ويدعم العمل في المختبرات من المؤلفين من المنح المقدمة من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث وكندا ، والمعاهد الكندية للأبحاث الصحية ، وبرنامج كراسي البحث كندا. معتمد من قبل JL الزمالة من ديفوار جروب القطعة الموسيقية Membranaires Protéines قصر (GEPROM) من خلال التمويل من ان فون بحوث دي سانتي دو كيبيك.

1. الأولي : سلالات بكتيرية والخلايا الظهارية. وتجرى المناورات من الخلايا والبكتيريا جو معقم و مطهر ، تحت غطاء تدفق الصفحي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل حديثا في E. سلالات القولونية 2787 ، 2787Δ عايدة ، وC600 من المخزونات الجلسرين على مرق Lysogeny (LB) لوحات أجار (1 تريبتون ٪ ، و 0.5 ٪ كلوريد الصوديوم ، و 0.5 ٪ مستخلص الخميرة ، أغار 1.5 ٪) ، وتنمو بمعدل 37 درجة مئوية. لتقليل التباين في الفحص ، فإنه ينصح دائما استخدام سلالات مطلية حديثا ، وإبقاء الضغوط على 4 درجات مئوية على لوحات بتري مختومة فقط لمدة أقصاها أسبوعين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة HEP - 2 الخلايا (ATCC CCL - 23) في النسر ارتفاع الجلوكوز في Dulbecco متوسطة التعديل (DMEM) تستكمل مع المصل المعطل 10 ٪ الحرارة البقري (يتم تنفيذ تعطيل الحرارة عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة). خلال الثقافة الروتينية نضيف أيضا 10 U / البنسلين مل و 10 الستربتوميسين ميكروغرام / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا التهاب الكبد - 2 في 37 درجة مئوية في حاضنة زنزانة مع جو تحتوي على 5 ٪ CO 2. استخدام معيار إجراءات زراعة الخلايا للحفاظ على الخلايا ، والتي تزرع في 75 سم 2 وقوارير subcultured في كل مرة أن تصل إلى نقطة التقاء. نحن لدينا استخدام الخلايا المستزرعة حتى تصل 30-40 الممرات ومن ثم التخلص منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مقايسة عندما الخلايا HEP - 2 في قارورة 75 2 سم تقريبا تصل التقاء وبالتالي فهي مستعدة لفحص الالتزام. </li></ol> 2. DAY 1 : إعداد اللقاح والخلايا الظهارية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل - 2 HEP الخلايا في قارورة واحدة مع الفوسفات Dulbecco الدافئة مخزنة المالحة (DPBS : 8 ز / لتر كلوريد الصوديوم ، 0.2 غرام / بوكل L ، 0.2 غرام / لتر KH 2 PO 4 ، 0.21 غ / ل نا 2 هبو 4 : 7H 2 O) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحضين الخلايا مع التربسين 0.05 ٪ -- EDTA لمدة 5 دقائق قبل ان يضيف جديدا المتوسطة كاملة الدافئة. بعد إضافة المتوسطة الطازجة ، ومعلق الخلايا التي pipetting صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الطرد المركزي في 2000 دورة في الدقيقة خلية لمدة 5 دقائق وresuspend الكريات في DPBS وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في متوسطة جديدة تستكمل مع المصل 10 ٪ ولكن لا تحتوي على المضادات الحيوية ، وعلى تركيز خلايا 2x10 5 / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور ميللتر من تعليق خلية في ثلاث مجموعات من الآبار مكررة (واحد لكل سلالة) في وسط لوحة 24 جيدا واحتضان لوحة بين عشية وضحاها في خلية حاضنة الثقافة. ملاحظة : من المهم أن يكون جيدا decomplemented المصل والمضادات الحيوية التي يتم حذف بعد هذه المرحلة. قد فشل في القيام بذلك تقتل البكتيريا اصابة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلقيح one مستعمرة معزولة من كل سلالة بكتيرية (2787 ، 2787Δ عايدة وC600) في 5 مل من مرق LB (1 تريبتون ٪ ، و 0.5 ٪ كلوريد الصوديوم ، و 0.5 ٪ مستخلص الخميرة) وتنمو بين عشية وضحاها على 37 درجة مئوية مع اهتزاز قوي (180 دورة في الدقيقة ). </li></ol> 3. يوم 2 : العدوى من الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفقد الخلايا HEP - 2 تحت المجهر المقلوب للتأكد من أنها لا يقل عن 90 ٪ متكدسة والملوثة لا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسلت الخلايا مع DPBS الدافئة ، وإلى كل بئر ، إضافة 1 مل من المتوسط ​​الطازجة تستكمل مع المصل 10 ٪ ولكن لا تحتوي على المضادات الحيوية. أيضا إضافة جديدة لمتوسط ​​ثلاثة آبار دون الخلايا. وسيتم استخدام هذا لتحديد العدد الكلي للبكتيريا في قيحة لكل سلالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر (نانومتر OD 0،600) من الثقافات البكتيرية. إضافة قسامة كل ثقافة البكتيرية لمجموعة واحدة من الآبار التي تحتوي على تكرار التهاب الكبد - 2 الخلايا والخلايا بشكل جيد واحد لا تحتوي. عادة ، ونحن نستخدم وحدة الثقافة بين عشية وضحاها الموافق 10 6 وحدات تشكيل مستعمرة (كفو). ويمثل هذا التعدد من العدوى (وزارة الداخلية) من 5:01 (البكتيريا : الخلايا). على الرغم من أننا استخدام ثقافاتنا مباشرة بين عشية وضحاها ، بل هو أحيانا من المستحسن الطرد المركزي للبكتيريا وresuspend DPBS منهم في تجنب الآثار الضارة للجزيئات يفرزها موجودة في الثقافات بين عشية وضحاها (مثل cytotoxins ، على سبيل المثال) ملاحظة : وزارة الداخلية يمكن أن تتفاوت بين 100:1 و01:10. ارتفاع عائدات أعلى تقلب وزارة الداخلية والخلفية والبكتيريا سوف تميل إلى التمسك البلاستيكية من لوحة. انخفاض عائدات وزارة الداخلية أيضا التباين العالي. مرة واحدة يتم اختيار وزارة الداخلية ، لا بد أن تكون متسقة وإبقاء هذه وزارة الداخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا المصابة في الخلية الحاضنة الثقافة لمدة 3 ساعات في 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2. ملاحظة : ومن الممكن أيضا أن أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لوحة على سرعة منخفضة (على سبيل المثال 1000 x ج لمدة 1-2 دقيقة) ، من أجل جمع كل هذه البكتيريا على اتصال مباشر مع الخلايا. هذا يحتوي على فوائد إضافية تزامن العدوى ، والسماح للأقصر الأوقات الحضانة (ما لا يزيد عن 15-30 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة متوسطة من الخلايا المصابة والخلايا يغسل 3 مرات مع DPBS الدافئة. في هذه الخطوة ، يمكن عادة أن ينظر البكتيريا الملتصقة مع المجهر القياسية ونقوم بشكل روتيني هذا الاختيار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز إلى الخلايا وفصل البكالوريا التقيدteria ، إضافة 100 ميكرولتر من 1 ٪ تريتون X - 100 التي تحتوي على كل جانب من الخلايا. ويمكن استخدام المنظفات الأخرى (مثل سابونين على سبيل المثال). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم تضيف 900 ميكرولتر من LB المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس بلطف الإيقاف المتكررة التي تصل إلى أسفل وpipetting. وبالمثل الآبار دون الخلايا التي تحتوي على قيحة المتجانس بلطف. ملاحظة : بعض أنواع البكتيريا قد تكون حساسة جدا من المنظفات ، ونحن في هذه الحالة فصل الخلايا الظهارية التي الحضانة مع التربسين 0.05 ٪ -- لمدة 20 دقيقة EDTA عند 37 درجة مئوية. ويمكن أيضا خلايا البكتيريا مع التقيد يكون كشط من الآبار مع طرف ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد المسلسل 10 أضعاف التخفيفات للمعلقات من البكتيريا والتقيد به قيحة ومرق LB ميكرولتر 100 لوحة من 3 التخفيفات (عادة 1:1،000 التخفيفات ، و1:100،000 1:10،000) على آجار LB واحتضان ليلا 37 درجة مئوية . </li></ol> 4. اليوم 3 : كفو العد وعرض البيانات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد المستعمرات في الأطباق وحساب عدد من البكتيريا كفو والالتزام من اللقاح عن طريق حساب متوسط ​​كل سلسلة من التخفيفات. وينبغي أن تحسب لوحات فقط ما بين 1-30 المستعمرات. </li></ol> 5. ممثل النتائج : الجدول التالي يوضح نتائج نموذجية من CFU عد من البكتيريا وانضمت في الفترة من 3 قيحة التجارب التي أجريت على أيام مختلفة : <img src="/files/ftp_upload/2783/2783table1.jpg" alt="الجدول 1" /> يمكن الابلاغ عن نتائج مباشرة كما انضمت CFU ، كما هو مبين في الشكل 1A. منذ أحجام قيحة يمكن أن تختلف بين سلالات بسبب الاختلافات في معدلات النمو أو أخطاء pipetting ، غالبا ما يكون من المستحسن أن يقدم تقريرا عن نتائج كنسبة مئوية من البكتيريا الالتزام. ويمكن حساب نسبة البكتيريا الالتزام بقسمة عدد من البكتيريا CFU التزمت من قبل عدد من CFU من اللقاح ، كما هو مبين في الشكل 1B. قبل تنفيذ المتكررة ANOVA قياس واختبارات بعد Bonferroni لمقارنة جميع أعمدة 1B الشكل ، يمكننا أن نرى أن هناك فروق ذات دلالة إحصائية (P &lt;0.05) بين 2787 و 2787Δ عايدة ، وكذلك بين 2787 و C600 ، ولكن لا يوجد فرق كبير 2787Δ بين عايدة وC600. <img src="/files/ftp_upload/2783/2783fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. تمثيل النتائج على النحو CFU من البكتيريا الالتزام (A) أو نسبة مئوية من البكتيريا الالتزام (B) النسبة المئوية للانضمام لوحظ في كثير من الأحيان تعتمد كثيرا على انشاء التجريبية (وإلى حد أقل ، على المجرب). أهمية خاصة هي وزارة الداخلية وعدد من يغسل ، لذلك لا ينبغي أن تفسر النسبة حرفيا. يمكن للبكتيريا في قيحة تنمو في بعض الأحيان بشكل أسرع بكثير من البكتيريا في وجود خلايا ، انحراف حجم قيحة بالمقارنة مع العدد الإجمالي الحقيقي من البكتيريا في الآبار مع الخلايا. للتخفيف من حدة هذه المشكلة ، فمن المستحسن إما إلى : (ط) استخدام الآبار مع الخلايا لتحديد قيحة : هي المصنفة HEP - 2 الخلايا في بئر إضافية والمصابين. في نهاية الفحص ، بدلا من التخلص من طاف والغسيل ، و 100 ميكرولتر من تريتون 10 ٪ X - 100 يتم إضافتها إلى البئر. والخلايا ليز والمتجانس بلطف lysate تحتوي على البكتيريا وعدم التقيد التقيد - المتكررة التي تصل إلى أسفل وpipetting ؛ أو (ب) جمع supernatants من الخلايا المصابة في نهاية الفحص ، فضلا عن أن من supernatants ويغسل DPBS وتحديد عدد CFU في تلك supernatants المجمعة. هذا سوف تسفر عن عدد من CFU من البكتيريا غير الالتزام. ويمكن بعد ذلك أن نسبة البكتيريا انضمت يحسب بقسمة عدد من البكتيريا CFU الالتزام من خلال إضافة عدد من البكتيريا CFU الالتزام وعدم الالتزام بها. لتوضيح مدى متانة مقايسة ، يمكن لنا أن نقارن هذا البروتوكول مع إجراء مقايسة مع S4074 ، وهي ممرضة لاصقة سلالة من الخنازير الجنبية المشعشعة 7 ، حضنت مع خلايا المنشأ حديثا من القصبة الهوائية خنزير صغير خط الخلية ، NPTr 8. وبصرف النظر عن الاختلافات في وسائل الإعلام اللازمة لنمو البكتيريا وخلايا ، والفرق الوحيد هو أن البكتيريا المستخدمة لعدوى من تنامي ثقافة أضعافا مضاعفة ، وليس من ثقافة ثابتة التدريجي بين عشية وضحاها. مع أ. الجنبية من المهم أيضا للغاية لاحترام وزارة الداخلية من 10:01 وألا تتجاوز 3 ساعات من العدوى ، وإلا فإن إفراز السموم سوف يسبب موت الخلايا والتحيز في النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، هذه السلالة من ألف ويمكن بسهولة أن تلتزم الجنبية البلاستيك ولذلك فمن المهم استخدام خلايا متكدسة والتحقق بصريا أن الخلايا لا تتمزق قبالة.

<ol>
	<li>Kline, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesins+in+host-microbe+interactions.">Bacterial adhesins in host-microbe interactions.</a> Cell Host Microbe. 5, 580-580 (2009).</li><li>Cossart, P., Boquet, P., Normark, S., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+microbiology+emerging.">Cellular microbiology emerging.</a> Science. 271, 315-315 (1996).</li><li>Elsinghorst, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+invasion+by+gentamicin+resistance.">Measurement of invasion by gentamicin resistance.</a> Methods Enzymol. 236, 405-405 (1994).</li><li>Pizarro-Cerda, J., Lecuit, M., Cossart, P., Sansonetti, P., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cellular Microbiology. , 161-161 (2002).</li><li>Srivastava, A., Isberg, R. R., Sansonetti, P., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cellular Microbiology. , 179-179 (2002).</li><li>Benz, I., Schmidt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+an+adhesin+(AIDA-I)+involved+in+diffuse+adherence+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Cloning and expression of an adhesin (AIDA-I) involved in diffuse adherence of enteropathogenic Escherichia coli.</a> Infect Immun. 57, 1506-1506 (1989).</li><li>Charbonneau, M. E., Berthiaume, F., Mourez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+processing+is+not+essential+for+multiple+functions+of+the+Escherichia+coli+autotransporter+adhesin+involved+in+diffuse+adherence+(AIDA-I).">Proteolytic processing is not essential for multiple functions of the Escherichia coli autotransporter adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I).</a> J Bacteriol. 188, 8504-8504 (2006).</li><li>Jacques, M., Paradis, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesin-receptor+interactions+in+Pasteurellaceae.">Adhesin-receptor interactions in Pasteurellaceae.</a> FEMS Microbiol Rev. 22, 45-45 (1998).</li><li>Auger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+of+Actinobacillus+pleuropneumoniae+with+porcine+lung+and+tracheal+epithelial+cells.">Host-pathogen interactions of Actinobacillus pleuropneumoniae with porcine lung and tracheal epithelial cells.</a> Infect Immun. 77, 1426-1426 (2009).</li><li>Jacques, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+lipo-oligosaccharides+and+lipopolysaccharides+in+bacterial+adherence.">Role of lipo-oligosaccharides and lipopolysaccharides in bacterial adherence.</a> Trends Microbiol. 4, 408-408 (1996).</li><li>Nataro, J. P., Kaper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diarrheagenic+Escherichia+coli.">Diarrheagenic Escherichia coli.</a> Clin Microbiol Rev. 11, 142-142 (1998).</li><li>Jallat, C., Darfeuille-Michaud, A., Rich, C., Joly, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+clinical+isolates+of+diarrhoeogenic+Escherichia+coli:+diffusely+adhering+E.+coli+strains+with+multiple+adhesive+factors.">Survey of clinical isolates of diarrhoeogenic Escherichia coli: diffusely adhering E. coli strains with multiple adhesive factors.</a> Res Microbiol. 145, 621-621 (1994).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

يصف هذا البروتوكول معيارا مقايسة التقيد البكتيرية التي يمكن تعديلها لدراسة الغزو (مثل استخدام الجنتاميسين حماية مقايسة 3). عد من وحدات تشكيل مستعمرة يسمح الكمي ، وذلك بالمقارنة مع الأساليب التي تعتمد على تقنيات التصوير القياسية تحت المجهر ، مثل تلطيخ بالغيمزا....

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> الكاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> ارتفاع الجلوكوز DMEM </td><td> GIBCO - Invitrogen </td><td> 12430-054 </td></tr><tr><td> DDPBS </td><td> GIBCO - Invitrogen </td><td> 14190-144 </td></tr><tr><td> المصل النمو البقري </td><td> Hyclone </td><td> SH3054 </td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتوميسين </td><td> GIBCO - Invitrogen </td><td> 15140-148 </td></tr><tr><td> 24 لوحات جيدة </td><td> كورنينج </td><td> 3337 </td></tr><tr><td> تريتون X - 100 </td><td> فيشر العلمية </td><td> BP151 - 100 </td></tr></tbody></table>

in vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells

تسبب الالتهابات ، ويجب أن البكتيريا تستعمر المضيفة لهم. التعبير عن مسببات الأمراض البكتيرية الجزيئات المختلفة أو هياكل قادرة على تعزيز مرفق لاستضافة الخلايا 1. هذه التفاعلات تعتمد على adhesins مع مستقبلات سطح الخلية المضيفة أو البروتينات القابلة للذوبان ، بوصفها جسرا بين البكتيريا والمضيف. التصاق هو خطوة أولى حاسمة قبل الغزو و / أو إفراز السموم ، وبالتالي فإنه يعد حدثا رئيسيا للدراسة في المرضية البكتيرية. علاوة على ذلك ، انضمت البكتيريا كثيرا ما تدفع بشكل رائع صقل الاستجابات الخلوية ، والدراسات التي وضعن في ميدان 2 &#39;الميكروبيولوجيا الخلوية. المقايسات قوية لالتصاق البكتيريا في الخلايا المضيفة وغزوهم بالتالي تلعب دورا رئيسيا في الدراسات المرضية البكتيرية ومنذ فترة طويلة استخدمت في العديد من المختبرات الرائدة 3،4. وتمارس هذه المقايسات الآن من قبل معظم المختبرات تعمل على المرضية البكتيرية. هنا ، نحن تصف مقايسة التقيد القياسية توضح مساهمة من adhesin محددة. نستخدم سلالة القولونية 2787 5 ، سلالة الإنسان معربا عن Adhesin شاحنة نقل سيارات شارك في الانضمام منتشر (AIDA). كعنصر تحكم ، ونحن نستخدم سلالة طافرة تفتقر إلى الجين عايدة ، 2787Δ عايدة (F. بيرثيوم وMourez M. ، غير منشورة) ، وسلالة والمختبرات التجارية E. القولونية ، C600 (نيو إنجلاند Biolabs). وتترك هذه البكتيريا على الانضمام إلى الخلايا من يشيع استخدامها HEP - 2 خط الخلايا الظهارية البشرية. وقد تم هذا الاختبار على نطاق واسع أقل صفها قبل 6.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells at JoVE.com

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

هذا البروتوكول هو بسيط مقايسة التصاق البكتيريا التي تتكون في عد الأرقام من مستعمرة بكتيرية تشكيل الوحدات التي انضمت على الخلايا المستنبتة. درس مستقل للadhesin للمقايسة وقوية ، وتستخدم العديد من الاختلافات في معظم المختبرات تعمل على المرضية البكتيرية.

الفحص في المختبر من الالتصاق الجرثومي على الخلايا الظهارية الثدييات

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

in-vitro-assay-of-bacterial-adhesion-onto-mammalian-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

25.3K Views.  Groupe de Recherche sur les Maladies Infectieuses du Porc GREMIP, Faculte de medecine veterinaire. هذا البروتوكول هو بسيط مقايسة التصاق البكتيريا التي تتكون في عد الأرقام من مستعمرة بكتيرية تشكيل الوحدات التي انضمت على الخلايا المستنبتة. درس مستقل للadhesin للمقايسة وقوية ، وتستخدم العديد من الاختلافات في معظم المختبرات تعمل على المرضية البكتيرية.

Video: In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell culture assays are performed under aerobic conditions, these in vitro models may not accurately represent the in vivo environment in which the host-pathogen interactions take place. We have developed an in vitro model of infection that permits the coculture of bacteria and host cells under different medium and gas conditions. The Vertical Diffusion Chamber (VDC) model mimics the conditions in the human intestine where bacteria will be under conditions of very low oxygen whilst tissue will be supplied with oxygen from the blood stream. Placing polarized intestinal epithelial cell (IEC) monolayers grown in Snapwell inserts into a VDC creates separate apical and basolateral compartments. The basolateral compartment is filled with cell culture medium, sealed and perfused with oxygen whilst the apical compartment is filled with broth, kept open and incubated under microaerobic conditions. Both Caco-2 and T84 IECs can be maintained in the VDC under these conditions without any apparent detrimental effects on cell survival or monolayer integrity. Coculturing experiments performed with different C. jejuni wild-type strains and different IEC lines in the VDC model with microaerobic conditions in the apical compartment reproducibly result in an increase in the number of interacting (almost 10-fold) and intracellular (almost 100-fold) bacteria compared to aerobic culture conditions1. The environment created in the VDC model more closely mimics the environment encountered by C. jejuni in the human intestine and highlights the importance of performing in vitro infection assays under conditions that more closely mimic the in vivo reality. We propose that use of the VDC model will allow new interpretations of the interactions between bacterial pathogens and host cells.

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Performing cell culture assays for investigating bacterial adhesion and invasion under aerobic conditions is usually unrepresentative of the in vivo environment. A Vertical Diffusion Chamber model allows study of interactions of the human pathogen Campylobacter jejuni with intestinal epithelial cells under more in vivo-like conditions, resulting in enhanced bacterial invasion.

الغزو الجرثومي المعوي الخلايا الظهارية المعوية<em&gt; في المختبر</em&gt; تتعزز بشكل كبير عن طريق دائرة إنتشار عمودي الموديل

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

في المختبر المقايسة المشتركة لتقييم الهجرة العدلية المستحثة المسببة للأمراض عبر الظهارية

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

غرفة تدفق العدلات الإنسان التصاق الفحص

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

ثابت التصاق الفحص لدراسة إنتغرين تنشيط الخلايا اللمفية تي في

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Electroporation للمن المستجيبات البكتيرية وظيفية في خلايا الثدييات

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

في المختبر والمجراة نموذج لدراسة التصاق البكتيريا إلى سفينة ستريت تحت ظروف التدفق

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

فحص من التصاق تحت إجهاد القص لدراسة تي اللمفاويات-التصاق جزيء التفاعلات

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...