توفر هذه الطريقة اكتشافا سريعا وعالي الإنتاجية لبكتيريا الالتزام بالخلايا المضيفة. بالمقارنة مع طرق الطلاء التقليدية ، فإنه يقلل من الوقت العملي اللازم للقياس الكمي للبكتيريا الملتصقة. هذه التقنية مؤتمتة وموفرة للوقت وقابلة للاستنساخ للغاية.
كما أنها تطبق على نطاق واسع على حد سواء على حد سواء لمعظم الخلايا المضيفة. هذه الطريقة، هناك واضحة جدا. بالنسبة للتجربة الأولى ، يجب تحسين ظروف مثل تعدد العدوى ، وكذلك وقت الحضانة المشتركة للبكتيريا المضيفة.
حصاد الثقافات البكتيرية الأولى في مرحلة أسية عن طريق الطرد المركزي في 13،000 مرة G لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل البليت الخلايا مع برنامج تلفزيوني واحد ملليلتر، resuspend لوحة البكتيرية في برنامج تلفزيوني واحد ملليلتر. تحديد تركيزات التعليق البكتيري عن طريق قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر.
ثم، لتلطيخ تعليق البكتيرية، إضافة اثنين من microliters من 500 أضعاف تتركز الأسهم الخضراء أو الحمراء صبغ تلطيخ في ملليلتر واحد من التعليق البكتيري لتخفيف الصبغة أضعاف واحدة. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع دوران لطيف في الظلام. بعد 30 دقيقة، طرد البكتيريا الملطخة في 13، 000 مرة G لمدة دقيقتين وإعادة إنفاق بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني.
جمع الخلايا البكتيرية الملطخة عن طريق الطرد المركزي في 13،000 مرة G لمدة دقيقتين. إعادة ضغط بيليه في ملليلتر واحد من F12 K المتوسطة الطازجة وقياس الكثافة البصرية لكل ثقافة في 600 نانومتر. بعد ذلك تمييع الثقافات إلى التركيزات المطلوبة على أساس تعدد العدوى وتركيز الخلايا المضيفة.
لالتحواز البكتيرية المقايسة، وغسل طبقات أحادية الخلية A549 المستزرعة سابقا ثلاث مرات عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني دافئ إلى كل بئر وماصة بلطف صعودا وهبوطا. ثم تجاهل برنامج تلفزيوني. بدلا من ذلك، بعد إضافة برنامج تلفزيوني، انتظر لمدة 10 ثوان ومن ثم إزالة برنامج تلفزيوني باستخدام فراغ.
لتحديد الحركية من الارتباط البكتيري، تراكب الخلايا مع 100 ميكرولتر من التركيزات المطلوبة من التعليق البكتيري مع تعدد مختلف من العدوى. قم بتدفير البكتيريا واحتضان خلايا A549 المصابة عند 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة إضافية. إزالة البكتيريا غير المنضمة عن طريق غسل طبقات أحادية خمس مرات مع برنامج تلفزيوني دافئ كما هو موضح.
بعد ذلك ، قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 4٪ من الفورمالديهايد في جميع آبار لوحة بئر 96 على الجليد. بعد 15 دقيقة، اغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة محلول التثبيت. وصمة عار في النوى مع 50 نانوغرام لكل ملليلتر وصمة عار DAPI لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، وتغطية الخلايا A549 المصابة مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لتجنب التجفيف ومن ثم تخزين لوحة في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى يومين في الظلام أو المضي قدما للتصوير. للحفاظ على سلامة البيانات، اختر عشوائيا ويدويا خمسة مواقع لكل بئر لالتقاط الصور بمعدل تكبير 20 مرة. التقاط الصور الفلورية للبكتيريا تحت قنوات GFP، A549 الخلايا تحت DAPI، وبالنسبة للبكتيريا الملطخة صبغة الفلورسنت الأحمر استخدام PE Si خمس قنوات.
تعيين المعلمات من الكرة المتداول لتجانس والسيارات قياس نقطة انتشار وظيفة من deconvolution الصورة على أساس الهدف لتحقيق دقة أفضل. قياس كثافة الفلورسينس من الخلايا المضيفة والبكتيريا. تعيين أضعف كثافة مضان من الخلايا المضيفة والبكتيريا كعتبات لعدد الخلايا والعد جميع البكتيريا القريبة من خلية مضيفة ضمن مسافة 15 ميكرومتر كبكتيريا الالتزام.
بمجرد أن يتم حساب الخلايا من جميع الصور الآلية ، قم بتحليل القراءات الحرجة ، مثل تعداد الخلايا المضيفة ، وأحجام الخلايا وأشكالها ، وإجمالي عدد البكتيريا ، ومتوسط الحساب البكتيري لكل خلية مضيفة ، وهو أهم مؤشر لتحديد الالتزام البكتيري. بعد ساعة واحدة من الحضانة المشتركة، انضمت pseudomonas aeruginosa سلالة PAO1 إلى خلايا A549 بطريقة تعتمد على الجرعة. ولوحظت أيضا نتائج مماثلة عندما البكتيريا الليستيريا أحادية النسيلة إيجابية الغرام وعصيات السيطرة السلبية subtilis.
صورة تمثيلية للمضيف المنضم P aeruginosa تجزئة يوضح سهولة عد الخلايا البكتيرية باستخدام هذا البروتوكول. وتشمل نتائج التحليلات الآلية عدد الخلايا البكتيرية والمضيفة، ومتوسط عدد البكتيريا لكل خلية مضيفة وأحجام الخلايا المضيفة والمناطق التي تمثل حالة صحة الخلية المضيفة، ومستوى الالتزام البكتيري وسمية الخلايا البكتيرية. وبصرف النظر عن خلايا A549، تم اختبار HUVECs أيضا لفحص الالتزام.
كانت سيراتيا روبيدايا وبكتيريا العقديات agalactiae ملتزمة HUVEC ، ولكن ليس لخلايا A549 ، والذي يدل على الكشف الفعال وملاءمة المضيفين متعددة لدراسة التفاعلات البكتيريا المضيفة باستخدام هذه الطريقة. يجب أن تصل الخلايا المضيفة إلى حوالي 90 إلى التقاء 100٪ لتقليل التزام البكتيريا غير المرغوب فيها بأسفل الآبار. وستسمح هذه التقنية للباحثين باستكشاف الآليات الجديدة، وهي التفاعلات بين المضيف والآفات.
