Trabajo en los laboratorios de los autores es apoyado por becas de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá, el Instituto de Investigación en Salud de Canadá, y el programa de Cátedras de Investigación de Canadá. JL es apoyado por una beca del Groupe d&#39;Étude des Membranaires Protéines (GEPROM) a través de la financiación del Fonds de Recherche en Santé du Québec.

1. Preliminar: Cepas bacterianas y células epiteliales. Manipulaciones de las células y las bacterias se realizado de forma aséptica, bajo una campana de flujo laminar. <ol><li> Recién aislar el E. coli 2787, 2787Δ Aida, y C600 de las existencias de caldo de glicerol Lisogenia (LB) placas de agar (1 triptona%, 0,5% de cloruro sódico, un 0,5% de extracto de levadura, 1,5% de agar) y crecer a 37 ° C. Para minimizar la variabilidad en el ensayo, se aconseja utilizar siempre las cepas recién plateado y para mantener las cepas a 4 ° C en placas de Petri sellada sólo por un máximo de un par de semanas. </li><li> Cultura células HEp-2 (ATCC CCL-23) en el modificado del medio altos de glucosa en Dulbecco Eagle (DMEM) suplementado con 10% inactivado por calor suero bovino (inactivación por calor se realiza a 56 ° C durante 30 min). Durante el cultivo de rutina, también se suman 10 U / ml de penicilina y estreptomicina 10 mg / ml. </li><li> Crecer células Hep-2 a 37 ° C en una celda de la incubadora con una atmósfera que contiene 5% de CO 2. Use los procedimientos estándar de cultivo celular para mantener las células, que se cultivan en 75 cm 2 frascos y se subcultivaron cada vez que llegan confluencia. Usamos nuestras células cultivadas hasta alcanzar 30 a 40 pasajes y luego los desecha. </li><li> Preparar un ensayo cuando las células HEp-2 en un matraz de 75 cm 2 son casi llegar a la confluencia y por lo tanto, están listos para un ensayo de adherencia. </li></ol> 2. DIA 1: Preparación del inóculo y las células epiteliales <ol><li> Lave la células HEp-2 en el matraz una vez con fosfato caliente de Dulbecco buffer salino (DPBS: 8 g / L NaCl, 0,2 g / KCl L, 0,2 g / L KH 2 PO 4, 0,21 g / L de Na 2 HPO 4: 7H 2 O) </li><li> Las células se incubaron con 0,05% de tripsina - EDTA durante 5 min antes de añadir medio fresco completo de calentamiento. Después de un nuevo medio, se añade, las células se resuspenden pipeteando arriba y hacia abajo. </li><li> Se centrifuga la suspensión celular a 2000 rpm durante 5 minutos y volver a suspender las pastillas en DPBS y centrifugar de nuevo. </li><li> Resuspender las células en medio fresco suplementado con 10% de suero, pero que no contengan antibióticos, a una concentración de 2x10 5 células / ml. </li><li> Semilla de un mililitro de suspensión celular en tres series de pocillos (uno para cada cepa) en el centro de una placa de 24 pocillos y se incuba la placa durante la noche en una celda de la cultura incubadora. Nota: Es importante que el suero a fondo decomplemented y que los antibióticos se han omitido después de esta etapa. De lo contrario, podría matar a las bacterias que infectan. </li><li> Inocular una colonia aislada de cada cepa bacteriana (2787, 2787Δ Aida y C600) en 5 ml de medio LB (triptona 1%, 0,5% de cloruro sódico, un 0,5% de extracto de levadura) y crecen durante la noche a 37 ° C con agitación vigorosa (180 rpm ). </li></ol> 3. DIA 2: La infección de las células <ol><li> Inspeccione las células HEp-2 bajo un microscopio invertido para cerciorarse de que son al menos el 90% confluentes y no contaminado. </li><li> Lavar las células con DPBS cálido y, a cada pocillo, añada 1 ml de medio fresco suplementado con 10% de suero, pero que no contengan antibióticos. También añade un nuevo medio de tres pozos sin células. Esto será utilizado para determinar el número total de bacterias en el inóculo de cada cepa. </li><li> Medir la densidad óptica a 600 nm (OD 0.600 nm) de los cultivos bacterianos. Agregar una alícuota de cada cultivo bacteriano a un conjunto de pocillos que contienen células Hep-2 y un bien que no contienen células. Por lo general, se utiliza un volumen de cultivo de una noche que corresponde a 10 6 unidades formadoras de colonias (ufc). Esto representa una multiplicidad de infección (MOI), de 5:1 (bacterias: las células). A pesar de que utilizan directamente los cultivos de una noche, a veces es recomendable centrifugar y resuspender las bacterias en DPBS para evitar los efectos nocivos de las moléculas secretadas presentes en los cultivos durante la noche (como citotoxinas, por ejemplo) Nota: El momento de inercia puede variar entre 100:1 y 01:10. MOI más alto rendimiento y una mayor variabilidad del fondo y las bacterias tienden a pegarse al plástico de la placa. Menor momento de inercia también produce una gran variabilidad. Una vez que una MOI que se elija, es imprescindible para ser coherentes y mantener este momento de inercia. </li><li> Se incuban las células infectadas en el cultivo celular incubadora durante 3 horas a 37 º C con CO2 al 5%. Nota: También es posible centrifugar brevemente la placa a baja velocidad (por ejemplo, 1.000 g durante 1-2 minutos), a fin de que todas las bacterias en contacto directo con las células. Esto tiene el beneficio añadido de la sincronización de la infección, y permitir menores tiempos de incubación (tan poco como 15-30 min). </li><li> Eliminar el medio de las células infectadas y se lavan las células 3 veces con DPBS caliente. En esta etapa, las bacterias adheridas por lo general se puede observar con un microscopio estándar y de manera rutinaria realizar esta comprobación. </li><li> Para lisar las células y separar la adherido bacrios, añadir 100 ml de 1% de Triton X-100 a cada pocillo que contiene las células. Detergentes se pueden utilizar otros (como la saponina, por ejemplo). </li><li> Se incuban las células durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego añadir 900 l de medio LB. </li><li> Suavemente homogeneizar la suspensión por las reiteradas hacia arriba y hacia abajo de pipeteo. Los pozos sin células que contienen el inóculo son igualmente suavemente homogeneizada. Nota: Algunas de las bacterias puede ser muy sensible a los detergentes, en ese caso, separar las células epiteliales de incubación con 0,05% de tripsina - EDTA durante 20 minutos a 37 ° C. Las células con bacterias adheridas también puede ser raspado de los pozos con una punta de la pipeta. </li><li> Prepare serie de 10 diluciones de las suspensiones de bacterias adheridas e inóculo con caldo de LB y placa de 100 l de 3 diluciones (por lo general las diluciones 1:1.000, 1:10.000 y 1:100.000) en agar LB e incubar durante la noche a 37 ° C . </li></ol> 4. DIA 3: contar ufc y presentación de datos. <ol><li> Contar las colonias en las placas y calcular el número de UFC de bacterias adheridas y del inóculo por el promedio de cada serie de diluciones. Placas sólo con entre 10 a 300 colonias deben ser contados. </li></ol> 5. Los resultados representativos: La siguiente tabla muestra los resultados típicos de ufc recuento de bacterias adheridas y el inóculo de 3 experimentos realizados en días diferentes: <img src="/files/ftp_upload/2783/2783table1.jpg" alt="Tabla 1" /> Los resultados pueden ser reportados directamente adherido ufc, como se muestra en la Figura 1A. Dado que el tamaño de inóculo puede variar entre cepas debido a las diferencias en las tasas de crecimiento o los errores de pipeteo, a menudo es recomendable informar de los resultados como porcentaje de bacterias adheridas. El porcentaje de bacterias adheridas se puede calcular dividiendo el número de UFC de bacterias adheridas por el número de ufc del inóculo, como se muestra en la Figura 1B. Al realizar una medida repetidas ANOVA y Bonferroni pruebas post-para comparar todas las columnas de la Figura 1b, se puede observar que existen diferencias significativas (p &lt;0,05) entre 2787 y 2787Δ Aida, así como entre 2787 y el C600, pero no hubo diferencias significativas 2787Δ entre Aida y C600. <img src="/files/ftp_upload/2783/2783fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Representación de los resultados en UFC de bacterias adheridas (A) o el porcentaje de bacterias adheridas (B) El porcentaje de cumplimiento observado con frecuencia es muy dependiente del montaje experimental (y, en menor medida, por el experimentador). De particular importancia son las MOI y el número de lavados, por lo que el porcentaje no debe interpretarse literalmente. Las bacterias en el inóculo a veces puede crecer mucho más rápido que las bacterias en la presencia de células, sesgando el tamaño del inóculo en comparación con el número total real de bacterias en los pozos con células. Para solucionar este problema, se recomienda que sea: (i) el uso de pozos con las células para determinar el inóculo: HEp-2 células se siembran en otros así y se infecta. Al final del ensayo, en lugar de desechar el sobrenadante y lavar, 100 l de 10% de Triton X-100 se añade a la fuente. Las células se lisan y el lisado contiene bacterias adheridas y no adheridas-es ligeramente homogeneizada por las repetidas hacia arriba y hacia abajo pipeteo;. O (ii) recoger los sobrenadantes de las células infectadas al final del ensayo, así como los sobrenadantes de los lavados DPBS y determinar el número de ufc en los sobrenadantes combinados. Esto dará lugar a que el número de UFC de bacterias no adheridas. El porcentaje de bacterias adheridas se puede calcular dividiendo el número de UFC de bacterias adheridas por la adición de la cantidad de UFC de bacterias adheridas y no adheridas. Para ilustrar la solidez de la prueba, podemos comparar este protocolo con el ensayo realizado con el S4074, una cepa porcina patógenos adhesiva de Actinobacillus pleuropneumoniae 7, se incubaron con células de una recientemente creada línea de células traqueales lechones, NPTR 8. Aparte de las diferencias en los medios de comunicación necesarios para el crecimiento de las bacterias y las células, la única diferencia es que las bacterias utilizan para la infección son de una cultura de crecimiento exponencial, y no de un cultivo de una noche de la fase estacionaria. Con A. pleuropneumoniae también es muy importante respetar una MOI de 10:1 y de no más de 3 horas de la infección, de lo contrario la secreción de toxinas causa la muerte celular y el sesgo de los resultados. Además, esta cepa de A. pleuropneumoniae puede fácilmente se adhieren al plástico por lo que es importante la utilización de células confluentes y comprobar visualmente que las células no están mudando.

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	<li>Kline, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesins+in+host-microbe+interactions.">Bacterial adhesins in host-microbe interactions.</a> Cell Host Microbe. 5, 580-580 (2009).</li><li>Cossart, P., Boquet, P., Normark, S., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+microbiology+emerging.">Cellular microbiology emerging.</a> Science. 271, 315-315 (1996).</li><li>Elsinghorst, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+invasion+by+gentamicin+resistance.">Measurement of invasion by gentamicin resistance.</a> Methods Enzymol. 236, 405-405 (1994).</li><li>Pizarro-Cerda, J., Lecuit, M., Cossart, P., Sansonetti, P., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cellular Microbiology. , 161-161 (2002).</li><li>Srivastava, A., Isberg, R. R., Sansonetti, P., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cellular Microbiology. , 179-179 (2002).</li><li>Benz, I., Schmidt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+an+adhesin+(AIDA-I)+involved+in+diffuse+adherence+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Cloning and expression of an adhesin (AIDA-I) involved in diffuse adherence of enteropathogenic Escherichia coli.</a> Infect Immun. 57, 1506-1506 (1989).</li><li>Charbonneau, M. E., Berthiaume, F., Mourez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+processing+is+not+essential+for+multiple+functions+of+the+Escherichia+coli+autotransporter+adhesin+involved+in+diffuse+adherence+(AIDA-I).">Proteolytic processing is not essential for multiple functions of the Escherichia coli autotransporter adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I).</a> J Bacteriol. 188, 8504-8504 (2006).</li><li>Jacques, M., Paradis, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesin-receptor+interactions+in+Pasteurellaceae.">Adhesin-receptor interactions in Pasteurellaceae.</a> FEMS Microbiol Rev. 22, 45-45 (1998).</li><li>Auger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+of+Actinobacillus+pleuropneumoniae+with+porcine+lung+and+tracheal+epithelial+cells.">Host-pathogen interactions of Actinobacillus pleuropneumoniae with porcine lung and tracheal epithelial cells.</a> Infect Immun. 77, 1426-1426 (2009).</li><li>Jacques, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+lipo-oligosaccharides+and+lipopolysaccharides+in+bacterial+adherence.">Role of lipo-oligosaccharides and lipopolysaccharides in bacterial adherence.</a> Trends Microbiol. 4, 408-408 (1996).</li><li>Nataro, J. P., Kaper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diarrheagenic+Escherichia+coli.">Diarrheagenic Escherichia coli.</a> Clin Microbiol Rev. 11, 142-142 (1998).</li><li>Jallat, C., Darfeuille-Michaud, A., Rich, C., Joly, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+clinical+isolates+of+diarrhoeogenic+Escherichia+coli:+diffusely+adhering+E.+coli+strains+with+multiple+adhesive+factors.">Survey of clinical isolates of diarrhoeogenic Escherichia coli: diffusely adhering E. coli strains with multiple adhesive factors.</a> Res Microbiol. 145, 621-621 (1994).</li></ol>

Este protocolo describe un ensayo estándar de la adhesión de bacterias que pueden ser modificados para estudiar la invasión (por ejemplo, usando gentamicina ensayo de protección de 3). El recuento de unidades formadoras de colonias permite cuantificar, en comparación con los enfoques de confiar en las técnicas de visualización estándar bajo un microscopio, como la tinción de Giemsa. Este último sólo da una visión cualitativa de la adherencia, pero es a menudo un complemento útil ya que se pueden ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Elevados de glucosa en DMEM </td><td> GIBCO-Invitrogen </td><td> 12430-054 </td></tr><tr><td> DDPBS </td><td> GIBCO-Invitrogen </td><td> 14190-144 </td></tr><tr><td> Suero de crecimiento bovino </td><td> Hyclone </td><td> SH3054 </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> GIBCO-Invitrogen </td><td> 15140-148 </td></tr><tr><td> Placas de 24 pocillos </td><td> Corning </td><td> 3337 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP151-100 </td></tr></tbody></table>

in vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells

Para causar infecciones, las bacterias deben colonizar su anfitrión. Los patógenos bacterianos expresan diversas moléculas o estructuras capaces de fomentar el apego a las células huésped 1. Estas adhesinas se basan en la interacción con los receptores de superficie de la célula huésped o proteínas solubles que actúan como un puente entre la bacteria y el huésped. La adhesión es un primer paso crítico antes de la invasión y / o la secreción de toxinas, por lo que es un evento clave para ser estudiado en la patogénesis bacteriana. Además, las bacterias adheridas a menudo inducen a exquisitamente afinado la respuesta celular, los estudios de los cuales han dado a luz al campo de la 2 &#39;microbiología celular. Ensayos robusto para la adhesión bacteriana a las células huésped y su invasión por lo tanto, desempeñan un papel clave en los estudios de la patogénesis bacteriana y han sido utilizados en muchos laboratorios pioneros 3,4. Estos ensayos se practica actualmente por la mayoría de los laboratorios que trabajan en la patogénesis bacteriana. Aquí se describe un ensayo de adherencia tipo que ilustren la contribución de un determinado adhesina. Nosotros usamos la cepa de Escherichia coli 2787 5, una cepa patógena humana que expresa la autotransporter Adhesin que participan en la adhesión difusa (AIDA). Como control, se utiliza una cepa mutante que carecen del gen aida, 2787Δ Aida (F. Berthiaume y Mourez M., inédito), y una cepa de laboratorio comercial de E. coli, C600 (New England Biolabs). Las bacterias son de izquierda a adherirse a las células de los comúnmente utilizados HEp-2 la línea humana de células epiteliales. Este ensayo no ha sido tan ampliamente descritas antes de las 6.

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In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

Este protocolo es un ensayo simple adhesión bacteriana consiste en contar el número de unidades formadoras de colonias bacterianas que se adhieren a las células cultivadas. El ensayo es sólida, independiente de la adhesina estudiados, y numerosas variantes se utilizan en la mayoría de los laboratorios que trabajan en la patogénesis bacteriana.

Ensayo in vitro de la adhesión bacteriana a las células epiteliales de mamíferos

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

25.5K vistas.  Groupe de Recherche sur les Maladies Infectieuses du Porc GREMIP, Faculte de medecine veterinaire. Este protocolo es un ensayo simple adhesión bacteriana consiste en contar el número de unidades formadoras de colonias bacterianas que se adhieren a las células cultivadas. El ensayo es sólida, independiente de la adhesina estudiados, y numerosas variantes se utilizan en la mayoría de los laboratorios que trabajan en la patogénesis bacteriana.

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Investigación

Inmunología e Infección

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Grano de agregación Los ensayos para la caracterización de Putativos Moléculas de Adhesión Celular

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Bioingeniería

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

La investigación de los efectos de los probióticos en antineumocócica Colonización El uso de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo de adherencia

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Materiales biomiméticos para caracterizar las interacciones bacteria-huésped

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin acquisition at the bacterial cell surface plays in resistance to the host immune system. Flow cytometry experiments identified human plasma vitronectin as a ligand for the bacterial receptor outer membrane protein H of Haemophilus influenzae type f. An enzyme-linked immunosorbent assay was employed to characterize the protein-protein interactions between purified recombinant protein H and vitronectin, and binding affinity was assessed using bio-layer interferometry. The biological importance of the binding of vitronectin to protein H at the bacterial cell surface in evasion of the host immune response was confirmed using a serum resistance assay with normal and vitronectin-depleted human serum. The importance of vitronectin in bacterial adherence was analyzed using glass slides with and without vitronectin coating, followed by Gram staining. Finally, bacterial adhesion to human alveolar epithelial cell monolayers was investigated. The protocols described here can be easily adapted to the study of any bacterial species of interest.

This report describes protocols for characterizing interactions between bacterial outer membrane proteins and the human complement regulator vitronectin. The protocols can be used to study the binding reactions and biological function of vitronectin in any bacterial species.

Ensayos para estudiar el rol de vitronectina en la adhesión bacteriana y resistencia de suero

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Ensayo de adhesión dinámico para el análisis funcional de las terapias anti-adherencia en enfermedad inflamatoria intestinal

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Adhesion of Candida parapsilosis to Bovine Serum Albumin under Fluid Shear

C. parapsilosis (Cp) is an emerging cause of bloodstream infections in certain populations. The&#160;Candida clade, including Cp, is increasingly developing resistance to the first and the second line of antifungals. Cp is frequently isolated from hands and skin surfaces, as well as the GI tract. Colonization by Candida predisposes individuals to invasive bloodstream infections. To successfully colonize or invade the host, yeast must be able to rapidly adhere to the body surfaces to prevent elimination by host defense mechanisms. Here we describe a method to measure adhesion of Cp to immobilized proteins under physiologic fluid shear, using an end-point adhesion assay in a commercially available multichannel microfluidic device. This method is optimized to improve reproducibility, minimize subjectivity, and allow for the fluorescent quantification of individual isolates. We also demonstrate that some clinical isolates of Cp show increased adhesion when grown in conditions mimicking a mammalian host, whereas a frequently used lab strain, CDC317, is non-adhesive under fluid shear.

Adhesion of Candida parapsilosis to Bovine Serum Albumin under Fluid Shear

Adhesion is an important first step in colonization and pathogenesis for Candida. Here, an in vitro assay is described to measure adhesion of C. parapsilosis isolates to immobilized proteins under fluid shear. A multichannel microfluidics device is used to compare multiple samples in parallel, followed by quantification using fluorescence imaging.

C. parapsilosis (Cp) is an emerging cause of bloodstream infections in certain populations. The&#160;Candida clade, including Cp, is increasingly ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in bacterial infections and constitutes a hallmark of potential threat. Therefore, examining the adherence of bacteria to host cells can be used as a component of bacterial threat assessment. A standard method for enumerating bacterial adherence to host cells is to co-incubate bacteria with host cells, harvest the adherent bacteria, plate the harvested cells on solid media, and then count the resultant colony forming units (CFU). Alternatively, bacterial adherence to host cells can be evaluated using immunofluorescence microscopy-based approaches. However, conventional strategies for implementing these approaches are time-consuming and inefficient. Here, a recently developed automated fluorescence microscopy-based imaging method is described. When combined with high-throughput image processing and statistical analysis, the method enables rapid quantification of bacteria that adhere to host cells. Two bacterial species, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa and Gram-positive Listeria monocytogenes and corresponding negative controls, were tested to demonstrate the protocol. The results show that this approach rapidly and accurately enumerates adherent bacteria and significantly reduces experimental workloads and timelines.

Detection of host-bacterial pathogen interactions based on phenotypic adherence using high-throughput fluorescence labeling imaging along with automated statistical analysis methods enables rapid evaluation of potential bacterial interactions with host cells.

Detección automatizada y de alto rendimiento de la adherencia bacteriana a las células huésped

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

La cuantificación de la adhesividad de la célula endotelial<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Biología

In Vitro Adhesion Assay to Detect the Adherence of Cancer Cells to Neutrophil Extracellular Traps

Najmeh, S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52687">Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate an assay utilizing fluorescence microscopy to detect the adhesion of cancer cells to neutrophil extracellular traps (NETs). In the test wells, there is a notable increase in the number of fluorescently labeled cancer cells adhering to NETs, whereas wells treated with DNase exhibit reduced cancer cell adhesion to NETs.

Ensayo de adhesión in vitro para detectar la adherencia de las células cancerosas a las trampas extracelulares de neutrófilos

1. NET-Cancer Cell Static Adhesion Assay

	Add 100 &#956;l of the previously obtained NET stock per well in a 96-well flat bottom plate and allow to coat ...

Ensayo in vitro de la adhesión bacteriana a las células epiteliales de mamíferos

Resumen

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Capítulos en este video

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

Grano de agregación Los ensayos para la caracterización de Putativos Moléculas de Adhesión Celular

La investigación de los efectos de los probióticos en antineumocócica Colonización El uso de un

Materiales biomiméticos para caracterizar las interacciones bacteria-huésped

Ensayos para estudiar el rol de vitronectina en la adhesión bacteriana y resistencia de suero

Ensayo de adhesión dinámico para el análisis funcional de las terapias anti-adherencia en enfermedad inflamatoria intestinal

Adhesion of Candida parapsilosis to Bovine Serum Albumin under Fluid Shear

Detección automatizada y de alto rendimiento de la adherencia bacteriana a las células huésped

La cuantificación de la adhesividad de la célula endotelial

Ensayo de adhesión in vitro para detectar la adherencia de las células cancerosas a las trampas extracelulares de neutrófilos