörleri olarak işlev çekirdeğine yerini değiştirmek Smad1/5/8 etkileyiciler etkinleştirin. Geleneksel fosfor-smad peptidler karşı antikorlar ile immüno-floresans teknikleri, düşük duyarlılık, yüksek arka plan gösterirler ve bu floresan ışığa ise özellikle antikor sinyal yoğunluğu güveniyor brüt kantifikasyon sunuyoruz. Buna ek olarak, fosfor-Smads Smad4 karmaşık ve aktif transkripsiyon yapan. In situ PLA yüksek özgüllük ve duyarlılık 2-4 ile protein etkileşimleri tespit edebilen bir teknoloji. Bu yeni teknoloji, proteinin DNA vekil amplifikasyon çiftler antikor tanıma. Bu tanıma olayı tam konumunu açığa noktalar bir form lokalize, ayrık bir sinyal üretir. Sinyallerin sayısı ve bir ölçüm sağlayan mukayese edilebilir. Biz, bu sadece sinyalizasyon ile ortaya çıkan karmaşık bir yakınlık, yani sadece BMP sinyal etkileyiciler phospho-Smad1/5/8 ve Smad4 algılanmasını sağlar antikor bir kombinasyonu ile Duolink kiti kullanılarak, yerinde PLA uygulanan aktivasyonu. Bu ilk kez BMP4 uyarımı altında bir süre ders deneyde yüksek özgüllük ve duyarlılık ile sinyalizasyon endojen BMP görüntüleme ve ölçüm izin verdi.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Burada kemik morfogenetik protein (BMP) sabit hücreler sinyal görselleştirmek için antikor kombinasyonu ile yakınlık ligasyon Assay (PLA), nasıl kullanılacağını göstermektedir. Bu teknik bize BMP4 uyarımı altında efektör-kompleksleri aktif endojen BMP nükleer birikimi takip etmek ve zaman içinde bunların seviyelerini ölçmek için izin verdi.

Efektör-Kompleksleri kullanarak BMP4 Mansabında Sinyal Algılama In situ PLA, Proximity ligasyon Testi

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

detection-signaling-effector-complexes-downstream-bmp4-using-situ-pla

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

31.6K Görüntüleme.  Imperial College, Hammersmith Hospital. Burada kemik morfogenetik protein (BMP) sabit hücreler sinyal görselleştirmek için antikor kombinasyonu ile yakınlık ligasyon Assay (PLA), nasıl kullanılacağını göstermektedir. Bu teknik bize BMP4 uyarımı altında efektör-kompleksleri aktif endojen BMP nükleer birikimi takip etmek ve zaman içinde bunların seviyelerini ölçmek için izin verdi.

Video: Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Biyolojik Tahliller Manyetik Modülasyon Biyoalgılayıcı Sistemi kullanarak hızlı Homojen Algılama

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Biyoloji

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics: Sayısal ve Yapısal Değişmeler Algılama Tüm 24 İnsan Kromozomlar Aynı zamanda Roman OctoChrome BALIK Test kullanma

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Metabolik Oranı Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Respirometrik kullanarak

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Fare İskelet Kası Algılama ve DNA Hasar Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; TÜNEL Yöntemiyle

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

3&#39;LIFE Test kullanma Yüksek throughput miRNA Hedefleri tespiti

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Here, we describe a procedure to visualize and quantify with high sensitivity the endogenous interactions between the endoplasmic reticulum and mitochondria in fixed cells. The protocol features an optimized in situ proximity ligation assay targeting the inositol 1,4,5-triphosphate receptor/glucose-regulated protein 75/voltage-dependent anion channel/cyclophilin D complex at the mitochondria-associated membrane interface.

Endoplazmik retikulum ve mitokondri Etkileşimleri Çalışma ile<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi Sabit Hücrelerde

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires careful and in-depth analyses and quantification to capture as much information about the underlying events as possible. Spatial, temporal and intensity parameters intrinsic to Ca2+ signals such as frequency, duration, propagation, velocity and amplitude may provide some biological information required for intracellular signalling. High-resolution Ca2+ imaging typically results in the acquisition of large data files that are time consuming to process in terms of translating the imaging information into quantifiable data, and this process can be susceptible to human error and bias. Analysis of Ca2+ signals from cells in situ typically relies on simple intensity measurements from arbitrarily selected regions of interest (ROI) within a field of view (FOV). This approach ignores much of the important signaling information contained in the FOV. Thus, in order to maximize recovery of information from such high-resolution recordings obtained with Ca2+dyes or optogenetic Ca2+ imaging, appropriate spatial and temporal analysis of the Ca2+ signals is required. The protocols outlined in this paper will describe how a high volume of data can be obtained from Ca2+ imaging recordings to facilitate more complete analysis and quantification of Ca2+ signals recorded from cells using a combination of spatiotemporal map (STM)-based analysis and particle-based analysis. The protocols also describe how different patterns of Ca2+ signaling observed in different cell populations in situ can be analyzed appropriately. For illustration, the method will examine Ca2+ signaling in a specialized population of cells in the small intestine, interstitial cells of Cajal (ICC), using GECIs.

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) have radically changed how in situ Ca2+ imaging is performed. To maximize data recovery from such recordings, appropriate analysis of Ca2+ signals is required. The protocols in this paper facilitate the quantification of Ca2+ signals recorded in situ using spatiotemporal mapping and particle-based analysis.

Kendisinin geçici eşleme ve parçacık analiz teknikleri intrasellüler Ca sinyal2 + in Situ ölçmek için uygulamaları

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female Anopheles mosquitoes are transmitted to humans via mosquito bites during blood feeding. The presence of sporozoites in the mosquito salivary glands thus defines mosquito infectiousness. To determine whether an Anopheles mosquito carries Plasmodium sporozoites, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method has been the standard tool to detect the Plasmodium circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of the sporozoites. In this method, the head along with the thorax of each mosquito is separated from the abdomen, homogenized, and subjected to a sandwich ELISA to detect the presence of CSP specific to Plasmodium falciparum and each of the two subtypes, VK210 and VK247, of Plasmodium vivax.This method has been used to study malaria transmission, including the seasonal dynamics of mosquito infection and the species of the major malaria vectors in the study sites.

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

This protocol describes a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect salivary gland sporozoites in mosquitoes. Using easily available monoclonal antibodies, the method enables cost-effective, high-throughput detection of mosquitoes carrying Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax. The method is suitable for malaria transmission research, including vector surveys.